Name: Élucider le métabolisme du 2,4-dibromophénol chez les plantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:25:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Découvrez l'identification des métabolites du 2,4-dibromophénol chez les plantes par culture de cals végétaux. Cette méthode permet d'évaluer la dégradation métabolique des xénobiotiques tout en minimisant les interférences externes.

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Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (21976160) et le projet de recherche sur l’application des technologies de bien-être public de la province du Zhejiang (LGF21B070006).

1. Différenciation des callosités de la carotte
REMARQUE : Autoclaver tous les équipements utilisés ici et effectuer toutes les opérations dans un établi ultra-propre stérilisé aux UV.
<ol><li>Vernaliser les graines en immergeant les graines de carotte uniformes (Daucus carota var. sativus) dans de l’eau déminéralisée à 4 °C pendant 16 h.</li>
	<li>Stérilisez les graines vernalisées en surface avec de l’éthanol à 75 % pendant 20 minutes, puis rincez-les trois fois avec de l’eau déminéralisée stérile dans des conditions aseptiques.</li>
	<li>Stérilisez ensuite les graines avec 20 % de H2 O2 pendant 20 min et lavez-les six fois avec de l’eau déminéralisée stérilisée dans des conditions aseptiques.</li>
	<li>Faire germer les graines de manière aseptique en les semant sur un milieu MS sans hormones (pH 5,8, autoclavé à 121 °C pendant 20 min) contenant 1% d’agar-gel, et en incubant à 26 °C avec une photopériode de 16 h (350 μmol/m2s) pendant 15 jours.</li>
	<li>Obtenir les explants en coupant l’hypocotyle et le cotylédon des plantules en petits morceaux (0,5 cm).</li>
	<li>Transformer les explants en boîtes de Pétri (deux à quatre explants par boîte) contenant 15 à 20 mL de milieu MS aseptique complété par de l’auximone (acide 2,4-dichlorophénoxyacétique ; 1 mg/L) et de la phytokinine (6-benzylaminopurine ; 0,5 mg/L) dans des conditions aseptiques.</li>
	<li>Incuber les explants dans l’obscurité à 26 °C pendant 3-4 semaines pour induire le durillon.</li>
	<li>Séparez les tissus calleux (environ 1 cm de diamètre) formés à partir des explants initiaux à l’aide d’un scalpel stérile et d’une pince. REMARQUE : Les tissus calleux nouvellement formés sont de couleur blanche à jaune crème et s’attachent lâchement aux explants initiaux.</li>
</ol>2. Traitement au 2,4-dibromophénol
<ol><li>Dissoudre 1 μg de 2,4-dibromophénol dans 10 mL de milieu MS liquide aseptique (la concentration finale de 2,4-dibromophénol est de 100 ppb, pH 5,6-7,0).</li>
	<li>Ajouter 3 g de callosité de carotte fraîche (étape 1.8) dans des flacons en verre contenant la solution de 2,4-dibromophénol préparée (à partir de l’étape 2.1) dans des conditions aseptiques. Considérez cela comme le traitement au 2,4-dibromophénol. REMARQUE : Les flacons en verre ont été autoclavés et scellés à l’aide d’un film de paraffine.</li>
	<li>Inclure un milieu témoin contenant uniquement la solution de 2,4-dibromophénol (préparée à l’étape 2.1) pour évaluer la dégradation abiotique du 2,4-dibromophénol.</li>
	<li>Inclure un témoin vierge contenant uniquement le cal de la carotte (pas de solution de 2,4-dibromophénol) pour vérifier toute contamination potentielle.<ol><li>Préparer le témoin à blanc contenant la carotte en ajoutant 3 g de callosités de carottes fraîches récoltées seulement dans 10 mL de milieu MS stérile.</li>
	</ol></li>
	<li>Incuber le traitement au 2,4-dibromophénol et les témoins à milieu et à blanc à 130 tr/min et 26 °C dans l’obscurité dans un incubateur pendant 120 h.</li>
	<li>Retirer les flacons en verre de l’incubateur pour prélever les échantillons du traitement au 2,4-dibromophénol et des contrôles après 120 h d’incubation. REMARQUE : Tous les échantillons ont été préparés en trois exemplaires.</li>
</ol>3. Préparation de l’échantillon
<ol><li>Séparez soigneusement le cal du milieu MS par filtration avec des filtres en fibre de verre (0,45 μm) pour le traitement au 2,4-dibromophénol et les témoins. Récupérez les callosités après les avoir lavées trois fois avec de l’eau ultra-pure.</li>
	<li>Lyophiliser le cal collecté avec de l’azote liquide, puis homogénéiser le cal collecté (0,2 g) avec un broyeur de tissus à haut débit à 70 Hz pendant 3 min.</li>
	<li>Augmenter le cal homogénéisé en ajoutant 50 μL de substitut 4-n-NP-d4 à 25 mg/L à l’aide d’une microseringue en verre, puis en faisant tourner le vortex pendant 1 min.</li>
	<li>Ponifier les échantillons avec 5 mL de méthanol/eau (1 :1, v/v) dans un ultrasonicateur (150 W, 40 kHz) rempli d’eau glacée pendant 30 min, pour en extraire le 2,4-dibromophénol et les métabolites.</li>
	<li>Centrifuger les suspensions à 8 000 x g à 4 °C pendant 10 min et recueillir les surnageants par pipetage.<ol><li>Répétez trois fois les processus d’extraction de l’échantillon de callosité et combinez les extraits.</li>
	</ol></li>
	<li>Faire passer les extraits dans des cartouches d’extraction en phase solide équilibrée lipophile (HLB SPE) avec un débit de 1 mL/min. REMARQUE : Les cartouches HLB SPE ont été prétraitées séquentiellement avec 6 mL de méthanol et 6 mL d’eau pour éliminer toute interférence.</li>
	<li>Éluer les analytes en faisant passer 6 mL de méthanol à travers les cartouches HLB SPE. Ensuite, concentrer les éluants obtenus à 1 mL sous un léger jet d’azote gazeux pour l’analyse instrumentale.</li>
	<li>Injecter 10 μL d’éluants résultants dans l’UPLC-Q-TOF-MS pour l’analyse du 2,4-dibromophénol et de leurs métabolites15.<ol><li>Filtrer tous les échantillons à l’aide d’une membrane en nylon de 0,22 μm avant l’analyse instrumentale.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analyse instrumentale
NOTE : Les analyses du 2,4-dibromophénol et de leurs métabolites ont été réalisées sur un chromatographe liquide à ultra-performance (UPLC) en combinaison avec un spectromètre de masse micrOTOF-QII équipé d’une ionisation par électropulvérisation (ESI), fonctionnant en mode d’ions positifs et négatifs.
<ol><li>Ouvrez la porte de la colonne chauffante et installez la colonne UPLC en connectant l’entrée de la colonne à la vanne d’injection et la sortie de la colonne à l’entrée du spectromètre de masse. NOTE : Une colonne C18 (50 mm x 2,1 mm ; granulométrie de 1,7 μm) a été utilisée pour la séparation des analytes à 40 °C.</li>
	<li>Connectez la phase mobile A (eau ultra-pure) et la phase mobile B (méthanol de qualité chromatographique) à l’instrument en insérant l’extrémité des tubes de solvant A et B dans les bouteilles de solvant correspondantes, respectivement.<ol><li>Filtrer toutes les phases mobiles (500 ml pour chacune) à travers un filtre de 0,22 μm et soniser pendant plus de 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Dans la fenêtre du logiciel, cliquez sur Instrument | Méthode d’entrée pour modifier les conditions du chromatogramme en phase liquide.<ol><li>Régler les conditions de gradient de la phase mobile B comme suit : un débit de 1,0 mL/min ; 0 à 0,5 min, 5 % ; 0,5 à 3,5 min, 5 % à 50 % ; 3,5 à 6,5 min, 50 % à 100 % ; 6,5 à 7 min, 100 % ; 7 à 10 min, 100 % à 5 %.</li>
		<li>Réglez le débit d’injection des échantillons dans l’UPLC-Q-TOF-MS sur 0,2 mL/min. REMARQUE : L’injection de l’échantillon est programmée à l’aide d’un échantillonneur entièrement automatique.</li>
	</ol></li>
	<li>Dans la fenêtre du logiciel, sélectionnez Méthode MS puis paramétrez les paramètres de Q-TOF-MS : un débit de gaz desséchant (N2) de 8 L/min, une température de 300-350 °C ; une tension capillaire de 4 500 V ; une énergie de collision de 5 à 45 V ; et une plage de balayage complète de 40 à 800 Da.</li>
	<li>Placez les flacons d’échantillons aux emplacements correspondants des plateaux d’échantillons par numéro de série et réinsérez les plateaux d’échantillons dans la chambre d’échantillonnage. REMARQUE : Gardez les plateaux d’échantillons à plat et assurez-vous que la porte de la chambre d’échantillon est fermée.</li>
	<li>Dans la fenêtre du logiciel, sélectionnez Fichier | Nouveau pour créer une base de données. Nommez la base de données.</li>
	<li>Chargez l’exemple de programme créé ci-dessus en sélectionnant Fichier MS | Fichier d’entrée | Injecter du volume.</li>
	<li>Enregistrez la base de données dans le dossier d’exemple du projet en cliquant sur Fichier | Sauvegarder.</li>
	<li>Sélectionnez Exécuter | Démarrez dans la fenêtre principale du logiciel, puis sélectionnez Acquérir des exemples de données et cliquez sur OK dans la fenêtre de la liste d’exemples de démarrage exécutée pour collecter les données. REMARQUE : Le chromatogramme en temps réel peut être visualisé en cliquant sur Chromatogramme | Mise à jour en temps réel pendant le processus d’acquisition des données.</li>
	<li>Traitez les données dans le logiciel en sélectionnant la ligne de données cible et en cliquant sur la fenêtre Chromatogramme pour afficher le chromatogramme MS Scan.</li>
	<li>Dans la fenêtre Chromatogramme , cliquez sur Affichage | TIC | ScanWaveDS | Ajouter une trace | OK pour obtenir les spectres de masse de balayage fille.</li>
	<li>Identifier les métabolites en comparant les chromatogrammes du traitement au 2,4-dibromophénol et des témoins.</li>
	<li>Élucider les métabolites candidats par le temps de rétention, la masse et les modèles de fragmentation16,17. NOTA : L’erreur de précision de masse entre les valeurs expérimentales de m/z des ions parents des métabolites candidats et leur m/z théorique correspondante doit être inférieure à 10 ppm.</li>
</ol>

<ol><li>Chakraborty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baseline+investigation+on+plasticizers%2C+bisphenol+A%2C+polycyclic+aromatic+hydrocarbons+and+heavy+metals+in+the+surface+soil+of+the+informal+electronic+waste+recycling+workshops+and+nearby+open+dumpsites+in+Indian+metropolitan+cities%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities.</a> Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).</li>
<li>Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence%2C+fate+and+environmental+risk+of+anionic+surfactants%2C+bisphenol+A%2C+perfluorinated+compounds+and+personal+care+products+in+sludge+stabilization+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments.</a> Science of the Total Environment. 711, 135048(2020).</li>
<li>Xu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+occurrence+of+bisphenol+A+and+thirteen+structural+analogs+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil.</a> Chemosphere. 277, 130232(2021).</li>
<li>Cai, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+nonylphenol+and+nonylphenol+monoethoxylate+in+soil+and+vegetables+from+vegetable+farms+in+the+Pearl+River+Delta%2C+South+China%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Environmental+Contamination+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China.</a> Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).</li>
<li>Wang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Migration+and+health+risks+of+nonylphenol+and+bisphenol+a+in+soil-winter+wheat+systems+with+long-term+reclaimed+water+irrigation%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).</li>
<li>Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isomer-specific+approach+to+endocrine-disrupting+nonylphenol+in+infant+food%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).</li>
<li>Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pesticide+metabolism+in+plants+and+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Pesticide metabolism in plants and microorganisms.</a> Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).</li>
<li>Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+callus+cultures+to+elucidate+the+metabolism+of+tebuconazole%2C+flurtamone%2C+fenhexamid%2C+and+metalaxyl-M+in+Brassica+napus+L.%2C+Glycine+max+%28L.%29+Merr.%2C+Zea+mays+L.%2C+and+Triticum+aestivum+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).</li>
<li>Macherius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolization+of+the+bacteriostatic+agent+triclosan+in+edible+plants+and+its+consequences+for+plant+uptake+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment.</a> Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).</li>
<li>Sun, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+metabolism+of+nonylphenol+in+plants%3A+Isomer+selectivity+involved+with+direct+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation.</a> Environmental Pollution. 270, 116064(2021).</li>
<li>Schymanski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry%3A+communicating+confidence%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).</li>
<li>Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Household+dust+as+a+repository+of+chemical+accumulation%3A+new+insights+from+a+comprehensive+high-resolution+mass+spectrometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study.</a> Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).</li>
<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylated+PBDEs+and+brominated+phenolic+compounds+in+particulate+matters+emitted+during+recycling+of+waste+printed+circuit+boards+in+a+typical+e-waste+workshop+of+South+China%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China.</a> Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).</li>
<li>de Wit, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+brominated+flame+retardants+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">An overview of brominated flame retardants in the environment.</a> Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).</li>
<li>Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Uptake+and+Metabolism+of+e%2C4-Dibromophenol+in+Carrot%3A+In+Vitro+Enzymatic+Direct+Conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).</li>
<li>Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+framework+for+identifying+toxic+transformation+products+in+complex+environmental+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).</li>
<li>Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontarget+screening+with+high+resolution+mass+spectrometry+in+the+environment%3A+ready+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go.</a> Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).</li>
<li>Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplays+between+the+cell+wall+and+phytohormones+in+interaction+between+plants+and+necrotrophic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens.</a> Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+metabolic+pathways+of+2%2C4%2C6-tribromophenol+in+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants.</a> Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).</li>
<li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+of+tetrabromobisphenol+A+in+pumpkin%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin.</a> Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole a été développé pour identifier efficacement la biotransformation des xénobiotiques chez les plantes. L’étape critique de ce protocole est la culture du cal de la plante. La partie la plus difficile est la différenciation et le maintien du cal de la plante, car le cal de la plante est facilement infecté et développé en tissus végétaux. Par conséquent, il est important de s’assurer que tout l’équipement utilisé est autoclavé et que toutes les opérations sont effectuées dans des conditions aseptiques. La diffé...

Un nombre croissant de polluants organiques ont été rejetés dans l’environnement en raison des activités anthropiques 1,2, et le sol est considéré comme un puits important pour ces contaminants 3,4. Les contaminants présents dans le sol peuvent être absorbés par les plantes et potentiellement transférés à des organismes de niveau trophique supérieur le long des chaînes alimentaires, en pénétrant directement dans le corps humain par la consommation des cultures, ce qui entraîne une exposition involontaire 5,6. Les plantes utilisent différentes voies pour métaboliser les xénobiotiques à des fins de détoxification7 ; Il est important d’élucider le métabolisme des xénobiotiques, car ils contrôlent le devenir réel des contaminants dans les plantes. Comme les métabolites peuvent être excrétés par les feuilles (dans l’atmosphère) ou les racines, la détermination des métabolites dans les toutes premières phases de l’exposition offre donc la possibilité de tester un nombre étendu de métabolites8. Cependant, les études utilisant des plantes intactes nécessitent des expériences à long terme et des protocoles complexes de préparation d’échantillons qui peuvent être affectés par divers facteurs.
Les cultures de callosités végétales sont donc une bonne alternative pour étudier le métabolisme des xénobiotiques in planta, car elles peuvent réduire considérablement le temps de traitement. Ces cultures excluent les interférences microbiennes et la dégradation photochimique, simplifient l’effet matriciel des plantes intactes, standardisent les conditions de culture et nécessitent moins d’efforts expérimentaux. Les cultures de callosités végétales ont été appliquées avec succès comme approche alternative dans les études métaboliques du triclosan9, du nonylphénol10 et du tébuconazole8. Ces études ont montré que les schémas métaboliques dans les cultures de callosités étaient similaires à ceux des plantes intactes. Cette étude propose une méthode d’identification efficace et précise des métabolites des xénobiotiques chez les plantes sans protocoles complexes et chronophages. Ici, nous utilisons des cultures de callosités végétales en combinaison avec la spectrométrie de masse à haute résolution pour l’analyse des métabolites avec des signaux de faible intensité11,12.
À cette fin, des suspensions de callosités de carotte (Daucus carota var. sativus) ont été exposées à 100 μg/L de 2,4-dibromophénol pendant 120 h dans un agitateur à 130 tr/min et à 26 °C. Le 2,4-dibromophénol a été choisi en raison de son activité endocrinienne perturbatrice13 et de sa présence répandue dans le sol14. Les métabolites ont été extraits et analysés par spectrométrie de masse à haute résolution. Le protocole proposé ici permet d’étudier le métabolisme in planta d’autres types de composés organiques qui peuvent être ionisés.

<table><tbody><tr><td>Acide 2,4-dichlorophénoxyacétique</td><td>WAKO</td><td>1 mg/L</td><td></td></tr><tr><td>20 % H2O2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>10011218-500ML</td><td></td></tr><tr><td>4-n-NP, >99 %</td><td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-n-NP-d4</td><td>Pointe-Claire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-benzylaminopurine</td><td>WAKO</td><td>0,5 mg/L</td><td></td></tr><tr><td>75 % éthanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>1269101-500ML</td><td></td></tr><tr><td>7890A-5975&nbsp ; chromatographie en phase gazeuse</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQULTY ultra-performance&nbsp ; chromatographie liquide</td><td>Eaux Flacons</td><td></td><td></td></tr> en <tr><td>verre ambré</td><td>Eaux Incubateur</td><td></td><td></td></tr> climatique <tr><td>artificiel</td><td>Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD</td><td>RDN-1000A-4</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaves</td><td>STIK</td><td>MJ-Series</td><td></td></tr><tr><td>C18 colonne</td><td>ACQUITY UPLC BEH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DB-5MS Colonne capillaire</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dichlorométhane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40071190-4L</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilisateur</td><td>SCIENTZ&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Broyeur de tissus à haut débit</td><td>SCIENTZ&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre de masse MicrOTOF-QII</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système Milli-Q</td><td>Millipore</td><td>MS1922801-4L</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog medium</td><td>HOPEBIO</td><td>HB8469-7</td><td></td></tr><tr><td>N-hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H109658-4L</td><td></td></tr><tr><td>Instrument de soufflage d’azote&nbsp ;</td><td>Isomères AOSHENG</td><td>MD200-2</td><td></td></tr><tr><td>NP, >99 %</td><td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB cartouches</td><td>Waters</td><td>60 mg/3 mL</td><td></td></tr><tr><td>Research plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>100-1000 &micro ; L</td></tr><tr><td>Graines de carotte Little Finger (Daucus carota var. sativus)&nbsp ;</td><td>Shouguang Seed Industry Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secousses&nbsp ; Incubateurs</td><td>Shanghai bluepard instruments Co.,ltd.</td><td>THZ-98AB</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur en phase solide</td><td>AUTO SCIENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Échographe</td><td>ZKI</td><td>UC-6</td><td></td></tr><tr><td>Établi ultra-propre stérilisé aux UV</td><td>AIRTECH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Élucider le métabolisme du 2,4-dibromophénol chez les plantes

Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants

Les cultures peuvent être largement exposées aux polluants organiques, car le sol est un puits important pour les polluants rejetés dans l’environnement. Cela crée une exposition humaine potentielle par la consommation d’aliments polluants accumulés. L’élucidation de l’absorption et du métabolisme des xénobiotiques dans les cultures est essentielle pour l’évaluation du risque d’exposition alimentaire chez l’homme. Cependant, pour de telles expériences, l’utilisation de plantes intactes nécessite des expériences à long terme et des protocoles complexes de préparation d’échantillons qui peuvent être affectés par divers facteurs. Les cultures de callosités végétales combinées à la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) peuvent fournir une solution pour l’identification précise et rapide des métabolites des xénobiotiques dans les plantes, car elles peuvent éviter les interférences du microenvironnement microbien ou fongique, raccourcir la durée du traitement et simplifier l’effet de matrice des plantes intactes. Le 2,4-dibromophénol, un retardateur de flamme et un perturbateur endocrinien typique, a été choisi comme substance modèle en raison de sa présence répandue dans le sol et de son potentiel d’absorption par les plantes. Ici, des callosités végétales ont été générées à partir de graines d’asepsie et exposées à un milieu de culture stérile contenant du 2,4-dibromophénol. Les résultats ont montré que huit métabolites du 2,4-dibromophénol ont été identifiés dans les tissus calleux des plantes après 120 h d’incubation. Cela indique que le 2,4-dibromophénol a été rapidement métabolisé dans les tissus calleux des plantes. Ainsi, la plateforme de culture de callosités végétales est une méthode efficace pour évaluer l’absorption et le métabolisme des xénobiotiques chez les plantes.

Les étapes du protocole sont illustrées à la figure 1. En suivant le protocole, nous avons comparé le chromatogramme de l’extrait de callosité de carotte du traitement au 2,4-dibromophénol aux témoins, et avons trouvé huit pics distincts qui sont présents dans le traitement au 2,4-dibromophénol mais absents chez les témoins (Figure 2). Cela indique qu’un total de huit métabolites du 2,4-dibromophénol (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 et M187) ont été dét...

Le présent protocole décrit une méthode simple et efficace pour l’identification des métabolites du 2,4-dibromophénol chez les plantes.

Crops can be extensively exposed to organic pollutants, since soil is a major sink for pollutants discarded into the environment. This creates potential ...

La culture de callosités végétales fournit une solution pour l’évaluation précise, efficace et rapide de la dégradation métabolique des xénobiotiques chez les plantes. La culture de callosités végétales peut exclure les interférences du microbiome ou des champignons et la dégradation photochimique, simplifier l’effet de matrice des plantes intactes, normaliser les conditions de culture, raccourcir la durée du traitement et nécessiter moins d’efforts expérimentaux. La méthode proposée ici pourrait fournir un aperçu du comportement d’absorption et des mécanismes métaboliques de différents polluants organiques sur les cultures et être utile pour les efforts d’évaluation des risques environnementaux.Pour commencer, autoclavez tout le matériel et effectuez toutes les opérations dans un établi ultra propre stérilisé aux UV. Stérilisez la surface de la graine vernalisée avec de l’éthanol à 75 % pendant 20 minutes. Rincez-les trois fois avec de l’eau déminéralisée stérile et stérilisez-les à nouveau avec du peroxyde d’hydrogène à 20 % pendant 20 minutes.Après avoir lavé les graines six fois avec de l’eau déminéralisée stérilisée, faites-les germer de manière aseptique en les semant sur un

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La biomasse végétale est une grande neutralité carbone ressource renouvelable qui pourraient être utilisés pour la production de biocarburants. La biomasse végétale est principalement constitué de parois cellulaires, un matériau composite de structure complexe appelée lignocellulosiques. Nous décrivons ici un protocole pour une analyse complète du contenu et de la composition de la lignine polyphénolique.

Partie analyse complète de la composition des parois des cellules végétales (biomasse lignocellulosique) I: La lignine

Ce manuscrit décrit comment les taux de métabolisme des herbicides peuvent être quantifiés efficacement à l’aide de feuilles excisées d’une mauvaise herbe dicotylédones, réduisant ainsi la variabilité et éliminant tout effet confondant possible de l’absorption ou de la translocation de l’herbicide généralement observé dans les essais sur la plante entière.

Mesurer les taux de métabolisme dans l&#39;herbicide Mauvaises herbes dicotylédones avec un dosage excisés Feuille

Les polyesters lipidiques constituent les composants structurels de deux modifications de la paroi cellulaire, la cuticule végétale et les barrières de diffusion contenant de la subérine. Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode pour dépolymériser la cutine à partir de feuilles entières délipidées. La méthode peut être appliquée à l’étude de mutants compromis dans la biosynthèse de la cutine ou de la subérine.

Isolement et compositionnelle Analyse des plantes cuticules lipidiques polyester monomères

Les protocoles décrits dans le présent document facilitent l’étude pratique des réponses bactériennes de l’éthylène en utilisant l’acide 2-chloroéthylphosphonique (CEPA).  L’éthylène est produit in situ par la décomposition de CEPA dans un milieu de croissance bactérienne aqueux, ce qui permet de contourner l’exigence d’éthylène gazeux pur.

En utilisant le composé d&#39;éthylène de libération, l&#39;acide 2-chloroéthylphosphonique, comme un outil pour étudier la réponse de l&#39;éthylène chez les bactéries

Ce travail présente un protocole pour établir une culture de suspension cellulaire dérivée de feuilles de thé(Camellia sinensis L.) qui peut être utilisée pour étudier le métabolisme des composés externes qui peuvent être pris par l'ensemble de la plante, tels que les insecticides.

Étude sur le métabolisme de six insecticides systémiques dans une culture de suspension cellulaire nouvellement établie dérivée du thé (Camellia Sinensis L.) feuilles

Cette méthode utilise l’imagerie par spectrométrie de masse (MSI) pour comprendre les processus métaboliques des feuilles de S. alba exposées aux xénobiotiques. La méthode permet la localisation spatiale des composés d’intérêt et de leurs métabolites prédits dans des tissus spécifiques et intacts.

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La sécrétion d’exsudats racinaires est généralement une stratégie de désintoxication externe pour les plantes dans des conditions de stress. Ce protocole décrit comment évaluer l’impact des xénobiotiques sur la luzerne par analyse métabolomique non ciblée.

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Le protocole décrit une nouvelle méthode pour évaluer la cytotoxicité intégrale des métabolites des pesticides triazolés dans les plantes.

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Des plants de tabac ont été utilisés pour produire une cellulase fongique, TrCel5A, par l'intermédiaire d'un système d'expression transitoire. L'expression peut être contrôlée en utilisant une protéine de fusion fluorescente, et l'activité de la protéine a été caractérisée post-expression.

Expression de recombinant cellulase Cel5A de<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Dans les usines de tabac

Découvrez l'identification des métabolites du 2,4-dibromophénol chez les plantes par culture de cals végétaux. Cette méthode permet d'évaluer la dégradation métabolique des xénobiotiques tout en minimisant les interférences externes.

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