Name: Isolement des cellules endothéliales de la veine saphène humaine et exposition à des niveaux contrôlés de contrainte de cisaillement et d’étirement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Apprenez à isoler des cellules endothéliales de veine saphène humaine et à les exposer à des contraintes de cisaillement et d'étirement contrôlées pour étudier les réponses mécaniques.

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Le segment de la veine saphène doit avoir été d’au moins 2 cm pour isoler avec succès les hSVEC. Les petits segments sont difficiles à manipuler et attachent les extrémités du vaisseau pour maintenir la solution de collagénase pour isoler les cellules. La surface luminale réduite ne produit pas suffisamment de cellules pour étendre la culture. Pour minimiser le risque de contamination par des non-CE, la manipulation du segment de la veine saphène doit être très douce pendant toute la procédure. Il est important d’être pr...

Le dysfonctionnement des cellules endothéliales (CE) est un acteur clé de l’échec de la greffe de veine saphène 1,2,3,4. L’augmentation soutenue de la contrainte de cisaillement et de l’étirement cyclique induit le phénotype pro-inflammatoire des cellules endothéliales de la veine saphène humaine (hSVEC)3,4,5,6. Les voies moléculaires sous-jacentes ne sont pas encore entièrement comprises, et les protocoles normalisés pour les études in vitro peuvent tirer parti des efforts pour de nouvelles connaissances dans le domaine. Ici, nous décrivons un protocole simple pour isoler, caractériser et étendre les hSVEC et comment les exposer à des niveaux variables de contrainte de cisaillement et d’étirement cyclique, imitant les conditions hémodynamiques veineuses et artérielles.
Les hSVEC sont isolés par incubation de collagénase et peuvent être utilisés jusqu’au passage 8. Ce protocole nécessite moins de manipulation du vaisseau par rapport aux autres protocoles disponibles7, ce qui réduit la contamination par les cellules musculaires lisses et les fibroblastes. D’autre part, il faut un segment de récipient plus grand d’au moins 2 cm pour avoir une extraction EC efficace. Dans la littérature, il a été rapporté que les CEs des grands navires peuvent également être obtenues par enlèvement mécanique 7,8. Bien qu’efficace, l’approche physique présente les inconvénients d’un faible rendement EC et d’une contamination plus élevée par les fibroblastes. Pour augmenter la pureté, des étapes supplémentaires sont nécessaires en utilisant des billes magnétiques ou le tri cellulaire, ce qui augmente le coût du protocole en raison de l’acquisition de billes et d’anticorps 7,8. La méthode enzymatique donne des résultats plus rapides et meilleurs en ce qui concerne la pureté et la viabilité de la CE 7,8.
Les CE les plus fréquemment utilisées pour étudier le dysfonctionnement endothélial sont les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). On sait que le phénotype EC change dans différents lits vasculaires, et il est essentiel de développer des méthodes qui représentent le vaisseau étudié 9,10. À cet égard, la mise en place d’un protocole permettant d’isoler une hSVEC et de la cultiver sous contrainte mécanique est un outil précieux pour comprendre l’apport du dysfonctionnement de l’hSVEC dans la maladie du greffon veineux.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsine-0,02 % EDTA solution</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>15 &micro ; lame I 0,4 Luer&nbsp ;</td><td>Ibidi</td><td>80176</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dilactate (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Station de chargement équibiaxial 6 puits de 25 mm&nbsp ;</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>LS-3000B25. VJW</td><td></td></tr><tr><td>Lame à 8 puits avec puits amovible</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154453</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique (glaciaire)</td><td>Millipore</td><td>100063</td><td></td></tr><tr>Feuille acrylique <td>Plexiglas</td><td></td><td></td>1<td>cm d’épaisseur</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD31</td><td>Abcam</td><td>ab24590</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31, Anticorps FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD3101</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-VE-cadhérine</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>2500</td><td></td></tr><tr><td>Plaques Bioflex collagène I</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>BF3001C</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>Suture de coton EP 3.5 15 x 45 cm</td><td>Brasuture</td><td>AP524</td><td></td></tr><tr><td>Primaire avant de cyclophiline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Custom conçu</td><td></td></tr><tr><td>Primaire inverse de cyclophiline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Conçu</td><td></td>sur mesure</tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 milieu basal</td><td>Lonza</td><td>CC3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuots suppléments</td><td>Lonza</td><td>CC4176</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2657-029</td><td></td></tr><tr><td>Système de tension Flexcell FX-5000</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>FX-5000T</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Milieu de montage aqueux</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de peau porcine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-Lapin IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Héparine sodique de la muqueuse intestinale porcine 5000 UI/mL</td><td>Blau Farmac&ecirc ; utica</td><td>SKU 68027</td><td></td></tr><tr><td>Système de pompe Ibidi (Pompe + Unité Fluidique)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td></td></tr><tr><td>KLF2 Primaire inversé</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Apprêt</td> inversé KLF2 conçu <td></td></tr><tr><td></td><td>sur mesure</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> Apprêt <td></td></tr><tr><td>avant KLF4</td><td>conçu</td><td></td>sur mesure <td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Apprêt inversé KLF4 conçu sur mesure</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> Analyseur d’oxyde nitrique NOA 280 conçu <td></td><td>sur mesure</td></tr><tr><td></td><td>Sievers Instruments</td><td>NOA-280i-1</td><td></td></tr><tr><td>NOS3 amorce avant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Amorce</td> inversée NOS3 conçue <td></td>sur mesure</tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> Paraformaldéhyde <td></td></tr><tr><td>(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Kit de perfusion 15 cm, ID 1,6 mm, rouge, réservoirs de 10 mL</td><td>Ibidi</td><td>10962</td><td></td></tr><tr><td>Phalloïdine - Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Phalloïdine - Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de</td> <td>potassiumSigma-Aldrich</td><td>221945</td><td></td></tr><tr><td>QuanTitec SYBR green PCR</td><td>kit Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12K flex platform&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4471087</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy micro kit&nbsp ;</td><td>Quiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Verre diapositive (24 mm x 60 mm)</td><td>Knittel</td><td>Verre VD12460Y1D.01</td><td></td></tr><tr><td>Nitrite de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31443</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Système de synthèse premier brin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18091200</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan bleu colorant 0.4 %</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type II de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des cellules endothéliales de la veine saphène humaine et exposition à des niveaux contrôlés de contrainte de cisaillement et d’étirement

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

Le pontage aortocoronarien (PAC) est une procédure de revascularisation du myocarde ischémique. La veine saphène reste utilisée comme conduit de pontage coronarien malgré la perméabilité réduite à long terme par rapport aux conduits artériels. L’augmentation brutale du stress hémodynamique associé à l’artérialisation du greffon entraîne des lésions vasculaires, en particulier de l’endothélium, qui peuvent influencer la faible perméabilité de la greffe de la veine saphène (SVG). Ici, nous décrivons l’isolement, la caractérisation et l’expansion des cellules endothéliales de la veine saphène humaine (hSVEC). Les cellules isolées par digestion de la collagénase présentent la morphologie typique des pavés et expriment les marqueurs cellulaires endothéliaux CD31 et VE-cadhérine. Pour évaluer l’influence des contraintes mécaniques, des protocoles ont été utilisés dans cette étude pour étudier les deux principaux stimuli physiques, la contrainte de cisaillement et l’étirement, sur les SVG artérialisés. Les hSVEC sont cultivés dans une chambre d’écoulement à plaques parallèles pour produire une contrainte de cisaillement, montrant un alignement dans la direction de l’écoulement et une expression accrue de KLF2, KLF4 et NOS3. Les hSVEC peuvent également être cultivés dans une membrane de silicium qui permet un étirement cellulaire contrôlé imitant l’étirement veineux (bas) et artériel (haut). Le diagramme F-actine des cellules endothéliales et la sécrétion d’oxyde nitrique (NO) sont modulés en conséquence par l’étirement artériel. En résumé, nous présentons une méthode détaillée pour isoler les hSVEC afin d’étudier l’influence du stress mécanique hémodynamique sur un phénotype endothélial.

En règle générale, les EC adhérentes peuvent être observées 3-4 jours après l’extraction. Les hSVEC forment initialement des amas de cellules et présentent une morphologie typique de « pavés » (Figure 1B). Ils expriment les marqueurs CE CD31 (figure 1C, D) et VE-cadhérine (figure 1D). Les hSVEC peuvent être facilement multipliés sur une boîte de culture cellulaire traitée non enrobée, et ils conservent le phénotype ...

Nous décrivons un protocole pour isoler et cultiver des cellules endothéliales de veine saphène humaine (hSVEC). Nous fournissons également des méthodes détaillées pour produire une contrainte de cisaillement et un étirement pour étudier la contrainte mécanique dans les hSVEC.

Isolement des cellules endothéliales de la veine saphène humaine et exposition à des niveaux contrôlés de contrainte de cisaillement et d’étirement

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

La veine saphène est soudainement exposée à des conditions artérielles après un pontage aortocoronarien. Comprendre sa réponse d’adaptation au stress mécanique peut aider à concevoir des outils thérapeutiques pour prévenir l’échec de la greffe veineuse. Ce protocole d’isolement des cellules endothéliales est très simple et ne nécessite qu’une incubation avec de la collagénase.Avec une manipulation minimale des vaisseaux, il en résulte une contamination réduite par les cellules musculaires lisses et les fibroblastes. Le protocole d’isolement des SVEC humaines et de leur culture sous contrainte de cisaillement et étirement cyclique est essentiel pour comprendre la contribution des forces mécaniques dans le dysfonctionnement des cellules endothéliales associé à la défaillance de la greffe de veine saphène. La culture cellulaire endothéliale préalable est très exigeante en termes de suppléments de milieux cellulaires.Il est obligatoire d’ajouter des facteurs de croissance pour réussir à isoler une culture, les SVEC humains. Pour isoler les cellules endothéliales de la veine saphène humaine primaire ou les SVEC humains, prélever au moins un segment de veine saphène de deux à trois centimètres de long. En travaillant sous une hotte laminaire stérile, transférer le segment veineux dans une boîte de Petri remplie de PBS préchauffé.Pour retirer tout le sang de l’intérieur de la lumière, insérez un embout de pipette attaché à une pipette et rempli de PBS dans une extrémité de la veine et rincez-le doucement. Rincez-le jusqu’à ce que le flux de lavage devienne complètement clair. Fermez ensuite une extrémité de la veine avec une suture de coton stérile.Remplissez soigneusement le récipient avec une solution de collagénase de type 2 milligramme par millilitre et fermez l’autre extrémité du récipient avec une suture en coton. Incuber le récipient avec une solution de collagénase dans une atmosphère humidifiée de 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, coupez une extrémité du récipient sur un tube de 15 millilitres pour recueillir la solution de collagénase avant de couper l’autre extrémité.Rincer la surface luminale avec un à deux millilitres de PBS pour recueillir toutes les cellules endothéliales détachées à l’intérieur du tube avec de la collagénase. Centrifuger le tube à 400G à température ambiante pendant cinq minutes. Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans trois à quatre millilitres de milieu cellulaire endothélial complet contenant une solution supplémentaire d’héparine.Plaquer les cellules dans une boîte de culture cellulaire de 60 millimètres pré-enrobée de gélatine à 3% de poids par volume. Incuber les cellules dans une atmosphère humidifiée pendant quatre jours sans changer le milieu. Après cela, changez le milieu tous les deux jours sans ajouter la supplémentation en héparine.Examinez la plaque au microscope pour vous assurer que les globules rouges ont été retirés. Après un à quatre jours après l’extraction, selon la taille et le diamètre du segment veineux, visualisez les SVEC humains par microscopie à contraste de phase pour évaluer le degré de confluence et leur morphologie pavée. Continuez à changer le média tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 70% à 80% de confluence.Enduire la lame de la chambre d’écoulement de gélatine à 0,1 % du poids par volume et incuber pendant au moins 30 minutes à 37 degrés Celsius. Pour équilibrer l’unité fluidique et l’ensemble de perfusion stérile ayant des réservoirs de 10 millimètres, incuber ceux-ci pendant la nuit dans une atmosphère humidifiée. Pour l’expérience de contrainte de cisaillement, ensemencer 200 000 cellules endothéliales en suspension dans 100 microlitres de milieu de culture dans la glissière de chambre d’écoulement recouverte de gélatine.Pour attacher les cellules à la surface de culture, incuber les cellules pendant quatre heures. Placez le jeu de perfusion sur l’unité fluidique. Remplissez les réservoirs et l’ensemble de perfusion avec environ 12 millilitres de milieu cellulaire endothélial complet préchauffé.Retirez les bulles d’air de l’ensemble de perfusion pour équilibrer le niveau des deux réservoirs à cinq millilitres. Placez l’unité fluidique sur le jeu de perfusion monté sans la glissière de chambre dans l’incubateur et connectez son câble électrique à la pompe régulée par ordinateur. En exécutant le protocole prédéfini dans le logiciel de contrôle de la pompe, éliminez toutes les bulles d’air des réservoirs et du jeu de perfusion.Prenez l’unité fluidique avec la perfusion montée fixée à la hotte à flux laminaire et fixez les lames ayant une monocouche de cellule de confluence. Après avoir placé l’ensemble de l’unité avec les glissières dans l’incubateur, connectez son câble électrique à la pompe. Dans le logiciel de contrôle de la pompe, réglez la configuration de l’unité fluidique en sélectionnant le type de glissière et en réglant la viscosité du fluide.Dans Paramètres d’écoulement, entrez la valeur de la contrainte de cisaillement et définissez la durée du cycle et le type d’écoulement. Cliquez ensuite sur le bouton de lecture pour démarrer l’expérience. N’oubliez pas de maintenir la lame avec des cellules traitées avec le même média sans exposition au débit que les témoins statiques.Appliquez un lubrifiant à base de silicone sur le dessus et les côtés de la station de chargement équibiaxiale à 6 puits de 25 millimètres. Ensemencer 400 000 cellules en suspension dans trois millilitres dans chaque puits des plaques de culture à fond flexible à 6 puits recouvertes d’un collagène. Incuber les cellules dans de l’air humidifié jusqu’à ce qu’elles atteignent 100% de confluence.Avant de commencer le protocole d’étirement, lavez les cellules une fois avec du PBS préchauffé et ajoutez trois millilitres de milieu de culture frais par puits. Insérez la plaque de base avec toutes les stations de chargement lubrifiées dans l’incubateur et connectez correctement le tube à l’équipement de contrôle du système de bioréacteur d’étirement de cellule de tension. Fixez chaque plaque de culture à un joint rouge fourni par le système de bioréacteur.Ensuite, placez-les dans la plaque de base de l’incubateur. Placez les quatre plaques de culture dans la plaque de base pour obtenir une charge de vide et d’étirement appropriée. Mettez sous tension le contrôleur et le système informatique.Ouvrez le logiciel de contrôle FlexCell et configurez le schéma souhaité, y compris le pourcentage d’allongement, la forme d’onde, la fréquence et le temps. Enregistrez le régime. Allumez le système d’aspiration, puis sélectionnez le régime et cliquez sur Démarrer sur l’écran de l’ordinateur pour exécuter l’étirement.Vérifiez que la membrane de silicone bouge et étire les cellules. Les cellules endothéliales adhérentes ont pu être observées 4 à 10 jours après l’extraction. Ils forment initialement des amas cellulaires présentant une morphologie pavée typique.Ils ont exprimé les marqueurs CE CD31 et VE-cadhérine. Les hSVEC, lorsqu’ils sont cultivés sous contrainte de cisaillement, sont alignés dans la direction de l’écoulement. La contrainte de cisaillement de 20 dynes par centimètre carré pendant 72 heures induit l’expression de gènes mécanosensibles typiques, KLF2, KLF4 et NOS3, indiquant l’efficacité du stimulus de cisaillement.Le résultat de l’étirement cyclique dépendait de l’intensité appliquée aux SVEC humains. Les cellules sous faible étirement ont montré un motif cortical F-actine similaire aux cellules statiques. Sans changement dans la libération d’oxyde nitrique jusqu’à 72 heures, nos niveaux artériels d’étirement ont remodelé le cytosquelette d’actine après 24 heures et diminué la libération de NO après 72 heures.Outre les études de stress mécanique, les chercheurs peuvent utiliser les cellules isolées pour effectuer diverses méthodes afin d’élargir les connaissances sur la fonction et le dysfonctionnement des cellules endothéliales. En suivant le protocole démontré, il est possible d’étudier tout autre type de cellules endothéliales sous contrainte de cisaillement et d’étirement.

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Cet article décrit tout d'abord une procédure pour isoler les cellules endothéliales humaines de veines ombilicales puis montre comment utiliser ces cellules pour examiner la transmigration des neutrophiles dans des conditions d'écoulement. En utilisant une chambre d'écoulement à faible volume faite d'un polymère avec des caractéristiques optiques de verre, des cellules vivantes d'imagerie de fluorescence de populations de cellules rares est également possible.

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Différents niveaux et modèles de cisaillement des fluides sont connus pour moduler l’expression des gènes endothéliaux, le phénotype et la susceptibilité aux maladies. Nous discutons de l’assemblage et de l’utilisation des « anneaux de cisaillement » : un modèle qui produit des modèles de contraintes de cisaillement unidirectionnels et périodiques. Les bagues de cisaillement sont simples à assembler, économiques et peuvent produire des rendements de cellules élevés.

L&#39;Assemblée et l&#39;application des «Shear Anneaux»: A Novel Endothelial Modèle pour Orbital, unidirectionnel et périodique Fluid débit et contrainte de cisaillement

Ici, un "workflow" pour la culture et la gène analyse de l’expression des cellules endothéliales sous la contrainte de cisaillement fluide est présenté. Inclus est un arrangement physique pour simultanément du logement et la surveillance des chambres de flux multiples dans un environnement contrôlé et l’utilisation d’un ARN exogène référence pour PCR quantitative.

Analyse de l’Expression génique des cellules endothéliales exposées au Stress à l’aide de plusieurs chambres à plaques parallèles flux de cisaillement

Le but de ce protocole est de décrire une chambre parallèle modifiée d'écoulement de plaque pour l'usage en étudiant l'activation en temps réel des canaux d'ion mechanosensitive par le stress de cisaillement.

Enregistrements électrophysiologiques de courants ioniques unicellulaires sous un stress bien défini

Ce protocole décrit une méthode de revêtement pour limiter la croissance des cellules endothéliales à une région spécifique d’une plaque de 6 puits pour l’application de contrainte de cisaillement à l’aide du modèle de shaker orbital.

Segmentation de la croissance des cellules endothéliales dans des plaques à 6 puits sur un agitateur orbital pour les études mécanobiologiques

Ici, nous établissons un protocole pour visualiser et analyser simultanément plusieurs complexes SMAD en utilisant le test de ligature de proximité (PLA) dans les cellules endothéliales exposées à des conditions pathologiques et physiologiques de stress de cisaillement des fluides.

Visualisation et quantification de la signalisation TGFβ/BMP/SMAD dans différentes conditions de contrainte de cisaillement du fluide à l’aide du test de proximité-ligature-assay

Ici, nous avons développé un modèle d’organe sur puce de cellules musculaires lisses de l’aorte humaine pour reproduire la souche biomécanique in vivo des cellules musculaires lisses dans la paroi aortique humaine.

Construction d’un modèle d’organe sur puce de cellules musculaires lisses de l’aorte humaine pour récapituler la contrainte biomécanique dans la paroi aortique

Il s’agit d’un flux de travail simple permettant de différencier les cellules endothéliales des cellules souches pluripotentes humaines, suivi d’un protocole détaillé pour leur stimulation mécanique. Cela permet d’étudier la mécanobiologie du développement des cellules endothéliales. Cette approche est compatible avec les dosages en aval de cellules vivantes prélevées sur la puce de culture après stimulation mécanique.

In vitro Modèle de vaisseau humain fœtal sur puce pour étudier la mécanobiologie du développement

Apprenez à isoler des cellules endothéliales de veine saphène humaine et à les exposer à des contraintes de cisaillement et d'étirement contrôlées pour étudier les réponses mécaniques.

Isolement des cellules endothéliales de la veine saphène humaine et exposition à des niveaux contrôlés de contrainte de cisaillement et d’étirement (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement des cellules endothéliales de la veine saphène humaine et exposition à des niveaux contrôlés de contrainte de cisaillement et d’étirement

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