Name: Une procédure conforme aux BPF pour la génération de lymphocytes T génétiquement modifiés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Découvrez une méthode conforme aux BPF pour la transduction de lymphocytes T humains primaires. Cette technique économique permet de générer des thérapies cellulaires génétiquement modifiées, notamment des CAR-T.

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Cette recherche a été cofinancée par l’Union européenne et des fonds nationaux grecs par le biais du programme opérationnel Compétitivité, entrepreneuriat et innovation, dans le cadre de l’appel RECHERCHE - CRÉER - INNOVER (code de projet : T2EDK - 00474). Nous tenons également à exprimer notre gratitude à la Fondation Choose Life pour son soutien continu au laboratoire GMP « Dimitris Lois » de l’Institut de thérapie cellulaire.

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Université de Patras et le Comité d’examen institutionnel de l’Hôpital général universitaire de Patras. Avant d’obtenir des échantillons biologiques, le consentement éclairé a été obtenu auprès d’individus en bonne santé. L’évaluation de l’éligibilité des participants a été menée selon les procédures institutionnelles et conformément aux normes JACIE pour la leucaphérèse. Si ce protocole doit être mis en œuvre dans un cadre clinique ACT, toutes les procédures doivent respecter les directives des bonnes pratiques de fabrication (BPF) et être effectuées dans des salles blanches conformes aux BPF. Des précautions de sécurité spéciales sont nécessaires lorsque l’on travaille avec des vecteurs viraux, et ces procédures doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité dédiée. Dans cette étude, les procédures décrites ont été menées dans une hypoxystation HEPA H35 validée (voir le tableau des matériaux) pour assurer un environnement contrôlé et surveillé. La décontamination de tous les liquides dangereux doit être effectuée à l’aide d’une solution d’eau de Javel à 10 %.
1. Isolement des PBMC et activation des lymphocytes T (Jour 0)
<ol><li>Prélever les cellules du sac d’aphérèse du donneur (leukopaks, voir le tableau des matières) dans des tubes de 50 mL, selon le volume initial.</li>
	<li>Effectuer deux lavages du sac cellulaire en perfusant 15 mL de milieu hématopoïétique complet (+5 % HSA, milieu hématopoïétique commercial sans sérum, voir le tableau des matières).</li>
	<li>Effectuer une centrifugation à gradient de densité à base de polysaccharides à une dilution 1:2 (réactif :échantillon). Centrifuger à 800 x g pendant 30 min à température ambiante avec pauses (A/D, 9/0).</li>
	<li>À l’aide d’une micropipette, prélever les PBMC dans un tube propre de 50 ml.</li>
	<li>Lavez les cellules deux fois avec 1x PBS, en remplissant jusqu’à 50 mL pour chaque lavage (400 x g, 10 min, température ambiante). Remettre les cellules en suspension dans 5 mL de milieu complet.</li>
	<li>Comptez les cellules à l’aide du bleu trypan à l’aide d’un hémocytomètre standard ou d’un compteur de cellules automatisé (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Diluer les cellules avec un milieu complet pour obtenir une concentration de 2 x 106 cellules/mL.</li>
	<li>Activer 20 x 106 PBMC en ajoutant 10 μL de réactif de stimulation des lymphocytes T (voir le tableau des matériaux) par 2 x 106 cellules de départ. REMARQUE : Ce protocole est conçu pour l’activation de 20 x 106 PBMC, mais peut être ajusté pour un plus grand nombre de cellules si nécessaire.</li>
	<li>Ajouter rhIL-2 (20 U/mL) (voir le tableau des matériaux), mélanger doucement et transférer le mélange dans un récipient approprié (par exemple, une plaque à 6 puits).</li>
	<li>Incuber les cellules à 37 °C, 5% CO2 pendant 72 h.</li>
</ol>2. Transduction des lymphocytes T lentiviraux (jour 3)
<ol><li>Transférez la culture cellulaire dans un récipient approprié, tel qu’un tube conique de 50 ml. Bien mélanger et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à température ambiante (RT) pour éliminer le réactif d’activation. Jeter soigneusement le surnageant complètement et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu complet. REMARQUE : À ce stade, il est possible de décongeler le virus sur de la glace.</li>
	<li>Comptez les cellules en utilisant le bleu trypan.</li>
	<li>Remettre les cellules en suspension dans un milieu complet pour obtenir une concentration permettant de plaquer 0,5 x 106 cellules dans un volume total de 400 μL par puits dans une plaque de 24 puits. Ajouter rhIL-7 (155 U/mL) et rhIL-15 (290 U/mL) (voir le tableau des matériaux). REMARQUE : Assurez-vous de tenir compte du volume de virus à ajouter. Reportez-vous à l’étape 2.4.</li>
	<li>Dans un tube séparé, ajouter la vectofusine-1 (voir le tableau des matières) au milieu Opti-MEM à une concentration de 10 μg/mL, avec un volume égal au volume viral à utiliser. REMARQUE : Tenez compte du volume total de la culture cellulaire lors du calcul de la concentration de Vectofusine-1. Voir étape 2.3. Alternativement, la Vectofusine-1 GMP peut être utilisée comme réactif de qualité GMP.</li>
	<li>Combinez le virus concentré à une multiplicité d’infection (MOI) de 40 avec le mélange Vectofusine-1/Opti-MEM (rapport 1:1) et mélangez bien. Ajouter ce mélange à la culture cellulaire et ajuster le volume total à 400 μL par puits en utilisant un milieu complet, si nécessaire.</li>
	<li>Placez le couvercle sur la plaque, fermez-la avec un film de paraffine et centrifugez à 1000 x g pendant 2 h à 32 °C. Ensuite, incuber la plaque à 37 °C, 5 % de CO2 pendant la nuit.</li>
</ol>3. Élimination du virus et expansion des lymphocytes T (jour 4)
<ol><li>Prélevez les cellules et regroupez-les dans un récipient approprié, tel qu’un tube de 50 ml.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 400 x g à température ambiante (RT) pendant 5 min. Retirer soigneusement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu complet.</li>
	<li>Comptez les cellules en utilisant le bleu trypan. Remettre les cellules en suspension dans un milieu complet à une concentration de 1 x 106 cellules/mL. Ajouter rhIL-7 (155 U/mL) et rhIL-15 (290 U/mL) (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Transvaser les cellules dans un récipient approprié, tel qu’une fiole T25, à une concentration de 0,3-0,5 x 106 cellules/cm2 et les incuber à 37 °C, 5 % de CO2, pendant 2 jours. REMARQUE : Si une population cellulaire plus importante est nécessaire, les cellules peuvent être sous-cultivées (1:2) en présence de rhIL7 et rhIL-15 tous les 2 jours, en suivant les mêmes conditions d’incubation mentionnées ci-dessus, jusqu’à ce que le nombre de cellules souhaité soit atteint.</li>
</ol>4. Cryoconservation (Jour 14)
REMARQUE : De la glace sera nécessaire pour transférer les cryoviaux vers le lieu d’entreposage au cours de cette étape. Le moment de la cryoconservation dépend du nombre de cellules souhaité. Pour ce protocole, la cryoconservation est effectuée le jour 14 après avoir atteint une expansion de 25 fois.
<ol><li>Une fois le nombre de cellules désiré atteint, récoltez les cellules et transférez-les dans des tubes de 50 ml (ajustez le nombre de tubes en fonction du volume total).</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 400 x g à température ambiante (RT) pendant 5 min. Retirer soigneusement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 10 mL de milieu. Si nécessaire, regroupez les cellules de plusieurs tubes.</li>
	<li>Comptez les cellules en utilisant le bleu trypan. Conservez une aliquote de 1 x 106 cellules pour chaque test de contrôle de la qualité (voir la section 5) afin d’évaluer le nombre de copies vectorielles et l’efficacité de la transduction.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 400 x g pendant 10 min à RT. À ce stade, étiquetez les cryoflacons en conséquence.</li>
	<li>Retirer complètement le surnageant et remettre en suspension la pastille dans une solution de cryoconservation composée de 50 % de HSA et de 40 % de HBSS à une concentration de 1 x 107 cellules par mL par cryoflacon. Transférez la suspension cellulaire dans le nombre approprié de cryoflacons et ajoutez 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) à chaque cryoflacon.</li>
	<li>Placez les cryoflacons sur de la glace et transférez-les rapidement dans un congélateur à débit contrôlé pour la cryoconservation. Après la cryoconservation, transférez les cryoflacons dans un réservoir d’azote liquide surveillé pour un stockage à long terme.</li>
</ol>5. Contrôle de la qualité (Jour 14)
REMARQUE : Pour les tests de libération, le produit a subi plusieurs tests, notamment des tests de stérilité pour la croissance microbienne et une évaluation du niveau d’endotoxines. Ces tests ont été effectués dans des laboratoires certifiés de l’hôpital général universitaire de Patras et de l’université de Patras. La présence de mycoplasmes a été déterminée à l’interne à l’aide d’un test de détection biochimique et mesurée sur un luminomètre en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Le phénotype cellulaire (Figure 1) ainsi que le nombre et la viabilité des cellules ont été évalués en interne par cytométrie en flux (voir rubrique 5.1) et un compteur de cellules automatisé (voir Tableau des matériaux), respectivement. Les critères de rejet ont été établis en fonction des données publiées et des recommandations10,11 pour les produits cellulaires fabriqués selon les BPF (tableau 1).
<ol><li>Effectuer une coloration par cytométrie en flux avec efficacité de transduction (jour 14) REMARQUE : Une aliquote de 1 x 106 cellules sera colorée pour la viabilité (7-AAD) et le marqueur CD32 pour évaluer l’efficacité de la transduction (voir le tableau des matériaux). Si le gène d’intérêt, comme dans le cas des cellules CAR-T, doit être détecté, l’anticorps spécifique doit être d’une couleur différente de celle du marqueur CD3 et du 7-AAD pour éviter toute compensation. Des échantillons de contrôle appropriés doivent être pris en compte.<ol><li>Placez l’échantillon dans un tube FACS et ajoutez 500 μL de tampon FACS.</li>
		<li>Centrifuger le tube à 400 x g à RT pendant 5 min.</li>
		<li>Jeter complètement le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre la pastille en suspension dans une solution diluée 1:5 de tampon CD3 :FACS (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Vortex l’échantillon et incuber pendant 30 min sur de la glace dans le noir.</li>
		<li>Ajouter 500 μL de tampon FACS. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min (RT).</li>
		<li>Jeter complètement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans une solution diluée à 1:20 de tampon 7-AAD :FACS (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Vortex l’échantillon et incuber pendant 10 min sur de la glace dans le noir.</li>
		<li>Ajouter 200 μL de tampon FACS et analyser l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux (voir Tableau des matériaux).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li>
<li>Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra38(2013).</li>
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<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+remissions+following+chimeric+antigen+receptor+modified+T+cells+directed+against+CD19+%28CTL019%29+in+patients+with+relapsed+or+refractory+CD19%2B+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sustained remissions following chimeric antigen receptor modified T cells directed against CD19 (CTL019) in patients with relapsed or refractory CD19+ lymphomas.</a> Blood. 126 (23), 183(2015).</li>
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<li>Wang, X., Rivière, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+manufacturing+of+CAR+T+cells%3A+foundation+of+a+promising+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Clinical manufacturing of CAR T cells: foundation of a promising therapy.</a> Molecular Therapy - Oncolytics. 3, 16015(2016).</li>
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</ol>

N.S. a élaboré le protocole et rédigé le manuscrit qui a été révisé et supervisé par A.S. ; K.S., G.A. a effectué des expériences supplémentaires ; D.K., M.L. a apporté un soutien précieux dans les expériences et avec V.Z., N.T. dans le processus d’examen. N.T. est membre de ProtATonce Ltd. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Les vecteurs lentiviraux en tant que vecteurs d’administration de gènes sont des outils importants dans le domaine de la thérapie cellulaire et génique en raison de leur capacité à transduire à la fois des cellules diviseuses et non divisées12. Cependant, la production à grande échelle de vecteurs lentiviraux à l’aide de méthodes compatibles avec les BPF reste difficile en raison de divers paramètres, tels que les méthodes de transfection et les étapes de purification, qui peuvent entraîner une va...

L’émergence des thérapies cellulaires adoptives (ACT) et des cellules CAR-T à récepteur antigénique chimérique (CAR) a entraîné un changement révolutionnaire dans la pratique clinique moderne, établissant un nouveau paradigme de médecine personnalisée. En particulier, les cellules CAR-T ciblant CD19 ont démontré des réponses cliniques exceptionnelles et représentent la thérapie par cellules T la plus avancée pour les tumeurs malignes à cellules B 1,2,3,4,5. Cependant, les thérapies à base de lymphocytes T génétiquement modifiés actuellement commercialisées reposent fortement sur des vecteurs viraux pour le transfert de gènes. La mise en œuvre de vecteurs viraux dans l’ACT, en particulier dans des conditions de bonnes pratiques de fabrication (BPF) dans un cadre universitaire, présente des défis importants en raison des limites d’évolutivité, des exigences en matière d’équipement spécialisé, du besoin de personnel hautement qualifié et de l’utilisation de réactifs conformes aux BPF pour la production de particules virales médiées par des plasmides 6,7,8.
Par conséquent, le processus de fabrication des thérapies à base de lymphocytes T génétiquement modifiés est complexe et commence généralement par l’isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir d’un produit de leucaphérèse. Les lymphocytes T sont souvent enrichis à partir du pool PBMC et activés à l’aide de micro-complexes anti-CD3/CD28 7,9. Par la suite, les lymphocytes T sont génétiquement modifiés avec des vecteurs viraux ou non viraux, qui peuvent être produits in situ ou externalisés. Pour atteindre le nombre de cellules requis pour la perfusion, les cellules génétiquement modifiées sont développées avant la formulation finale et/ou la cryoconservation. Enfin, le produit cellulaire doit satisfaire à divers critères de libération basés sur plusieurs tests de contrôle de la qualité9.
Ce protocole présente une méthodologie complète utilisant des techniques simples pour la manipulation ex vivo de PBMC sains afin de fabriquer un produit de lymphocytes T génétiquement modifiés dans des conditions conformes aux BPF. Le protocole comprend l’utilisation d’un vecteur lentiviral, qui peut être sous-traité à une société de production virale fournissant tous les tests quantitatifs/fonctionnels, de pureté et d’innocuité nécessaires (p. ex., titre viral, détection du lentivirus compétent pour la réplication de l’ADN de la cellule hôte). Pour cette étude, le vecteur utilisé est un vecteur lentiviral de deuxième génération basé sur VSV-g (Vésiculeuse Stomatitis Virus G Protein) avec la protéine fluorescente verte (GFP), comme gène d’intérêt, en expression constitutive.

<table><tbody><tr><td>Plaque traitée TC 24 puits</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>tube FACS de 5 mL</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Greiner biomedica</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6 puits TC plaque traitée</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS CANTO II</td><td>BD Biosciences</td><td>V96300084</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applichem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules&nbsp ;</td><td>Corning Cell Cytosmart</td><td>J21E0081</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Greiner biomedica</td><td>122263</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate salin tamponné (D-PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Tampon FACS (1x D-PBS, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software v10.6.2&nbsp ;</td><td>TreeStar</td> <td>Inc-Gibco</td><td></td></tr> <tr><td>CTS Opti-MEM I Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4124801</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-15</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-114</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-146</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-7</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-111</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' s Solution saline équilibrée (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>HEPA Whitley H35 Hypoxystation</td><td>Don Whitley Scientific</td><td>HA0315172H</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique humaine (HSA)</td><td>Baxter</td><td>B05AA01</td><td></td></tr><tr><td>Junior LB 9509 Luminomètre portable</td><td>Berthold Technologies</td><td>6506</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X Provirus Quantitation Kit</td><td>Takara Bio</td><td>631239</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP Lymphocyte T TransAct</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-156</td><td></td></tr><tr><td>Souris Anti-Humain&nbsp ; CD3 (Clone : UCHT-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>557706</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Plus Kit de détection</td><td>Lonza Bioscience</td><td>LT07-703</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm film de fermeture ultra-extensible 5 cm x 75 m</td><td>D.Dutscher</td><td>90261</td><td></td></tr><tr><td>PeriStem PS-650-DB (sac d’aphérèse)</td><td>Biomed Device</td><td>SC00816</td><td></td></tr><tr><td>Raboteuse Kryo10 Series III</td><td>Planer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75 flacons</td><td>Greiner biomedica</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de trypan, solution à 0,4 %</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Vectofusin-1 GMP</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-165</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVOTM 15 Milieu cellulaire hématopoïétique sans sérum</td><td>Lonza Bioscience</td><td>A1048501</td><td></td></tr></tbody></table>

une procédure conforme aux bpf pour la génération de lymphocytes t génétiquement modifiés

A GMP-Compliant Procedure for the Generation of Gene-Modified T cells

Le domaine de la thérapie cellulaire adoptive (ACT) a été révolutionné par le développement de cellules génétiquement modifiées, en particulier les cellules CAR-T à récepteur antigénique chimérique (CAR). Ces cellules modifiées ont montré des réponses cliniques remarquables chez les patients atteints d’hémopathies malignes. Cependant, le coût élevé de la production de ces thérapies et de la réalisation d’évaluations approfondies du contrôle de la qualité a limité leur accessibilité à un plus large éventail de patients. Pour résoudre ce problème, de nombreuses institutions universitaires étudient la faisabilité de la fabrication interne de cellules génétiquement modifiées, tout en respectant les directives établies par les organismes de réglementation nationaux et internationaux.
La fabrication à grande échelle de produits à base de lymphocytes T génétiquement modifiés présente plusieurs défis, notamment en termes de capacités de production de l’institution et de nécessité de répondre aux exigences en matière de quantité de perfusion. L’un des principaux défis consiste à produire des vecteurs viraux à grande échelle selon les directives des bonnes pratiques de fabrication (BPF), qui sont souvent sous-traitées à des sociétés externes. De plus, la simplification du processus de transduction des lymphocytes T peut aider à minimiser la variabilité entre les lots de production, à réduire les coûts et à faciliter la formation du personnel. Dans cette étude, nous décrivons un processus simplifié de transduction lentivirale des lymphocytes T humains primaires avec un marqueur fluorescent comme gène d’intérêt. L’ensemble du processus respecte les normes conformes aux BPF et est mis en œuvre au sein de notre établissement d’enseignement.

Évaluation de l’efficacité de la transduction Les cellules transduites ont été évaluées pour l’expression du gène d’intérêt (GFP) à l’aide de la cytométrie en flux. Des résultats représentatifs sont illustrés à la figure 1. Au jour 14, plus de 95 % des cellules étaient CD3+, ce qui indique une activation et une expansion réussies des lymphocytes T. L’efficacité de la transduction dans la population CD3+ a été mesurée à 58,7 % (DT, <strong ...

Ce protocole décrit le processus de transduction des lymphocytes T humains primaires avec un gène d’intérêt, garantissant la compatibilité avec les normes des bonnes pratiques de fabrication (BPF).

Une procédure conforme aux BPF pour la génération de lymphocytes T génétiquement modifiés

The field of Adoptive Cell Therapy (ACT) has been revolutionized by the development of genetically modified cells, specifically Chimeric Antigen Receptor ...

Ce protocole décrit un processus simplifié et conforme au GNP de transduction de cellules T primaires humaines avec un gène d’intérêt. Cette technique particulière a été conçue pour être rentable et conforme au GNP sans l’utilisation de plates-formes de fabrication en système fermé coûteuses actuellement disponibles dans de nombreux centres universitaires. Cette méthode pourrait potentiellement être appliquée à la génération de thérapies cellulaires génétiquement modifiées, y compris, mais sans s’y limiter, les cellules CAR-T, qui ont constitué un changement de paradigme pour lutter contre les hémopathies malignes.Pour isoler la PBMC des cellules prélevées après leucaphérèse du sang du donneur, effectuer une centrifugation à gradient de densité à base de polysaccharides de l’échantillon, en maintenant un rapport réactif/échantillon de 1:2, en centrifugeant le mélange à 800 G pendant 30 minutes à température ambiante avec les freins desserrés. Ensuite, à l’aide d’une micropipette, prélevez les PBMC dans un tube propre de 50 millilitres. Laver les cellules deux fois avec du PBS par centrifugation.Avant de remettre en suspension les cellules lavées dans un milieu hématopoïétique compl

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Un rapide, protocole simple et rentable pour la génération de donateurs issus multivirus des CTL spécifiques (rctl) pour perfusion à allogéniques greffe de cellules souches hématopoïétiques (HSCT) à risque de développer des infections à CMV, Adv ou EBV. Ce processus de fabrication est conforme aux BPF et devrait assurer la plus large mise en œuvre des cellules T immunothérapie delà des centres spécialisés.

Génération de cellules T spécifiques Multivirus pour prévenir / traiter les infections virales, après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques

La vidéo décrit un processus de création de cellules CAR-T génétiquement modifiées par le biais du système CRISPR-Cas9. L’infection des lymphocytes T par des lentivirus CRISPR et CAR entraîne des modifications du gène cible et la synthèse d’un récepteur antigénique chimérique ou CAR, conduisant finalement à la formation de cellules CAR-T génétiquement modifiées.

Modification génétique des cellules CAR-T à l’aide d’un système CRISPR-Cas9

Cette vidéo présente un test permettant d’effectuer l’édition de gènes dans des cellules T humaines à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9. Un mélange de lymphocytes T CD4+ et CD8+ primaires est associé à un complexe ribonucléoprotéique CRISPR-Cas9, ciblant des gènes spécifiques pour l’inactivation. Lors de l’électroporation, l’ARNsg guide Cas9 vers la séquence d’ADN cible, créant ainsi des coupes précises. Ces coupures sont ensuite réparées par le mécanisme d'assemblage non homologue de la...

Une technique CRISPR-Cas9 pour l’édition de gènes dans les lymphocytes T

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Application clinique de<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Et artificielle cellules présentatrices d&#39;antigènes pour modifier génétiquement des cellules T du sang de cordon ombilical et périphériques

Les effets lymphodéplétifs et immunomodulateurs de la chimiothérapie et de la radiothérapie standard peuvent être exploités pour améliorer l’efficacité antitumorale de l’immunothérapie par lymphocytes T. Nous décrivons une méthode pour générer des lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) spécifiques de l’EGFRvIII et les administrer dans le contexte de la norme de soins du glioblastome.

Génération de la RCA cellules T pour la thérapie adoptive dans le contexte de glioblastome norme de diligence

Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour produire des récepteurs de cellules T spécifiques de l'antigène (TCR) par couplage du TCRa ou TCRβ d'un TCR existant, possédant l'antigène de la spécificité d'intérêt, avec hemichain complémentaire du répertoire des récepteurs des cellules T périphériques. Les TCR de novo générés conservent l' antigène de spécificité avec une affinité variable.

Générateur<em&gt; De Novo</em&gt; Spécifiques de l&#39;antigène T Human cellulaires Receptors par rétrovirale transduction de Centric Hemichain

Ici, nous présentons un protocole pour modifier génétiquement les cellules CAR-T via un système CRISPR/Cas9.

Utilisation de CRISPR/Cas9 pour éliminer gm-CSF dans les cellules CAR-T

Cet article détaille le processus de fabrication des lymphocytes T à récepteurs antigéniques chimériques à usage clinique, en particulier à l’aide d’un processeur cellulaire automatisé capable d’effectuer la transduction virale et la culture de lymphocytes T. Nous formulons des recommandations et décrivons les pièges à éviter qui doivent être pris en compte lors de l’élaboration du processus et de la mise en œuvre d’un essai clinique de phase précoce.

Fabrication de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique sur un processeur cellulaire automatisé

Ce protocole rationalise la production de vecteurs rétroviraux et la transduction des lymphocytes T murins, facilitant ainsi la génération efficace de cellules CAR-T chez la souris.

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Ce protocole fournit un flux de travail rationalisé pour générer et tester des cellules T régulatrices du récepteur antigénique chimérique humain (CAR Tregs).

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Ce protocole décrit une méthode évolutive pour l’expansion des produits de thérapies cellulaires adoptives (ACT), à savoir les cellules T du récepteur chimérique de l’antigène (CAR) et les cellules Killer induites par les cytokines (CIK), utilisant des dispositifs d’expansion rapide perméable aux gaz (G-Rex), démontrant une croissance efficace et robuste dans un contexte cliniquement pertinent.

Génération efficace et rapide de cellules tueuses induites par CAR-T et cytokines dans des dispositifs évolutifs GMP

Découvrez une méthode conforme aux BPF pour la transduction de lymphocytes T humains primaires. Cette technique économique permet de générer des thérapies cellulaires génétiquement modifiées, notamment des CAR-T.

Une procédure conforme aux BPF pour la génération de lymphocytes T génétiquement modifiés

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