Isolement, caractérisation et extraction totale de l’ADN pour identifier les champignons endophytes chez les plantes mycohétérotrophes

Les techniques présentées ici sont utiles pour étudier la communauté de champignons endophytes associée à différents organes végétaux. L’isolement des champignons endophytes permet leur identification, et est précieux dans d’autres techniques telles que la germination symbiotique. Pour commencer, préparez des boîtes de Pétri de milieu de culture PDA de huit à 10 centimètres complétées par trois millilitres par litre d’antibiotique.

Vérifiez la contamination en incubant les boîtes de Pétri du milieu de culture à 36 degrés Celsius pendant 24 heures avant utilisation. Le lendemain, désinfester superficiellement les fragments de plantes mychohétérotrophes saines à l’aide d’une procédure standard et les placer dans une boîte de Pétri stérile. Pour évaluer l’efficacité de la désinfestation superficielle des échantillons, inoculer quelques gouttes d’eau distillée utilisées lors du dernier lavage des échantillons sur PDA.

Ensuite, à l’aide d’un scalpel flammé et d’une pince, sectionnez les échantillons en morceaux de 0,2 centimètre d’épaisseur. Sectionnez les échantillons pour amplifier la surface à mettre en contact avec le milieu. Placez cinq fragments d’organes souterrains dans la plaque PDA supplémentée en antibiotiques aussi loin que possible les uns des autres sans toucher les bords de la boîte.

Scellez les boîtes de Pétri avec du film alimentaire et conservez-les à l’abri de la lumière entre 25 et 27 degrés Celsius pendant cinq jours. Un jour avant la sous-culture, préparez des boîtes de Pétri de cinq centimètres en utilisant cinq à sept grammes par litre de milieu AA et incubez les plaques à 36 degrés Celsius pendant 24 heures. Pour purifier les isolats fongiques, différenciez les colonies de plaques PDA par la couleur, le modèle de croissance, la texture et le format des marges.

Délimitez ensuite les marges de la colonie sur la face inférieure de la boîte. Identifiez également les colonies à l’aide d’un code. À l’aide de la pointe d’un cure-dent en bois autoclave, récupérez une infime quantité de mycélium sur les marges de la colonie fongique identifiée et striez la plaque AA, produisant trois stries à un centimètre les unes des autres et des bords de la boîte.

Étiquetez la plaque AA avec le code approprié à l’aide de papier autocollant et d’un crayon. Scellez les plaques avant de les incuber dans l’obscurité à 25 à 27 degrés Celsius pendant trois jours. Après l’incubation, observez méticuleusement les plaques pour identifier les hyphes fins formant des colonies individuelles.

Délimitez la zone des colonies individuelles à l’aide d’un marqueur permanent. Coupez une partie du milieu contenant la colonie à l’aide d’un cure-dent autoclavé et transférez le volume coupé au centre d’une nouvelle boîte de Petri PDA sans antibiotiques. Après avoir étiqueté les boîtes de Pétri avec les codes des isolats, scellez-les avec un film alimentaire et maintenez-les dans l’obscurité à 25 à 27 degrés Celsius pendant sept à 14 jours.

Pour commencer la conservation des isolats fongiques avec la méthode de Castellani, ajoutez 0,5 millilitre d’eau distillée dans le tube de microcentrifugation autoclavé de deux millilitres. À l’aide d’un cure-dent autoclave, découpez un milieu cuboïde de 0,5 par 0,5 centimètre dans les marges du mycélium d’isolats purifiés déjà cultivés. Placez quatre à six cuboïdes dans les tubes de la microcentrifugeuse avec de l’eau distillée.

Conservez les tubes dans l’obscurité à 25 degrés Celsius aussi longtemps que nécessaire. Si nécessaire, récupérez un parallélépipède et placez-le au centre d’une nouvelle boîte PDA pour faire pousser un isolat stocké. Commencez la méthode de montage par taquinage en plaçant une goutte d’une teinture Toluidine blue-O sur une lame de verre propre.

Différentes teintures peuvent être utilisées dans une telle technique. À l’aide d’un cure-dent autoclave, retirez soigneusement quelques hyphes de l’isolat cultivé et placez-les dans la goutte de tache. Placez une lamelle et analysez-la au microscope optique.

Pour la méthode de montage du ruban adhésif, placez une goutte d’une teinture bleue de coton lactophénol sur une lame de verre propre. Découpez une bande de ruban adhésif transparent d’une taille qui s’adapte bien à la lame de verre et à la goutte de tache centrale. Dirigez la surface collante de la bande adhésive vers la surface du mycélium et essayez de recueillir quelques hyphes sans en presser ou en collecter trop.

Collez ensuite le ruban adhésif sur la lame de verre, en vous assurant que la tache est en contact avec les hyphes collectés. Placez une goutte d’eau au-dessus du ruban et placez une lamelle avant d’analyser la lame au microscope optique. La croissance de petits groupes de mycélium champignon filamenteux émergeant de l’intérieur des fragments a été observée après cinq jours d’inoculation du fragment d’organe végétal mychohétérotrophe sur le milieu PDA.

Pendant sept à 14 jours d’inoculation de l’isolat purifié, la croissance centrifuge d’une colonie d’isolats fongiques purs a été observée sur PDA, formant un seul mycélium circulaire. D’éventuelles contaminations ont été facilement identifiées, compromettant l’homogénéité de la colonie en ce qui concerne son aspect de forme de croissance, sa couleur et sa production de pigments dans le milieu. Une colonie isolée des racines fusiformes de l’orchidée mychohétérotrophe, Wullschlaegelia aphylla, était opaque et ne contenait pas de pigments diffusibles ni d’exsudats dans le milieu.

La colonie était blanchâtre à grise sur la face supérieure et brunâtre sur la face inférieure. Les mycéliums étaient aériens et abondants, et les marges étaient irrégulières et aériennes. La colonie avait une texture veloutée et une topographie ridée sans structures macroscopiques.

Les structures qui n’étaient pas facilement visibles dans le mycélium non coloré ont été exposées après coloration du mycélium fongique avec du bleu de coton lactophénol et du bleu de Toluidine-O, facilitant leur identification. Les méthodes d’isolement fongique présentées ici peuvent également être appliquées aux plantes vertes pour identifier les endophytes fongiques. Les champignons isolés peuvent être utilisés dans des essais de germination symbiotique.