Vascularisation efficace des organoïdes rénaux par transplantation intracélomique dans des embryons de poulet

Les organoïdes rénaux cultivés in vitro restent immatures, ce qui limite leur applicabilité. Et cette méthode de transplantation intracœlomique induit la vascularisation et améliore la maturation des organoïdes. La procédure est très efficace, permettant la transplantation et l’analyse d’un grand nombre d’organoïdes en une seule expérience.

Après avoir préparé des organoïdes rénaux dérivés de HIPSC et incubé les œufs de leghorn fécondés, créez une fenêtre dans la coquille d’œuf le troisième jour d’incubation. Placez un petit morceau de ruban adhésif transparent sur l’extrémité pointue de l’œuf. Faites un petit trou dans la coquille d’œuf au milieu du ruban transparent en le tapotant avec l’extrémité tranchante d’une paire de ciseaux à dissectionner.

Ensuite, insérez une aiguille de calibre 19 sur une seringue de cinq millilitres dans le trou à un angle de 45 degrés. Aspirez deux à trois millilitres d’albumine de l’œuf pour abaisser l’embryon à l’intérieur de l’œuf. Dissimulez le trou avec un deuxième morceau de ruban adhésif transparent, puis placez un gros morceau de ruban adhésif transparent sur le crayon marqué vers le haut du côté de l’œuf.

Faites un trou dans la coquille d’œuf au milieu du ruban transparent en le tapotant avec l’extrémité tranchante d’une paire de ciseaux à dissectionner. Coupez une petite fenêtre circulaire dans la coquille d’œuf de ce trou à l’aide de ciseaux à dissection incurvés. Regardez à travers cette fenêtre pour localiser l’embryon.

Ensuite, agrandissez la fenêtre pour optimiser l’accès à l’embryon. Enlevez tous les gros morceaux de coquille d’œuf qui pourraient être tombés sur le dessus de l’embryon à l’aide d’une pince. Retirez les plus petits morceaux en plaçant quelques gouttes de DPBS avec du calcium et du magnésium sur l’embryon avec une pipette de transfert en plastique, puis en aspirant le DPBS avec la coquille d’œuf dans la pipette.

À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, ajouter trois gouttes de DPBS, complétées par 0,5% de pénicilline streptomycine à l’œuf. Scellez soigneusement la fenêtre avec un gros morceau de ruban adhésif transparent avant de remettre l’œuf dans l’incubateur jusqu’au quatrième jour d’incubation. Coupez le ruban de la fenêtre avec des ciseaux à dissection incurvés.

Placez l’œuf sous un microscope à dissection sur un support en caoutchouc ou une boîte d’œufs. L’embryon de poulet est maintenant aux étapes 23 à 24 de Hamburger-Hamilton et couché sur le côté gauche avec son côté droit face au spectateur. Localisez l’aile droite et le bourgeon de la jambe de l’embryon car le coelome sera évalué entre ces deux bourgeons de membres.

Dans la zone située entre l’aile droite et le bourgeon de la jambe, créez une ouverture consécutivement dans la membrane vitelline, le chorion et l’amnion en les tenant avec deux paires de pinces disséquantes et en les tirant doucement dans des directions opposées. Vérifiez s’il y a un accès dégagé à la cavité cœlomique. Saisissez doucement le bord de la paroi du corps entre le bourgeon de l’aile et du membre à l’aide d’une paire de pinces disséquantes et tirez-le légèrement vers le spectateur.

La cavité cœlomique doit être clairement visible. Insérez soigneusement un instrument émoussé mais mince dans la cavité coelomique. Placez un demi-organoïde à l’intérieur de l’œuf sur le dessus de l’allantoïde en utilisant un dissecteur de dure-mère.

À l’aide d’une pince disséquante, saisissez soigneusement le bord de la paroi du corps et tirez-le légèrement vers le spectateur pour rendre visible l’ouverture du coelum. Déplacez doucement l’organoïde vers et à travers l’ouverture de la paroi du corps dans le coelum avec un fil de tungstène émoussé et un porte-micro scalpel. Poussez légèrement l’organoïde crânienne pour le loger à l’intérieur du coelum.

Il est maintenant visible juste derrière le bourgeon de l’aile. Ajouter trois gouttes de DPBS à l’œuf à l’aide d’une pipette de transfert en plastique. Scellez soigneusement la fenêtre avec un gros morceau de ruban adhésif transparent avant de remettre l’œuf dans l’incubateur jusqu’au jour 12 de l’incubation.

Coupez le ruban de la fenêtre avec des ciseaux à dissection incurvés. Placez l’œuf sous un microscope à dissection dans un support en caoutchouc. Évaluez le système vasculaire et localisez les veines, qui se distinguent des artères par leur couleur rouge légèrement plus vive.

Pour améliorer l’accès au système vasculaire, agrandissez soigneusement la fenêtre en la coupant avec des ciseaux à dissection incurvés. Après avoir sélectionné la veine, insérez l’extrémité de l’aiguille microcapillaire dans la veine à un angle de zéro à 20 degrés. Assurez-vous que l’aiguille est dans la veine en déplaçant doucement l’embout d’un côté à l’autre.

Soufflez doucement et régulièrement dans le système d’injection pour injecter l’agglutinine culinaris du cristallin. Et replacez l’œuf dans l’incubateur pendant 10 minutes pour le laisser circuler. Placez l’œuf dans un support en caoutchouc sur le banc.

Ensuite, coupez à travers les membranes entourant l’embryon avec des ciseaux à dissection incurvés. Ramassez l’embryon de l’œuf avec une cuillère perforée et décapitaz immédiatement l’embryon à l’aide de ciseaux. Sous le microscope à dissection, placez le corps de l’embryon dans une boîte de Pétri.

Placez l’embryon sur son dos dans la boîte de Petri et écartez ses membres. Ouvrez soigneusement la paroi abdominale de l’embryon le long de l’axe longitudinal à l’aide d’une pince. Localisez l’organoïde à l’intérieur de l’embryon.

L’organoïde se fixe le plus souvent au lobe droit du foie, soit à l’extrémité du cabillaud ou crânien, juste en dessous de la cage thoracique. Il est donc conseillé de commencer par regarder ces endroits. Une fois l’organoïde localisé, retirez-le de l’embryon en le coupant autour avec des micro-ciseaux.

Placez l’organoïde dans le tissu de poulet qui y est inévitablement attaché dans une boîte de Petri sous le microscope à dissection. Enlevez autant de mouchoir en papier de poulet que possible à l’aide d’une lame de rasoir en acier inoxydable à double tranchant. Les images immunofluorescentes d’un organoïde rénal non transplanté et d’un organoïde rénal transplanté contiennent tous deux des structures glomérulaires et tubulaires.

Dans les organoïdes non transplantés, certaines cellules endothéliales humaines sont présentes. Dans l’organoïde transplanté, un réseau vasculaire perfusé est visible dans tout l’organoïde. Les images agrandies des zones en boîte montrent les trois types de cellules endothéliales qui peuvent être distinguées dans les organoïdes transplantés: cellules endothéliales humaines perfusées, cellules endothéliales humaines non perfusées et cellules endothéliales perfusées dérivées de poulet.

Dans les organoïdes non transplantés, les cellules endothéliales entourent les structures glomérulaires mais ne les envahissent pas. Cependant, chez les organoïdes transplantés, les structures glomérulaires sont vascularisées par des capillaires perfusés. Les organoïdes transplantés peuvent être analysés à l’aide de différentes techniques en fonction du but de l’expérience.

Une comparaison directe avec des témoins non transplantés peut donner un aperçu du processus de vascularisation et de maturation.