Enrichissement des vésicules extracellulaires natives et recombinantes de mycobactéries

L’enrichissement des VE mycobactériennes permet de délimiter leur contenu, de déchiffrer leurs factions et leurs dates, en concevant des moyens de construire et de générer des VE recombinantes qui exploitent principalement des candidats vaccins. Six séries sont générées à partir de différents endroits de la surface bactérienne. Ils n’ont pas de marqueurs conservés.

Par conséquent, toute approche basée sur l’affinité ne peut enrichir qu’un sous-ensemble des VE. En revanche, notre méthode capture toutes les mycobactéries VE générées. Mohd Ilyas, un doctorant de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Pour commencer, ajoutez un millilitre de bouillon de glycérol de type sauvage ou recombinant Mycobacterium smegmatis dans un tube à centrifuger de 50 millilitres contenant 10 millilitres de bouillon 7H9 préchauffé. Fermez le couvercle et faites tourner le tube avant d’incuber la culture pendant la nuit à 37 degrés Celsius entre 200 et 220 tr/min. Le lendemain, lorsque la densité optique à 600 nanomètres atteint environ un, centrifugez la culture à 3 200 G pendant 10 minutes à température ambiante et jetez le surnageant dans un récipient liquide.

Ajouter un millilitre de milieu de Sautons préchauffé et remettre doucement en suspension pour obtenir une suspension uniforme. Augmentez le volume à 10 millilitres à l’aide d’un média Sautons. Centrifugez à nouveau et jetez le surnageant.

Après le lavage, remettez les cellules bactériennes en suspension. dans 20 millilitres de milieux Sautons préchauffés et mesurez la densité optique à 600 nanomètres. Inoculer le volume requis de suspension bactérienne dans un erlenmeyer d’un à deux litres contenant 330 millilitres de milieu Sautons et incuber à 37 degrés Celsius à 200 tr/min jusqu’à ce que la densité optique atteigne 0,3.

Le lendemain, lavez les cellules une fois comme démontré précédemment et remettez la pastille en suspension dans 330 millilitres de Sautons contenant 1/10 Tween 80. Répartissez 50 millilitres de la suspension cellulaire dans six flacons d’un litre, contenant chacun 280 millilitres de Sautons préchauffés contenant 1/10 Tween 80. Incuber les cultures à 37 degrés Celsius à 200 tr/min jusqu’à ce que la densité optique atteigne deux à 2,5.

Ajoutez deux litres de cultures au stade exponentiel moyen à six bouteilles de 400 millilitres et centrifugez à 8 000 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Recueillir les flacons surnageants et pré-réfrigérés autoclavés ou les béchers et conserver une aliquote de la pastille pour les procédures analytiques. La pastille est colorée si les VE sont recombinantes pour mCherry et brunes si elles sont de type sauvage ou recombinantes pour les protéines non fluorescentes.

Filtrez le surnageant de culture à travers un filtre d’élimination de 0,45 micron, suivi d’une filtration à travers un filtre de 0,22 micron pour éliminer toute trace de bactéries. Ensuite, prélavez les concentrateurs à membrane de 30 kilodaltons avec 15 millilitres d’eau doublement distillée à 4 000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Laver ensuite avec 15 millilitres de Sautons froids pré-filtrés en utilisant les mêmes conditions pour éliminer toute trace de produits chimiques.

Après le lavage, ajoutez 15 millilitres de surnageant de culture filtré dans un concentrateur et concentrez à 4 000 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le concentré dans un tube à centrifuger Oak Ridge froid de 40 millilitres ou un tube à centrifuger Falcon frais de 50 millilitres. Une fois que les deux litres de filtrat de culture sont concentrés, transférez le concentré dans un tube à centrifuger en polypropylène de 50 millilitres doublement distillé, lavé et pré-refroidi et soumis à une centrifugation en deux étapes.

D’abord à 4 000 G, puis à 15 000 G.Transférez le concentré centrifugé dans un tube ultracentrifuge pré-refroidi de 38,5 millilitres et essorez-le à 100 000 G pendant quatre heures à quatre degrés Celsius. Recueillir le surnageant dans un tube à centrifuger Falcon frais de 50 millilitres pré-réfrigéré. Retournez le tube de l’ultracentrifugeuse sur un papier absorbant frais et non pelucheux pour éliminer les traces de surnageant et remettez la pastille en suspension dans 600 microlitres de tampon HEPES.

Déposer la pastille remise en suspension au fond d’un tube d’ultracentrifugation en polypropylène UltraClear pré-refroidi de 13 millilitres et mélanger délicatement avec quatre millilitres de solution inerte d’iodixanol à gradient de densité de 60 %. Ensuite, superposez avec un millilitre de 40 %, 30 %, 20 % et 10 % d’iodixanol. Remplissez le tube en ajoutant quatre millilitres d’iodixanol à 6% en haut.

Après avoir soigneusement pesé le tube dans un bécher en verre ou un support, transférez-le doucement dans les seaux oscillants, puis dans le rotor des godets oscillants pour l’ultracentrifugation à 141 000 G pendant 16 heures à quatre degrés Celsius. Après l’ultracentrifugation, retirez soigneusement le tube et collectez une fraction d’un millilitre dans des tubes de microcentrifugation autoclavés. L’analyse TEM a montré que les VE mycobactériens sont circulaires et l’analyse de nano-suivi a confirmé des VE de différentes tailles avec des diamètres allant de 20 à 250 nanomètres.

Lorsque l’extrémité N-terminale de mCherry a été fusionnée par translation à l’extrémité C-terminale de CFP-29, une partie des mEVs enrichis de Msm est devenue rose, indiquant la capacité de cf-29 à transporter une protéine étrangère d’intérêt. Le CFP-29 a ensuite été utilisé pour évaluer la livraison d’EsxA dans les VE Msm. L’EsxA de Mtb a été observé dans les véhicules électriques Msm en faibles quantités.

Le CFP-29 EsxA 3X FLAG était plus stable et s’est accumulé à des niveaux plus élevés dans les mEV. L’enrichissement des VE à partir de mycobactéries cultivées dans des conditions physiologiques différentes permet de mieux comprendre leur contenu modifié et leurs fonctions modifiées qui dictent une infectiosité, une pathogenèse et une propagation prolongées des agents pathogènes.