Name: Données probantes sur l’expression d’EpCAM et de cytokératine dans le sang et la moelle osseuse humains et murins normaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Découvrez une méthode reproductible d'isolement de cellules épithéliales par cytométrie en flux dans le sang et la moelle osseuse de souris Krt1-14;mTmG et d'humains sains. Cette technique permet des analyses en aval en biologie cellulaire et régénérative.

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Josh Monts, technicien en cytomètre en flux de l’installation centrale, The Hormel Institute
Todd Schuster, gestionnaire des installations principales, The Hormel Institute
Derek Gordon, statisticien, Université Rutgers
Nous tenons à remercier Karen Klein de Clarus Editorial Services, Santa Fe, NM pour son aide éditoriale.
Ce travail a été soutenu en partie par le National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution R21 AR075281, et une subvention d’aide à la recherche, à l’art et à l’érudition, Bureau du vice-président à la recherche, Université du Minnesota (proposition #324240). Nous remercions le Hormel Institute pour son soutien.

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Il n’y a pas de conflits d’intérêts connus.

Il existe des preuves dans la littérature de la présence de cellules épithéliales dans la moelle osseuse. Auparavant, les articles ont généralement étudié le rôle des cellules épithéliales dans le contexte de maladies et de blessures, telles que dans le foie, les poumons, le tractus gastro-intestinal (GI), le thymus et la peau14,15,16,17. Cependant, on ne sait pas grand-chose sur la présence de ces cellules épithéliales dans la moelle osseuse d’individus en bonne santé. Cet article cherche à établir une méthode reproductible, dans le but d’identifier et d’isoler les cellules épithéliales du sang normal et de la moelle osseuse. Cette méthode permettra d’identifier pourquoi les cellules épithéliales sont présentes et quel est leur rôle dans le sang et la moelle osseuse en l’absence de maladie; Peut-être que ces cellules font partie de l’entretien normal des tissus ou sont activées en cas de blessure. La moelle osseuse est un dépôt de cellules souches; Cependant, on ne sait pas quelle peut être la lignée de ces cellules épithéliales. Un article récent traite des cellules épithéliales dérivées de la moelle osseuse dans le thymus, qui expriment d’abord EpCAM et le marqueur hématopoïétique CD45, puis perdent leur expression de CD45 au fil du temps après une lésion15. Les recherches de notre laboratoire ont également confirmé la présence de cellules CD45+ EpCAM+ dans le sang sain et la moelle osseuse en l’absence de blessure12. Cependant, le rôle de ces cellules reste à déterminer.
Il était nécessaire de mettre au point une méthode reproductible pour examiner les cellules épithéliales dans la moelle osseuse saine. La méthode décrite aidera à caractériser davantage ces cellules dans leur état normal. Il y a des étapes importantes dans cette méthode pour maintenir la reproductibilité. L’une des étapes les plus critiques de ce protocole consiste à maintenir un environnement stérile dans le capot tout en prélevant la moelle osseuse de souris. En cas de prélèvement sur plusieurs souris, la contamination croisée entre les échantillons est évitée en utilisant de nouvelles aiguilles et seringues pour chaque souris. Cela garantit également que l’échantillon est propre et exempt de tout contaminant susceptible d’affecter les résultats. En outre, le nombre de seringues préparées et de tubes coniques marqués pour chaque souris supplémentaire doit être augmenté. Une autre étape importante consiste à rincer les os jusqu’à ce qu’une couleur blanche propre soit évidente pour s’assurer que la plupart des cellules de la moelle osseuse ont été enlevées; Les chances de détecter des cellules rares augmentent dans un échantillon plus pur. Une modification a été apportée pour optimiser le protocole de lyse des globules rouges; Plusieurs tampons de lyse ont été testés pour trouver le bon qui donnait une viabilité élevée et constante, car près de la moitié des cellules étaient perdues au cours de cette étape. Il peut être nécessaire d’optimiser différents réactifs et périodes d’incubation pour obtenir de meilleurs résultats dans d’autres contextes.
La limitation la plus importante de ce protocole est l’utilisation de la cytométrie en flux pour trouver des populations de cellules rares. Comme nous l’avons mentionné précédemment, l’ajout de contrôles et de comptes supplémentaires contribue à accroître la spécificité et l’exactitude de l’analyse. Une autre limite est que les marqueurs appropriés pour la population d’intérêt doivent être identifiés à l’avance. Ainsi, il faut connaître les marqueurs clés, les anticorps pour la cytométrie en flux et les anticorps compatibles avec les espèces cibles.
Ces méthodes constituent une amélioration par rapport aux méthodes existantes car elles permettent une analyse unicellulaire à une fraction du coût de l’isolateur automatique CTC existant et du séquençage de l’ARN unicellulaire. De plus, la cytométrie en flux est plus facilement disponible. FACS a maintenu une viabilité plus élevée pour les cellules par rapport aux résultats rapportés antérieurement en utilisant la séparation magnétique par microbilles. Enfin, ces techniques permettent la séparation des cellules pour les analyses en aval, telles que le séquençage de l’ARN en vrac, le séquençage de l’ARNc ou la culture cellulaire.

Les cellules épithéliales se trouvent dans les barrières physiques entre notre corps et l’environnement et sont capables de reconnaître et de répondre aux changements dans leur microenvironnement1. Ils ont une niche de cellules souches proliférante qui fournit un moyen de retourner de nouveaux tissus et de réparer les dommages2. Notre laboratoire étudie les cellules souches dans les follicules pileux de la peau; La peau est un bon modèle pour étudier la prolifération des tissus épithéliaux et des cellules souches, car elle est facilement visible et il y a un renouvellement constant des cellules. Les cancers épithéliaux sont la forme la plus courante de cancer, peut-être due aux tissus épithéliaux, tels que la peau, qui constituent la première ligne de défense contre les carcinogènes environnementaux, entraînant des taux de renouvellement élevés et la prolifération des cellules épithéliales3. La majeure partie de l’épiderme cutané, la couche protectrice supérieure, est composée de kératinocytes, qui expriment différents types de kératines pour fournir un soutien et une structure4. Les patients atteints de cancers épithéliaux ont souvent des cellules épithéliales présentes dans leur sang et leur moelle osseuse qui expriment également des kératines. Les biopsies liquides sont un moyen non invasif de détecter et de surveiller ces cellules épithéliales dans différents fluides corporels5. Les cellules épithéliales circulantes, également appelées cellules tumorales circulantes (CTC), se trouvent dans le sang périphérique et peuvent être des biomarqueurs du pronostic du cancer, ainsi que guider les traitements individualisés. Les CTC peuvent également indiquer la progression de la maladie, l’efficacité du traitement et la survie globaledes patients 5,6.
La molécule d’adhésion cellulaire épithéliale (EpCAM) est un marqueur cliniquement utilisé pour les CTC et peut identifier les tumeurs d’origine épithéliale chez les patients cancéreux. L’EpCAM joue un rôle dans l’adhésion, la migration, la signalisation, la prolifération et la différenciationcellulaires 6. Pour qu’une cellule épithéliale circulante soit classée comme CTC, elle doit être positive pour les cytokératines 8, 18 et 19, et négative pour CD45, un marqueur leucocytairecommun 6. Les CTC sont généralement identifiés en déplénant d’abord CD45 avec des microbilles magnétiques, puis en testant l’EpCAM et la cytokératine 19 par microscopie d’immunofluorescence7. La principale limite de la détection des CTC est leur rareté; Ils représentent moins de 0,01% de toutes les cellules dans le sang, et très peu survivent dans la circulation pour atteindre des organes distants 8,9,10. Il faut tenir compte de la conception d’expériences et de techniques permettant d’isoler et d’identifier ces cellules en raison de leur nature rare. Actuellement, il n’y a qu’un seul trieur automatisé à cellule unique approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) utilisé pour identifier les CTC, et il utilise EpCAM comme biomarqueur. D’autres méthodes incluent la séparation des billes magnétiques et la cytométrie en flux, ou une combinaison de ces méthodes. Il est nécessaire de mettre au point de nouvelles techniques plus sensibles et plus spécifiques pour la détection des CTC rares11.
La cytométrie de flux est une méthode privilégiée pour la détection de populations de cellules rares dans le sang, la moelle osseuse et d’autres échantillons de tissus. Ces cellules rares peuvent inclure les cellules souches, les cellules endothéliales circulantes, les CTC et les cellules pathologiques résiduelles. La cytométrie en flux permet des mesures quantitatives de chaque type de cellule et trie ces cellules pour des tests supplémentaires 7,9. Des comptages progressifs ont été effectués pour assurer une évaluation précise de ces cellules rares. La possibilité d’utiliser le contrôle pour exclure les cellules d’une analyse plus approfondie est un moyen d’accroître la spécificité lors de l’analyse des cellules. Les limites de la cytométrie en flux sont le temps requis pour l’analyse de grands échantillons et l’absence de confirmation visuelle de l’identité cellulaire. Pour surmonter cela, une microscopie d’immunofluorescence a été réalisée sur les cellules triées pour confirmer leur identité.
Auparavant, notre laboratoire a montré que chez la souris, les cellules de la moelle osseuse sont recrutées et contribuent aux tumeurs cutanées12. Ces cellules dérivées de la moelle osseuse sont positives pour la pancytokératine et la cytokératine épidermique. Pour mieux élucider le rôle des cellules souches épithéliales, des cellules dérivées de la moelle osseuse et des cellules exprimant la cytokératine dans la progression tumorale, des cellules EpCAM+ cytokératine positives dans des échantillons murins normaux et humains et de moelle osseuse ont été recherchés. Comme pour la plupart des expériences, cette méthode a été développée par de multiples itérations. Auparavant, des souris transgéniques étaient utilisées avec des numérations incrémentielles pour rechercher des cellules exprimant K14GFP dans la moelle osseuse12. Au fur et à mesure que davantage de cellules ont été comptées, une population représentative de cellules rares a pu être identifiée, comme le montre la figure 1 dans la section des résultats représentatifs. La justification de l’étude des cellules épithéliales dans le sang normal et la moelle osseuse était basée sur la littérature ancienne sur les CTC, où les donneurs sains normaux avaient des niveaux de fond de cellules EpCAM+13. Comme mentionné précédemment, la caractérisation de l’EpCAM commence souvent par l’épuisement de CD45. Cette étape a été omise parce que certaines cellules hématopoïétiques ont une expression d’EpCAM et de cytokératine pour des raisons inconnues qui doivent être étudiées plus avant. Par conséquent, les cellules ont été triées en fonction de la présence ou de l’absence d’EpCAM, quelle que soit la lignée cellulaire, puis immunocolorées pour la cytokératine. Le protocole ci-dessous et le flux de travail illustré à la figure 2 décrivent une technique qui utilise la cytométrie en flux avec compensation et contrôles, des méthodes statistiques et l’imagerie par immunofluorescence pour isoler et identifier ces populations rares de cellules épithéliales.

<table><tbody><tr><td>40 &mu ; m Passoire cellulaire</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>Utilisé pour filtrer les gros amas de cellules de la moelle osseuse</td></tr><tr><td>5 mL Polystyrène Tube à fond rond</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td>Tubes utilisés pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Pot de 500 mL avec couvercle</td><td>Nalgene</td><td>11-823-32</td><td>Utilisé pour laver la souris</td></tr><tr><td>190 proof Ethanol</td><td>Decon laboratories Inc</td><td>2801</td><td>Dilué à 70 % avec dH2O</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Chèvre anti-lapin IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Dilution : 1:1000</td></tr><tr><td>Brightline Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-10</td><td>Utilisé pour compter les cellules vivantes</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine Jackson</td><td>ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td>Composant du diluant d’anticorps</td></tr><tr><td>Sérum bovin fœtal caractérisé (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>Composant du tampon de coloration et de la solution de récolte</td></tr><tr><td>Éponges de gaze Curity</td><td>Covidien</td><td>2187</td><td>Utilisé pour garder une zone de travail propre lors du prélèvement des membres et de la moelle osseuse</td></tr><tr><td>Pince incurvée</td><td>Miltex</td><td>18-784</td><td>Utilisé pendant la récolte</td></tr><tr><td>Cytokératine, dépistage à large spectre</td><td>Dako</td><td>Z0622</td><td>Dilution 1:750 *Maintenant abandonné</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS 1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144 500mL</td><td>Utilisé pour arrêter la réaction de lyse des globules rouges</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td>Utilisé à 0,5 M&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sulfate de gentamicine</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td>Composant de la solution de récolte</td></tr> Solution <tr><td>saline équilibrée de Hank (HBSS 1x)</td><td>Gibco</td><td>14175-095 500mL</td><td>Composant de la solution de récolte et de la solution tampon de coloration</td></tr><tr><td>Seringue Luer-Lok tip 10 mL</td><td>Becton, Dickinson and Co</td><td>309604</td><td>Utilisé avec une aiguille 26G pour rincer les os, utilisé avec une aiguille 20G pour briser les grumeaux</td></tr><tr><td>Seau</td> <td>à glace Magic touch 2BelArt</td><td>M16807-2001</td><td>Utilisé pour stocker les échantillons sur glace</td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre</td><td>Apex</td><td>20-241</td><td>Composant du diluant d’anticorps</td></tr><tr><td>Sérum de cheval normal</td><td>Vecteur</td><td>ZE0122</td><td>Composant de l’anticorps Diluant</td></tr><tr><td>PE anti-humain CD 326 (EpCAM)</td><td>Biolegend</td><td>324206</td><td>Dilution : 5 &micro ; l sur 100 & micro ; l par 1x106 cellules</td></tr><tr><td>PE anti-souris CD 326 (EpCAM)</td><td>Biolegend</td><td>118205</td><td>Dilution : 3 &micro ; l sur 100 & micro ; l par 1x106 cellules</td></tr><tr><td>PE souris IgG2b, &kappa ; contrôle de l’isotype</td><td>Biolegend</td><td>400313</td><td>Dilution : 1 &micro ; l sur 100 & micro ; l par 1x106 cellules</td></tr><tr><td>PE rat anti-humain CD49f</td><td>BD Biosciences</td><td>555763</td><td>Dilution : 20 &micro ; l sur 100 & micro ; l par 1x106 cellules</td></tr><tr><td>PE rat IgG2am, &kappa ; Contrôle des isotypes</td><td>Biolegend</td><td>400508</td><td>Dilution : 1 & micro ; l sur 100 & micro ; l par 1 cellule < 10sup>6</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger coniques en polypropylène 50 mL</td><td>Basix</td><td>14-955-240</td><td>Utilisé dans la centrifugeuse</td></tr><tr><td>Gommage à la povidone et à l’iode</td><td>Aplicare</td><td>82-227</td><td>Antiseptique utilisé pour stériliser les souris</td></tr><tr><td>Aiguille PrecisionGlide 20G x 1 1/2 Becton</td><td>, Dickinson and Co</td><td>305176</td><td>aiguille 20G utilisée pour briser les amas de moelle osseuse</td></tr><tr><td>Aiguille PrecisionGlide 26G x 1/2</td><td>Becton, Dickinson and Co</td><td>305111</td><td>aiguille 26G utilisée pour rincer la moelle osseuse des os</td></tr><tr><td>Lames imprimées en PTFE</td><td>Services de microscopie électronique</td><td>63422-06</td><td>Lames à 8 puits triées pour l’immunofluorescence</td></tr><tr><td>Tampon de lyse RBC 10X</td><td>Invitrogen</td><td>00-4300-54</td><td>Dilution 1:10 à l’aide d’eau déminéralisée stérile</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Roboz</td><td>RS-6762</td><td>Utilisé pendant la récolte</td></tr><tr><td>Lame chirurgicale en acier inoxydable #4</td><td>Bard-Parker</td><td>371222</td><td>Utilisée pendant</td></tr><tr><td>la récolte Plateau stérile</td><td>Polar ware</td><td>10F</td><td>Utilisé pendant la récolte</td></tr><tr><td>StretchEase Gants d’examen en nitrile non poudrés</td><td>Denville Scientific</td><td>G4161</td><td>Utilisé pendant la récolte</td></tr><tr><td>Manche de scalpel chirurgical #4</td><td>Fischer</td><td>12-000-164</td><td>Utilisé avec la lame chirurgicale</td></tr><tr><td>TBS 20x</td><td>Composant thermique</td><td></td><td>de TBST, utilisé chez 1X</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4 %)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Utilisé pour compter les cellules mortes. Filtré avec .45 & micro ; m</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-500mL</td><td>Composant de la pince à</td></tr><tr><td>épiler</td> TBST <td>Miltex</td><td>6-8</td><td>Utilisé pendant la récolte</td></tr><tr><td>Vectashield Vibrance Antifade Medium de montage avec DAPI</td><td>Vector</td><td>H-1800</td><td>Coloration nucléaire pour immunofluorescence</td></tr></tbody></table>

données probantes sur l’expression d’epcam et de cytokératine dans le sang et la moelle osseuse humains et murins normaux

Evidence for EpCAM and Cytokeratin Expressing Epithelial Cells in Normal Human and Murine Blood and Bone Marrow

Des cellules épithéliales ont été identifiées dans le sang et la moelle osseuse de patients atteints de cancer et d’autres maladies. Cependant, la présence de cellules épithéliales normales dans le sang et la moelle osseuse d’individus en bonne santé n’a pas encore été identifiée de manière cohérente. Présenté ici est une méthode reproductible pour isoler les cellules épithéliales du sang humain et murin sain et de la moelle osseuse (BM) en utilisant la cytométrie de flux et la microscopie d’immunofluorescence (IF). Les cellules épithéliales chez des individus sains ont d’abord été identifiées et isolées par cytométrie de flux à l’aide d’une molécule d’adhésion cellulaire épithéliale (EpCAM). Il a été confirmé que ces cellules EpCAM+ expriment de la kératine par microscopie d’immunofluorescence chez des souris transgéniques Krt1-14;mTmG. Les échantillons de sang humain contenaient 0,18 % ± 0,0004 cellules EpCAM+ (MEB ; n = 7 répétitions biologiques, 4 répétitions expérimentales). Dans la BM humaine, 3,53% ± 0,006 (MEB; n = 3 répétitions biologiques, 4 réplicats expérimentaux) de cellules mononucléaires étaient EpCAM+. Dans le sang de souris, les cellules EpCAM+ constituaient 0,45 % ± 0,0006 (MEB ; n = 2 réplicats biologiques, 4 réplicats expérimentaux), et chez la BM de souris, 5,17 % ± 0,001 (MEB ; n = 3 réplicats biologiques, 4 répétitions expérimentales) étaient des EpCAM+. Chez la souris, toutes les cellules EpCAM+ étaient immunoréactives à la pancytokératine, comme déterminé par microscopie IF. Les résultats ont été confirmés en utilisant des souris transgéniques Krt1-14;mTmG, avec un nombre faible (8,6 cellules GFP+ natives pour 106 cellules analysées; 0,085% des cellules viables), mais un nombre significatif (p < 0,0005) de cellules GFP+ présentes dans la BM murine normale, qui n’étaient pas le résultat du caractère aléatoire par rapport à plusieurs témoins négatifs. De plus, les cellules EpCAM+ dans le sang de souris étaient plus hétérogènes que les cellules CD45+ (0,58 % dans BM; 0,13 % dans le sang). Ces observations concluent que les cellules exprimant des protéines de cytokératine sont détectables de manière reproductible parmi les cellules mononucléaires du sang humain et murin et de la BM. Nous démontrons une méthode de prélèvement tissulaire, de cytométrie en flux et d’immunomarquage qui peut être utilisée pour identifier et déterminer la fonction de ces cellules épithéliales pancytokératine chez des individus en bonne santé.

En utilisant ces méthodes, des populations rares de cellules épithéliales dans le sang et la moelle osseuse d’humains et de souris normaux ont été visualisées. Avec les compensations et les contrôles appropriés tels que décrits, les résultats ont systématiquement montré que 4% à 5% des cellules dans la moelle osseuse murine étaient EpCAM+, quel que soit le nombre de cellules comptées, comme le montrent la figure 4 et la figure 5. Dans les échantillons de sang murin, moins de 0,5 % des cellules étaient EpCAM+, comme le montre la figure 6. Dans les échantillons de moelle osseuse humaine, 2 % à 5 % des cellules étaient EpCAM+, comme le montrent les figures 7 et 8. Bien que 2 % à 5 % soit une grande fourchette, les pourcentages au sein de chaque donneur individuel étaient cohérents à mesure que davantage de cellules étaient comptées. Dans les échantillons de sang humain, environ 0,3% des cellules étaient EpCAM+, comme le montre la figure 9. Nos échantillons témoins (pas de coloration, contrôle d’isotype et FMO) ont donné très peu de résultats EpCAM+ faussement positifs, comme le montrent la figure 4 et la figure 7. Les cellules des groupes EpCAM+ et EpCAM- qui ont été triées sur des lames ont montré une coloration positive pour la pan-cytokératine dans les échantillons EpCAM+, et étaient négatives pour la pan-cytokératine dans les échantillons EpCAM-, comme le montre la figure 10. Ces résultats indiquent que les expériences ont été conçues de manière appropriée et reproductibles.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig01.jpg"> Figure 1 : Souris transgéniques Krt14Cre;mTmG avec numération incrémentielle de la moelle osseuse. La moelle osseuse des souris Krt1-14;mTmG a été comptée progressivement. Les cellules GFP positives indiquent l’expression de la kératine 14 et ont été identifiées par cytométrie en flux. Comme plus de cellules de moelle osseuse ont été comptées, cette population de cellules positives à la kératine 14 était plus facilement identifiable. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig02.jpg"> Figure 2 : Flux de travail pour les cellules EpCAM+ et cytokératine+. La moelle osseuse et les cellules sanguines ont d’abord été triées à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour séparer les cellules EpCAM+ et EpCAM-. Ces cellules ont été triées dans deux tubes à essai différents, ainsi que sur deux lames différentes. Les cellules triées dans des tubes à essai ont été filées sur des lames à l’aide d’une cytocentrifugeuse. Les lames ont ensuite été colorées à l’aide d’un anticorps primaire pan-cytokératine, puis colorées avec un anticorps secondaire. Les lames ont été analysées par microscopie à fluorescence pour observer l’expression de la pancytokératine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig03.jpg"> Figure 3 : Logiciel d’analyse de cytométrie en flux. Lors de l’analyse des données de cytométrie en flux à l’aide d’un logiciel d’analyse, le contrôle sans tache est utilisé pour sélectionner les cellules d’intérêt. Les cellules sont d’abord sélectionnées avec SSC-A et FSC-A, qui montrent la complexité interne et la taille des cellules. (A) Une porte polygonale est dessinée autour des cellules. (B) Les cellules individuelles sont acquises par contrôle SSC-A par SSC-W. (C) Les cellules vivantes sont acquises en comparant le FSC-A au DAPI. (D) Les cellules EpCAM négatives sont exclues en gisant à droite des cellules EpCAM négatives. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig04.jpg"> Figure 4 : Analyse cytométrique en flux de cellules EpCAM+ dans la moelle osseuse de souris. Les contrôles d’absence de tache, d’isotype et de FMO sont affichés dans le panneau supérieur, avec les comptes incrémentiels de 50 000, 100 000 et 500 000 cellules affichés dans le panneau inférieur. Ces graphiques visualisent la cohérence des pourcentages entre les nombres, malgré l’augmentation globale du nombre total de cellules comptées. Les panneaux de droite indiquent la stratégie de contrôle, telle que discutée précédemment dans la section analyse de cytométrie en flux et comme illustré à la figure 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig05.jpg"> Figure 5 : Les cellules EpCAM+ dans la moelle osseuse de souris représentent 5,17 % ± 0,001 % de la population. Les cellules de la moelle osseuse de trois souris individuelles ont été analysées. Les contrôles appropriés ont été inclus pour une rigueur scientifique appropriée. Le pourcentage de cellules positives est resté constant dans tous les échantillons, car les souris étaient génétiquement identiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig06.jpg"> Figure 6 : Les cellules EpCAM+ dans le sang de souris représentent 0,45 % ± 0,0006 % de la population. Les cellules sanguines de deux souris individuelles ont été analysées. Des contrôles ont été inclus pour montrer que la procédure appropriée a été suivie pour produire des résultats concluants. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig07.jpg"> Figure 7 : Analyse cytométrique en flux sur la moelle osseuse humaine EpCAM+. Les contrôles d’absence de tache, d’isotype et de FMO sont affichés dans le panneau supérieur, et les comptes incrémentiels de 50 000, 100 000 et 500 000 cellules sont affichés dans le panneau inférieur. Ces graphiques visualisent la cohérence des pourcentages entre les nombres, malgré l’augmentation globale du nombre total de cellules comptées. Les panneaux de droite indiquent la stratégie de contrôle, telle que discutée précédemment dans la section analyse de cytométrie en flux et comme illustré à la figure 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig08.jpg"> Figure 8 : Les cellules EpCAM+ dans la moelle osseuse humaine représentent 3,53 % ± 0,006 % de la population. Trois échantillons différents de moelle osseuse humaine ont été analysés. Des contrôles appropriés pour la rigueur scientifique ont été inclus. Le pourcentage de cellules positives varie en raison de l’hétérogénéité génétique chez l’homme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig09.jpg"> Figure 9 : Les cellules EpCAM+ du sang humain représentent 0,18 % ± 0,0004 % de la population. Trois échantillons de sang humain différents ont été analysés. Des contrôles appropriés pour la rigueur scientifique ont été inclus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig09large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig10.jpg"> Figure 10 : Immunofluorescence des lames EpCAM+ et EpCAM-. FACS a été utilisé pour séparer les cellules EpCAM+ et EpCAM-. La pan-cytokératine a été colorée pour l’utilisation de l’anticorps pancytokératine DAKO. Aucun contrôle d’anticorps primaire dans le sérum normal n’a été utilisé, car la pancytokératine est un anticorps polyclonal. Ces résultats confirment l’exactitude du FACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig10large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="3">Moelle osseuse humaine ou sang</td>
		</tr><tr><td>Anticorps</td>
			<td>Tube #</td>
			<td># de cellules</td>
			<td>AB Conc</td>
		</tr><tr><td>Non taché</td>
			<td>1</td>
			<td>1x106</td>
			<td>X</td>
		</tr><tr><td>DAPI uniquement</td>
			<td>2</td>
			<td>1x106</td>
			<td>1uL/mL</td>
		</tr><tr><td>Contrôle de l’isotype PE</td>
			<td>3</td>
			<td>1x106</td>
			<td>1 uL</td>
		</tr><tr><td>CD49f-PE Contrôle des taches simples</td>
			<td>4</td>
			<td>1x106</td>
			<td>20 uL dans 100uL par 1x106</td>
		</tr><tr><td>EpCAM-PE Low Titration</td>
			<td>5</td>
			<td>1x106</td>
			<td>3 uL dans 100uL par 1x106</td>
		</tr><tr><td>Titrage moyen EpCAM-PE</td>
			<td>6</td>
			<td>1x106</td>
			<td>4 uL dans 100uL par 1x106</td>
		</tr><tr><td>Titrage élevé EpCAM-PE</td>
			<td>7</td>
			<td>1x106</td>
			<td>5 uL dans 100uL par 1x106</td>
		</tr><tr><td>EpCAM-PE Tri élevé sur les diapositives</td>
			<td>8</td>
			<td>10x106</td>
			<td>50 uL dans 1 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Panneau de coloration par cytométrie en flux. Un exemple de panneau de coloration par cytométrie en flux pour les cellules mononucléaires du sang ou de la moelle osseuse. Les témoins inclus sont DAPI uniquement, contrôle non coloré et contrôle des taches uniques PE (PE-CD49f a été utilisé comme meilleur contrôle positif). La fluorescence moins un n’est pas incluse dans ce panneau car il ne s’agit que d’une seule couleur (PE). Lors de l’ajout de colorants fluorophores supplémentaires, tels que l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou l’allophycocyanine (APC), les FMO doivent être inclus en excluant un fluorophore pour chaque témoin FMO.
Fichier supplémentaire 1 : Comptage des cellules vivantes à l’aide d’un hématocytomètre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/Suppli-1_65118.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Cet article présente une méthode reproductible avec de nouvelles découvertes sur la présence de cellules épithéliales dans le sang et la moelle osseuse humains et souris normaux en utilisant la cytométrie en flux et la microscopie d’immunofluorescence. Des souris transgéniques Krt1-14;mTmG ont été utilisées comme méthode in vivo pour confirmer ces résultats.

Données probantes sur l’expression d’EpCAM et de cytokératine dans le sang et la moelle osseuse humains et murins normaux

Epithelial cells have been identified in the blood and bone marrow of patients with cancer and other diseases. However, the presence of normal epithelial ...

Cette technique démontre une méthode reproductible pour isoler les cellules épithéliales trouvées dans le sang et la moelle osseuse d’individus sains à utiliser pour une analyse ultérieure en aval. Cette technique permet d’isoler les cellules épithéliales à une fraction du coût de l’isolement automatique des cellules tumorales circulantes en raison de l’accessibilité de la cytométrie en flux. Cette méthode peut avoir des implications en biologie du développement et des cellules souches et en thérapies régénératives.Il peut également être utilisé pour étudier la cicatrisation des plaies et le maintien des tissus épithéliaux. Les os sont très petits et fragiles, alors manipulez-les avec soin pour éviter de casser ou de perdre les os. La moelle osseuse est relativement stable, vous pouvez donc travailler lentement et soigneusement pour assurer une bonne récolte.Pour commencer, placez la souris dans un récipient de 500 millilitres et ajoutez suffisamment d’iode pour couvrir la moitié de la souris. Secouez doucement et agitez le récipient pour assurer une couverture complète. Puis rincer à l’eau désionisée.Effectuez un autre lavage à l’iode, puis deux lavages avec de l’éthanol à 70%. Placez la souris dans un capot et posez-la sur le dos sur le plateau. Saisissez les pattes postérieures et écartez-les jusqu’à ce qu’un pop se fasse sentir.Faites une incision d’un centimètre sur la peau de la souris près de la région de l’aine. Insérez une paire de ciseaux fermée dans l’incision et ouvrez les ciseaux sous la peau pour la séparer du péritoine. Coupez la peau de la jambe autour de la cuisse, puis coupez la peau le long de la jambe pour exposer les muscles et les os.Avant de couper la patte postérieure, palper l’os de la hanche pour guider avec précision les ciseaux et éviter les coupures au fémur où se trouve la majeure partie de la moelle osseuse. Ensuite, retirez les pattes postérieures en coupant autour de l’articulation de la hanche sans couper à travers le fémur. Placez les membres dans un tube étiqueté membres.Ensuite, retirez les muscles, les tissus et la graisse le long de l’un des membres en coupant parallèlement à l’os à l’aide de ciseaux. Ensuite, utilisez un scalpel pour enlever soigneusement toute graisse ou muscle restant en effectuant un mouvement de grattage perpendiculaire à l’os. Après avoir nettoyé l’os correctement, séparez le fémur et le tibia au niveau du genou.Ensuite, utilisez un scalpel pour faire des coupures aux deux extrémités du fémur et du tibia où il n’y a pas de moelle osseuse visible. Insérez la seringue et l’aiguille pré-préparées dans l’os. S’il y a résistance, coupez l’extrémité de l’os jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de résistance.Tenez fermement l’os au-dessus du tube marqué de moelle osseuse et injectez la solution de prélèvement de la moelle osseuse dans l’os. Ensuite, rougir la moelle osseuse dans le tube. Répétez l’opération à l’autre extrémité de l’os pour recueillir le reste de la moelle osseuse jusqu’à ce que l’os apparaisse complètement blanc ou vide.À l’aide d’une seringue vide de 10 millilitres et d’une aiguille de 20 G, cassez les amas de moelle osseuse dans le tube en aspirant la moelle osseuse de haut en bas dans la seringue cinq à 10 fois. Ajoutez un filtre de 40 microns à un tube centrifuge propre de 50 millilitres et rincez-le avec un millilitre de solution de récolte de moelle osseuse. Filtrer la moelle osseuse à travers le filtre pour enlever les touffes restantes.Ensuite, étiquetez la moelle osseuse filtrée par tube. Conservez la moelle osseuse filtrée au réfrigérateur ou sur de la glace jusqu’à utilisation le jour même. Centrifuger les cellules de la moelle osseuse à 170G pendant 10 minutes à température ambiante.Passez l’aspirateur et jetez le surnageant. Re-suspendre les cellules dans 10 millilitres d’un x tampon de lyse des globules rouges et incuber pendant quatre minutes. Ajoutez ensuite 30 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco pour arrêter la réaction du tampon de lyse.Centrifuger les cellules pendant huit minutes à 170G à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 10 à 20 millilitres de tampon de coloration. Tout d’abord, divisez les cellules en tubes étiquetés individuellement en fonction du panneau de coloration utilisé, y compris les contrôles de compensation.Préparer des témoins non colorés et des isotopes pour bloquer les colorations non spécifiques. Pour chaque fluor quatre, ajoutez un seul contrôle de tache et ajoutez également des contrôles de fluorescence moins un en combinaison avec les quatre fluor restants. Ensuite, ajoutez des anticorps selon la dilution recommandée et mélangez bien en agitant le fond des tubes.Utilisez de préférence de l’EpCAM conjugué à la phycoérythrine pour visualiser de faibles populations de cellules. Incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Après l’incubation, amenez les tubes dans le BSL deux hottes et ajoutez un millilitre de tampon de coloration à chaque tube.Ensuite, centrifugez les tubes à 170G à quatre degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes. Après centrifugation, amener les tubes bouchés au capot BSL deux et aspirer le surnageant. Re-suspendez la pastille de cellule dans un millilitre de tampon de coloration et agitez le fond des tubes pour mélanger.Répétez le lavage et la centrifugation deux fois de plus. Enfin, re-suspendre le palais dans 500 microlitres de tampon de coloration avant cytométrie en flux. Ajoutez un DAPI ou un discriminateur de cellules mortes selon les recommandations du fabricant.En utilisant ce protocole, des populations rares de cellules épithéliales ont été visualisées dans la moelle osseuse de souris. Quatre à 5 % des cellules de la moelle osseuse murine étaient positives à l’EpCAM, quel que soit le nombre de cellules comptées. Dans les échantillons de moelle osseuse humaine, deux à 5% des cellules étaient positives à l’EpCAM.De plus, le pourcentage de cellules dans chaque donneur individuel était cohérent à mesure que davantage de cellules étaient comptées. Dans les échantillons de sang murin, moins de 0,5% des cellules étaient positives à l’EpCAM. Alors que dans les échantillons de sang humain, ce nombre était d’environ 0,3% des cellules.Les échantillons témoins ont montré très peu de cellules EpCAM faussement positives positives. De plus, les cellules triées dans le groupe positif à l’EpCAM ont montré une coloration pour la pancytokératine. Alors que ceux du groupe EpCAM négatif n’ont pas démontré le signal de cytokératine.Il est très important de maintenir un environnement propre et stérile. Cela permettra d’éviter toute contamination de l’échantillon. Il existe plusieurs applications en aval qui peuvent être utilisées sur les cellules épithéliales isolées pour déterminer leur fonction.Il s’agit notamment du séquençage de l’ARN, des expériences in vivo de culture cellulaire et de la microscopie par immunofluorescence.

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Biologie

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