Name: Ferritinophagie : évaluation de la dégradation sélective du fer par autophagie dans les fibroblastes humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Découvrez une technique d'immunofluorescence à haut débit pour évaluer la ferritinophagie dans les fibroblastes humains. Cette méthode permet une analyse quantitative de la dégradation lysosomale de la ferritine et aide à comprendre l'homéostasie du fer dans la BPAN.

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<ol><li>Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI+proteins%3A+Essential+PtdIns3P+effectors+at+the+nascent+autophagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome.</a> Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).</li>
<li>Proikas-Cezanne, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI-1%CE%B1+%28WIPI49%29%2C+a+member+of+the+novel+7-bladed+WIPI+protein+family%2C+is+aberrantly+expressed+in+human+cancer+and+is+linked+to+starvation-induced+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy.</a> Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).</li>
<li>Bakula, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI3+and+WIPI4+%CE%B2-propellers+are+scaffolds+for+LKB1-AMPK-TSC+signalling+circuits+in+the+control+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy.</a> Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).</li>
<li>Hayflick, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Propeller+protein-associated+neurodegeneration%3A+A+new+X-linked+dominant+disorder+with+brain+iron+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation.</a> Brain. 36, 1708-1717 (2013).</li>
<li>Wilson, J. A. -O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+clinical+management+guideline+for+beta-propeller+protein-associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Medicine+and+Child+Neurology%22%5BJournal%5D)">Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration.</a> Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).</li>
<li>Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+iron+metabolism+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular iron metabolism and regulation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).</li>
<li>Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+identifies+NCOA4+as+the+cargo+receptor+mediating+ferritinophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy.</a> Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).</li>
<li>Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+oxidation+and+proteasomal+degradation%3A+Protection+by+antioxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants.</a> Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).</li>
<li>Schüssele, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+profiling+in+single+cells+with+open+source+CellProfiler-based+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis.</a> Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).</li>
<li>Goodwin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-independent+lysosomal+targeting+regulated+by+ULK1%2F2-FIP200+and+ATG9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9.</a> Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).</li>
<li>Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCOA4-mediated+ferritinophagy%3A+A+potential+link+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).</li>
<li>Zachari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagy+of+mitochondria+on+a+ubiquitin-endoplasmic-reticulum+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform.</a> Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><lignées cellulaires fortes></fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fibroblastes humains primaires dérivés de la peau</td> ;<td>Biopsie cutanée, donneur humain sain, Biobank University Clinic T&uuml ; bingen, Approbation éthique 389/2019BO2</td><td>F-CO-60, passage 9</td><td></td></tr><tr><td><fort>Traitements de culture cellulaire</fort></td><td></td><td></td><td><fort>Concentration finale (composé)</fort></td></tr><tr><td>Milieu témoin</td><td>DMEM 10 %FCS(</td><td></td><td>DMSO uniquement)</td></tr><tr><td>Milieu témoin + bafilomycine A1</td><td>DMEM 10 % FCS</td><td></td><td>100 nM bafilomycine A1</td></tr><tr><td>Milieu témoin + déférasiox (DFX)</td><td>DMEM 10 %FCS</td><td></td><td>30 & micro ; M DFX</td></tr><tr><td>Support de contrôle + DFX + bafilomycineA1</td><td>DMEM 10 %FCS</td><td></td><td>30 & micro ; M DFX, 100 nM bafilomycine A1</td></tr><tr><td>Milieu témoin + citrate d’ammonium ferrique (FAC)</td><td>DMEM 10 % FCS</td><td></td><td>0,05 mg/mL</td></tr><tr><td>Milieu témoin FAC + FAC + bafilomycine A1</td><td>DMEM 10 % FCS</td><td></td><td>0,05 mg/mL FAC, 100 nM bafilomycine A1</td></tr><tr><td><fort>Matériel</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumine [BSA] Fraction V</td><td>AppliChem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 chèvre a-rabbit</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546 chèvre a-souris</td><td>Life Technologies</td><td>A-11003</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomycine A1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>196000</td><td></td></tr><tr><td>BioLite Cell Culture traitée Boîtes de 10cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td>A4099</td><td></td></tr><tr><td>Deferasiox (ICL-670)</td><td>Selleckchem</td><td>S1712</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp ;</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sans calcium ni magnésium</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Citrate d’ammonium ferrique (FAC)</td><td>Merck</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FERRITINE (rate humaine)</td><td>Rockland</td><td>200-401-090-0100</td><td></td></tr><tr><td>LAMP2 (H4B4)</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-18822</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x Dulbecco' s</td><td>AppliChem</td><td>A0965</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep (1,00U/mL de pénicilline, 100 mg/mL de streptomycine)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 %) avec rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>AppliChem</td><td>A4974</td><td></td></tr><tr><td>96 puits fond de verre #0 plaques</td><td>Cellvis</td><td>P96-0-N</td><td></td></tr><tr><td><fort>Solution</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,7 % de paraformaldéhyde (PFA)</td><td></td><td></td><td>PFA dissous dans du PBS, pH 7,5 ;</td></tr><tr><td>Bafilomycine A1 100 mM Stock</td><td></td><td></td><td>Bafilomycine A1 diluée dans</td></tr><tr><td>du DMSO Citrate d’ammonium ferrique (FAC) 100 mg/mL Stock</td><td></td><td></td><td>FAC dilué dans de l’eau double distillée autoclavée</td></tr><tr><td>PBS/T</td><td></td><td></td><td>PBS, complété par 10 % de Tween20&nbsp ;</td></tr><tr><td>PBS/T + BSA</td><td></td><td></td><td>PBS, complété par 10 % de Tween20, 1 % de BSA&nbsp ;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler 4.2.4</td><td>https://cellprofiler.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel Version 16.50</td><td>Microsoft Office Plus 365</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ferritinophagie : évaluation de la dégradation sélective du fer par autophagie dans les fibroblastes humains

Ferritinophagy: Assessing the Selective Degradation of Iron by Autophagy in Human Fibroblasts

Des fibroblastes primaires dérivés de la peau humaine (F-CO-60) provenant de donneurs sains (Figure 1A) ont été préparés pour des évaluations de la ferritinophagie à l’aide d’un traitement à la baflomycine A1, suivi d’une immunocoloration de la ferritine endogène et de la LAMP2, d’une analyse d’image automatisée et d’une analyse basée sur CellProfiler (Figure 1B).
La colocalisation de la ferritine endogène et de la LAMP2 a augmenté après que la dégradation lysosomale de la ferritine a été bloquée par l’ajout de bafilomycine A1, ce qui correspond à sa capacité à inhiber les enzymes lysosomales V-ATPase et, par conséquent, à bloquer la ferritinophagie7 (Figure 2). De plus, la reconnaissance logicielle des cellules, ainsi que la reconnaissance de la ferritine et de LAMP2, sont présentées à titre d’exemple (Figure 2).
À cet égard, il convient de noter que le pipeline CellProfiler décrit ici est extrêmement polyvalent et peut être adapté à des lectures supplémentaires et/ou alternatives, par exemple pour évaluer les effets de certaines mutations du BPAN sur la croissance cellulaire, les mitochondries ou d’autres organites dans le contexte de systèmes de marqueurs unicellulaires fonctionnels.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble de l’expérience. Représentation graphique de (A) le processus de ferritinophagie et (B) le flux de travail expérimental pour évaluer la ferritinophagie dans les fibroblastes humains primaires dérivés de la peau, comme décrit dans ce protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig02.jpg"> Figure 2 : Images représentatives. Des fibroblastes humains primaires dérivés de la peau dans un milieu témoin (nourri) en l’absence (A) ou (B) en présence de bafilomycine A1 ont été soumis à une analyse d’immunofluorescence indirecte à l’aide d’anticorps anti-ferritine et anti-LAMP2, tandis que les noyaux cellulaires ont été colorés avec du DAPI. Des images de fluorescence exemplaires acquises avec l’automatisation de la microscopie confocale à balayage laser sont présentées (barres d’échelle : 10 μm). Des changements dans l’abondance et la colocalisation de la ferritine et de LAMP2 ont pu être observés lors de l’inhibition lysosomale lors de l’administration de bafilomycine A1. L’analyse basée sur CellProfiler est également affichée, montrant les superpositions d’images dérivées du logiciel de la reconnaissance cellulaire (violet), des noyaux (bleu), de la ferritine (vert), de LAMP2 (rouge) et de la ferritine/LAMP2 (jaune) co-localisante. (C) Coupes d’image agrandies (barre d’échelle = 10 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Les paramètres de microscopie confocale à balayage laser utilisés dans cette étude. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Les paramètres numériques de CellProfiler utilisés dans cette étude. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%202.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Le pipeline CellProfiler utilisé dans cette étude. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 2 : Affichage du pipeline CellProfiler (voir Fichier supplémentaire 1) avec des captures d’écran prises dans un ordre consécutif (voir Tableau 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_.Supplemental%20FIle%202.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ferritinophagie : évaluation de la dégradation sélective du fer par autophagie dans les fibroblastes humains

Mutations in the autophagy gene WDR45/WIPI4 are the cause of beta-propeller-associated neurodegeneration (BPAN), a subtype of human diseases known as ...

ferritinophagy-assessing-selective-degradation-iron-autophagy-human

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