Name: Imagerie en direct de la réception du tube pollinique d’Arabidopsis et de la double fécondation à l’aide de la méthode semi-in vitro cum septum (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Apprenez la méthode semi-in vitro cum septum pour étudier la réception des tubes polliniques et la fécondation chez Arabidopsis thaliana. Cette technique améliorée permet d'observer les interactions gamétophytes avec une efficacité élevée.

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Nous remercions Sara Simonini et Stefano Bencivenga pour le don de la construction pFG:roGFP2-ORP1-NLS et Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter et Celia Baroux pour leurs conseils sur la microscopie. Nous remercions Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima et tous les autres participants à la Conférence internationale sur la reproduction sexuée des plantes 2022 qui ont manifesté leur intérêt pour un protocole sur le VIS cum septum. Ces travaux ont été soutenus par l’Université de Zurich et des subventions du Fonds national suisse à U.G.

NOTA : Voir le tableau des matériaux pour une liste des matériaux et de l’équipement utilisés dans ce protocole.
1. Considérations relatives à la conception de l’expérience d’imagerie
<ol><li>Prédéterminer la durée d’imagerie et la fréquence d’échantillonnage requises pour capturer le phénomène souhaité à observer. Par exemple, selon le théorème d’échantillonnage de Nyquist, la fréquence d’échantillonnage doit être supérieure à deux fois la fréquence la plus élevée de l’échantillon d’entrée. Par conséquent, pour capturer avec précision les oscillations synergiques [Ca2+]cyt , effectuez une imagerie environ toutes les 10 s, mais pour mesurer la vitesse des spermatozoïdes lors de la décharge du tube pollinique, assurez-vous d’une résolution temporelle inférieure à 1 s10.</li>
	<li>Sélectionnez des marqueurs fluorescents pour les cellules d’intérêt qui sont suffisamment brillants au-delà de l’autofluorescence de fond. Pour l’utilisation de biocapteurs, sélectionnez les raies les plus brillantes qui ne perturbent pas le fonctionnement de la cellule, car elles sont généralement plus sensibles et nécessitent moins de temps d’exposition.</li>
	<li>Déterminez quel type de microscopie à fluorescence et de grossissement sont les plus appropriés pour capturer le phénomène souhaité. Utilisez la microscopie à grand champ et les objectifs à faible grossissement pour capturer la lumière à partir d’une plus grande profondeur de champ et maintenir la mise au point au fil du temps, imager des objets plus gros tels que des ovules entiers ou utiliser des capteurs ratiométriques sensibles aux artefacts de décalage chromatique. Utilisez CLSM ou 2PEM avec des objectifs de grossissement élevé pour une meilleure résolution des objets cellulaires et subcellulaires, mais notez la difficulté de maintenir la mise au point au fil du temps.</li>
	<li>Estimez le nombre d’échantillons à imager par expérience. Par exemple, utilisez un objectif 10x avec un temps d’échantillonnage minimum de ~30 s pour l’imagerie de trois septa et l’imagerie jusqu’à 40 événements de fécondation par expérience en raison du temps requis pour les fonctions d’autofocus et d’acquisition multi-étapes.</li>
</ol>2. Préparation du milieu de germination du pollen
<ol><li>Préparer le milieu de germination du pollen liquide (5 mM de CaCl2, 1 mM de MgSO4, 5 mM de KCl, 0,01 % [p/v] H 3 BO 3et 10 % [p/v] saccharose) en utilisant 1 M de stocks aliquotes de chaque micronutriment, qui sont stockés à −20 °C. Ajuster le pH à 7,5 avec 0,1 M KOH. Conserver le milieu à 4 °C jusqu’à 2 semaines. REMARQUE: Le pH peut chuter avec le temps.</li>
	<li>Ajouter 2,5 mL de milieu liquide à un bécher de 10 mL et ajouter lentement 32 mg d’agarose à point de fusion ultra-bas (~1,3 %) à l’aide d’une barre d’agitation à rotation rapide pour éviter l’agglutination.</li>
	<li>Faire fondre l’agarose sur une plaque chauffante à 65 °C et nuter le bécher pour recueillir toute condensation sur les côtés.</li>
	<li>Introduire à la pipette 130 μL de milieu dans le puits de 14 mm d’un plat à fond en verre de 35 mm et faire pivoter le plat jusqu’à ce que le milieu recouvre le puits.</li>
	<li>Aspirer un total de 40 μL avec une pipette à partir du centre de la boîte, laissant derrière lui un volume total de 90 μL. REMARQUE : Il est possible d’aspirer plus de milieu hors du puits pour obtenir un volume total inférieur; Cela peut être nécessaire pour les objectifs à fort grossissement avec de faibles distances de travail. Cependant, plus le tampon de gélose est mince, plus il sèchera rapidement.</li>
	<li>Refroidissez le plat sur un bloc d’aluminium dans une chambre d’humidité pour assurer un refroidissement uniforme. Conservez les plaques à 4 °C pendant la nuit pour les utiliser le lendemain matin.</li>
</ol>3. Stadification florale des donneurs de septum, de stigmatisation et de pollen
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65156/65156fig01.jpg"> Figure 1 : Stadification florale des donneurs de septum, de stigmatisation et de pollen. (A) Stades des fleurs d’Arabidopsis (Ler-0) dans une inflorescence. Les bourgeons au stade 12B, qui ont des pétales sur le point de s’ouvrir et des anthères jaunes indéhiscentes, doivent être émasculés en enlevant tous les sépales, pétales et étamines. Les pistils (abritant la femelle fabricant de gamétophytes) sont alors utilisables comme donneurs de septum 24 h plus tard. (B) Stades des fleurs d’Arabidopsis (Col-0) dans une inflorescence. Les bourgeons au stade 12B, qui ont des anthères jaunes indéhiscentes et des stigmates qui émergent à peine des pétales, doivent être émasculés en enlevant tous les sépales, pétales et étamines. Les pistils sont ensuite utilisables comme donneurs de stigmate 24 h plus tard, date à laquelle ils devraient être pollinisés par des fleurs (abritant le marqueur gamétophyte mâle) qui sont ouvertes et excrètent du pollen. Les stigmates pollinisés doivent être disséqués dans les 1 heure suivant la pollinisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65156/65156fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol><li>Le matin avant l’imagerie, choisissez des plantes d’Arabidopsis à utiliser comme donneurs de septum et donneurs de stigmatisation; s’assurer qu’ils sont en bonne santé et qu’ils ont récemment commencé à produire des siliques. NOTE: Landsberg erecta (Ler-0) est une bonne accompagnation pour une utilisation comme donneur de septum, car ses septa sont robustes et il existe de petits entre-nœuds entre les ovules. Columbia (Col-0) est une bonne option à utiliser comme donneur de stigmatisation, car ils semblent favoriser la croissance des sondes polliniques.</li>
	<li>Émasculez au moins trois fleurs donneuses de septum de stade 12B et 12 fleurs donneuses de stigmate de stade 12B en enlevant leurs étamines, sépales et pétales (Figure 1A, B). Enlevez également les fleurs plus âgées sur la même inflorescence, ce qui pourrait potentiellement polliniser la fleur émasculée.</li>
	<li>Le matin, 24 heures plus tard, pollinisez les donneurs de stigmate avec les fleurs donneuses de pollen (p. ex., hébergeant des marqueurs de pollen ou de spermatozoïdes) qui excrètent facilement le pollen. La pollinisation est complète lorsque les stigmates sont presque entièrement recouverts de pollen (Figure 1B).</li>
</ol>4. Dissection du septum
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65156/65156fig02.jpg"> Figure 2 : Guide rapide de la dissection du septum et de la stigmatisation. (A) Étapes de la dissection du septum. Épinglez le pistil sur du ruban adhésif double face avec une aiguille de seringue à insuline et faites des incisions à la jonction ovare-ovaire et à la jonction ovaire-pédicule, suivies d’une coupure peu profonde le long du septum de l’un ou l’autre carpelle (étape 1). Décollez les parois du carpel sur le ruban (étape 2). Coupez le replum sous le septum supérieur (étape 3). Coupez le septum au niveau du style et retirez-le à l’aide d’une pince au niveau du pédicelle (étape 4). Placer le septum sur un support gélose et l’enfoncer doucement avec une pince. (B) Étapes de la dissection de la stigmatisation. Épingler le pistil (pollinisé &lt;1 h avant) sur du ruban adhésif double face et couper à la jonction style-ovaire avec une lame de rasoir (étape 6). Placez le stigmate sur un milieu gélosé à l’aide d’une aiguille à insuline à côté du septum et ajustez la distance à environ 250 μm (étapes 7 et 8). Assurez-vous qu’une piscine semi-liquide se forme autour des micropyles et de la base des styles (étape 9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65156/65156fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol><li>Trente minutes après la pollinisation, ramassez des pistils de donneurs de septum sains et matures au pédicule et placez-les sur du ruban adhésif double face frais monté sur une lame de verre, avec le stigmate qui colle juste à côté du bord du ruban. REMARQUE: Limitez le temps de dissection pendant lequel les pistils sont sur le ruban adhésif pour vous assurer qu’il est aussi court que possible. La dissection doit être effectuée à une humidité élevée, ce qui peut être réalisé en plaçant un humidificateur à côté de la lame.</li>
	<li>Épinglez solidement le pistil sur la bande en appuyant doucement sur le pédicule et le long de l’ovaire à l’aide de la face arrière d’une nouvelle aiguille de seringue à insuline avant de retirer les débris de sépale, de pétale et d’étamine laissés par l’émasculation.</li>
	<li>Sous un stéréoscope, utilisez une aiguille de seringue à insuline pour effectuer deux coupures par carpelle à la jonction ovarienne et à la jonction ovaire-pédicule, suivies de coupures peu profondes le long du septum de chaque carpelle (figure 2, étape 1). REMARQUE: Couper trop profondément le long du septum coupera les ovules au niveau du funicule.</li>
	<li>Décollez délicatement les parois ovariennes sur le ruban (Figure 2, étape 2) et glissez doucement l’aiguille entre les deux septa pour couper le replum sur toute la longueur du pistil sans perturber les ovules (Figure 2, étape 3). REMARQUE: Coupez le replum dans le sens allant du style au pédicule pour vous assurer que les ovules sur le septum supérieur sont perturbés le moins possible.</li>
	<li>Coupez doucement le septum supérieur à la jonction avec le style et avec le pédicule, puis retirez le septum à l’aide d’une pince du côté du pédicule (Figure 2, étape 4). REMARQUE: Gardez cette coupe droite et douce afin que le septum reste plat et ne se courbe pas.</li>
	<li>Placez le septum aussi plat que possible sur le milieu de telle sorte que les micropyles des ovules soient orientés vers le haut et dans le même plan focal. Appuyez doucement sur le septum dans le milieu jusqu’à ce que les ovules soient légèrement incrustés dans le milieu (Figure 2, étape 5). NOTE: Il est essentiel que le septum soit placé de manière à ce que les micropyles des ovules soient accessibles aux tubes polliniques (tout ovule inaccessible peut être réarrangé doucement avec une aiguille). Une petite flaque de liquide devrait se former autour du septum après l’incorporation.</li>
	<li>Répétez les étapes 4.1-4.6 pour un maximum de deux autres pistils, en plaçant les septa bout à bout.</li>
</ol>5. Dissection de la stigmatisation
<ol><li>Placez les pistils pollinisés du donneur de stigmate sur du ruban adhésif double face frais monté sur une lame de verre, de sorte que la jonction de type ovaire soit hors du bord de la bande (figure 2, étape 6).</li>
	<li>Utilisez une lame de rasoir neuve pour couper le style droit vers le bas et soulevez-le pour garder le stigmate attaché à la lame (Figure 2, étape 6). REMARQUE: Coupez au bord du ruban pour la coupe la plus propre.</li>
	<li>Retirez le stigmate de la lame à l’aide d’une aiguille de seringue à insuline et placez-le à plat à environ 250-300 μm des ovules (Figure 2, étapes 7-8). REMARQUE: Le style doit être orienté horizontalement sur le côté; Sinon, la plupart des tubes polliniques se développeront sous le septum. Une petite flaque de liquide à l’entrée du style devrait apparaître après qu’il ait été couché sur le milieu pendant 1 min; C’est un bon signe, car les tubes polliniques auront une sortie en douceur du style.</li>
	<li>Répétez les étapes 5.1 à 5.3 pour un maximum de 12 stigmates, en plaçant deux de chaque côté de chaque septum. Cherchez une petite flaque de liquide se formant autour du micropyle des ovules; cela facilite l’accessibilité et le ciblage des tubes polliniques vers les sacs embryonnaires (Figure 2, étape 9). REMARQUE: Limitez la durée d’ouverture du plat pour éviter que le milieu et les ovules ne se dessèchent.</li>
</ol>6. Imagerie
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65156/65156fig04.jpg"> Figure 3 : schéma d’imagerie SIV cum septum. (A) Installation complète du VIS et du septum avec 12 stigmates pollinisés et 3 septas, comme on le voit à travers un stéréoscope. (B) Images fusionnées de la configuration complète du SIV cum septum vues dans A 5 h après l’incubation en utilisant un objectif 10x, avec les cinq zones de vue d’ensemble (~ 1 mm chacune) marquées pour l’acquisition en plusieurs étapes. Les encadrés verts montrent les ovules qui ont reçu des tubes polliniques subissant une explosion explosive dans les synergides. C) Vue plus rapprochée de la zone d’ensemble 2 à différents moments. Environ 3 h après l’incubation dans la chambre d’humidité au microscope, les tubes polliniques devraient arriver près des micropyles, et à 6 h d’imagerie, la plupart des ovules devraient avoir reçu correctement des tubes polliniques (carrés verts); Ces ovules subissent alors un éclatement explosif du tube pollinique (astérisque). Barres d’échelle = (A) 5 mm, (B,C) 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65156/65156fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol><li>Une fois la dissection terminée et la capsule prête à être imagée, laissez-la incuber dans une chambre d’humidité au microscope maintenue à 92% d’humidité relative et 21 ° C. REMARQUE: Si aucune chambre d’humidité n’est disponible pour le microscope, tapisser les bords extérieurs du couvercle et de la capsule avec un petit volume d’eau aidera à maintenir un niveau élevé d’humidité dans le plat.</li>
	<li>Faites la mise au point des échantillons sous fond clair à une faible intensité lumineuse, puis passez à la lumière fluorescente, en marquant les zones de l’échantillon sur la vue de la scène à imager. NOTE: À un grossissement de 10x, environ cinq zones peuvent être marquées pour un total de trois septa (Figure 3). Limiter le temps nécessaire au marquage des zones de surveillance afin de minimiser la phototoxicité ou le réchauffement de l’échantillon par la lumière fluorescente.</li>
	<li>Commencez l’imagerie à l’aide d’un schéma d’acquisition à plusieurs étages avec une fonction de mise au point automatique au début de chaque zone de vue d’ensemble. Comme les tubes polliniques émergeront du style ~ 1 h après l’incubation de l’échantillon, retarder l’acquisition de 2 h ou jusqu’à ce que les tubes polliniques aient atteint le micropyle. Assurez-vous que l’autofocus est réglé avec une plage de 100 μm (pas de 7 μm de grand et pas fins de 1 μm) pour garder les ovules au point lorsque les septa se déplacent et s’enfoncent légèrement au fil du temps.</li>
	<li>Arrêtez l’acquisition de l’image ~9 h après le début de l’incubation de l’échantillon, car à ce moment-là, la plupart des ovules devraient avoir attiré et reçu un tube pollinique. REMARQUE: Si un faible nombre d’ovules attirent les tubes polliniques, une observation attentive de la boîte sous un stéréoscope est utile pour déterminer comment l’orientation de l’ovule ou du style pourrait être améliorée la prochaine fois.</li>
</ol>

<ol><li>Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+mutant+feronia+disrupts+the+female+gametophytic+control+of+pollen+tube+reception%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception.</a> Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).</li>
<li>Rotman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+control+of+male+gamete+delivery+during+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).</li>
<li>Palanivelu, R., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+short-range+ovule+signals+attract+or+repel+Arabidopsis+thaliana+pollen+tubes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro.</a> BMC Plant Biology. 6, 7(2006).</li>
<li>Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+F-actin+dynamics+during+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).</li>
<li>Iwano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+changes+dynamically+during+the+interaction+of+the+pollen+tube+with+synergid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells.</a> Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).</li>
<li>Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcium+dialog+mediated+by+the+FERONIA+signal+transduction+pathway+controls+plant+sperm+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery.</a> Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).</li>
<li>Denninger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-female+communication+triggers+calcium+signatures+during+fertilization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis.</a> Nature Communications. 5, 4645(2014).</li>
<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+calcium+spikes+during+double+fertilization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis.</a> Nature Communications. 5, 4722(2014).</li>
<li>Ponvert, N., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergid+calcium+ion+oscillations+define+a+new+feature+of+pollen+tube+reception+critical+for+blocking+interspecific+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.

Ce manuscrit présente un protocole efficace pour l’imagerie de la réception du tube pollinique et de la double fécondation chez Arabidopsis. La méthode améliorée, SIV cum septum, augmente considérablement le pourcentage et le nombre total d’événements de réception réussie du tube pollinique qui sont observables par séance d’imagerie. Les résultats représentatifs présentés ici démontrent une séance d’imagerie avec 41 événements de réception réussie du tube pollinique et 10 ovules présentant des défauts d...

La génération d’une progéniture génétiquement unique dans les organismes à reproduction sexuée dépend de la fusion réussie des gamètes mâles et femelles. Chez les plantes à fleurs, l’interaction de deux gamètes mâles (spermatozoïdes) avec deux gamètes femelles (ovule et cellule centrale) lors de la double fécondation dépend de la libération de spermatozoïdes par le tube pollinique (le gamétophyte mâle). Ce processus, appelé réception du tube pollinique, est largement contrôlé par les cellules synergiques qui résident dans le sac embryonnaire (le gamétophyte femelle)1,2. Comme la réception du tube pollinique a lieu profondément à l’intérieur de la fleur, une méthode permettant l’imagerie du processus par cellules vivantes, appelée réception semi-in vitro (SIV), a été établie3. Avec cette méthode, les ovules d’Arabidopsis excisés sont placés sur un milieu de germination pollinique semi-liquide et ciblés par des tubes polliniques qui se développent à travers le stigmate et le style d’un pistil sectionné à la jonction du tractus transmettant le style 3,4. Depuis le développement de cette technique, des observations détaillées ont conduit à plusieurs découvertes concernant le guidage, la réception et la fécondation des tubes polliniques. Ces découvertes comprennent, entre autres, l’acquisition de la compétence de ciblage du tube pollinique par croissance à travers le stigmate3, l’apparition d’oscillations calciques intracellulaires dans les synergides à l’arrivée du tube pollinique 5,6,7,8,9, et la dynamique de libération et de fécondation des spermatozoïdes lors de l’éclatement du tube pollinique 10 . Néanmoins, parce que cette technique repose sur l’excision des ovules, les observations de fécondation sont limitées en nombre, et la réception des tubes polliniques est souvent aberrante, entraînant l’échec de la rupture du tube pollinique (Vidéo 1 et Fichier supplémentaire 1). Par conséquent, il est nécessaire d’adopter une approche plus efficace permettant des analyses à haut débit de la réception et de la fécondation des tubes polliniques.
Lors de l’élaboration de ce protocole, plusieurs nouvelles approches d’analyse de la réception du tube pollinique, allant des méthodes les plus « in vitro » aux plus « in vivo », ont été testées, et une technique efficace basée sur l’excision du septum entier a été mise au point, ce qui permet jusqu’à 40 observations de fécondation par jour. Ici, les nuances et les points critiques de la technique sont décrits, y compris la mise en scène des fleurs, la dissection, la préparation du milieu et les paramètres d’imagerie. En suivant ce protocole, la recherche axée sur le guidage du tube pollinique, la réception du tube pollinique et la double fécondation devrait être facilitée. Les tailles d’échantillon plus élevées que la méthode permet devraient renforcer la solidité scientifique des conclusions tirées d’expériences d’imagerie en direct. Les applications potentielles de cette technique comprennent, sans toutefois s’y limiter, l’observation des changements moléculaires et physiologiques des concentrations de calcium cytosolique ([Ca2+]cyt), du pH ou de H 2 O2au cours des interactions entre gamétophytes grâce à l’utilisation de biocapteurs génétiquement codés. En outre, les changements cytologiques, tels que la dégénérescence de la synergie réceptive, la migration des spermatozoïdes ou la karyogamie, peuvent être plus facilement observés en utilisant cette méthode améliorée. Enfin, le calendrier des différentes étapes de la fécondation peut être surveillé en microscopie à grand champ, puis des analyses plus détaillées utilisant la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) ou la microscopie à excitation à deux photons (2PEM) peuvent être effectuées pour une résolution plus élevée et une reconstruction 3D.

<table><tbody><tr><td>Glissière en verre de 1 mm&nbsp ;</td><td>Epredia&nbsp ;</td><td></td><td></td>16211551</tr><tr><td>plat à fond en verre de 35 mm (puits de 14 mm)</td><td>Mattek&nbsp ;</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium&nbsp ;</td><td>Roth&nbsp ;</td><td>CN93.1</td><td></td></tr><tr><td>Columbia (Col-0)&nbsp ;</td><td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td><td></td><td>stigma donneur</td></tr><tr><td>Dissecting Scope&nbsp ;</td><td>Olympe&nbsp ;</td><td>SZX2-ILLT</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille à insuline (0,3 G)</td><td>BD</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Landsberg erecta (Ler-0)&nbsp ;</td><td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td><td></td><td>septum</td></tr><tr><td>donneur Sulfate de magnésium</td><td>Merck</td><td>5886</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>Beldura</td><td>7026797</td><td></td></tr><tr><td>Scotch ruban adhésif double face&nbsp ;</td><td>Scotch</td><td>768720</td><td>Moins épais et bon pour la dissection</td></tr> des <tr><td>stigmates Chlorure de sodium&nbsp ;</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Réactifs Sucrose</td><td>ITW</td><td>A2211,1000</td><td></td></tr><tr><td>Tesa ruban adhésif double face&nbsp ;</td><td>Tesa</td><td>05681-00018</td><td>Très collant et bon pour la dissection du septum</td></tr><tr><td>Agarose à très basse température de gélification</td><td>FMC SeaPrep</td><td>50302</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie en direct de la réception du tube pollinique d’arabidopsis et de la double fécondation à l’aide de la méthode semi-in vitro cum septum

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

Chez les plantes à fleurs, la croissance et le guidage du tube pollinique (gamétophyte mâle) dans le pistil et la réception du tube pollinique par le gamétophyte femelle sont essentiels pour la double fécondation et le développement ultérieur des graines. Les interactions entre les gamétophytes mâles et femelles lors de la réception du tube pollinique aboutissent à la rupture du tube pollinique et à la libération de deux spermatozoïdes pour effectuer une double fécondation. Comme la croissance des tubes polliniques et la double fécondation sont profondément cachées dans les tissus de la fleur, ce processus est difficile à observer in vivo.
Une méthode semi-in vitro (SIV) pour l’imagerie de la fécondation sur cellules vivantes dans la plante modèle Arabidopsis thaliana a été développée et mise en œuvre dans plusieurs études. Ces études ont permis d’élucider les caractéristiques fondamentales de la façon dont le processus de fécondation se produit chez les plantes à fleurs et quels changements cellulaires et moléculaires se produisent lors de l’interaction des gamétophytes mâles et femelles. Cependant, comme ces expériences d’imagerie de cellules vivantes impliquent l’excision d’ovules individuels, elles sont limitées à un faible nombre d’observations par séance d’imagerie, ce qui rend cette approche fastidieuse et très longue. Entre autres difficultés techniques, une défaillance des tubes polliniques pour féconder les ovules in vitro est souvent signalée, ce qui complique gravement de telles analyses.
Ici, un protocole vidéo détaillé pour l’imagerie de la réception et de la fécondation des tubes polliniques de manière automatisée et à haut débit est fourni, permettant jusqu’à 40 observations de la réception et de la rupture du tube pollinique par séance d’imagerie. Couplée à l’utilisation de biocapteurs génétiquement codés et de lignes de marqueurs, cette méthode permet de générer des échantillons de grande taille avec un investissement en temps réduit. Les nuances et les points critiques de la technique, y compris la mise en scène des fleurs, la dissection, la préparation du milieu et l’imagerie, sont clairement détaillés sous forme vidéo pour faciliter les recherches futures sur la dynamique du guidage, de la réception et de la double fécondation du tube pollinique.

Pour évaluer le moment de la dégénérescence nucléaire dans la synergide réceptive par rapport à la rupture du tube pollinique chez Arabidopsis , ainsi que pour observer si le synergide gauche ou droit est prédestiné à devenir le synergide réceptif, la méthode SIV cum septum décrite ici a été utilisée en utilisant un marqueur nucléaire gamétophyte femelle empilé avec un marqueur cytosolique synergide (pFG: roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1) en tant que donneur de septum et marqueur gamétophyte...

Ici, nous décrivons une amélioration de la méthode semi-in vitro (SIV) pour observer le guidage et la réception du tube pollinique chez Arabidopsis thaliana, ce qui augmente la réceptivité des ovules. La méthode SIV cum septum à haut débit peut être couplée à des lignées marqueurs gamétophytes et à des biocapteurs génétiquement codés pour surveiller le processus dynamique de fécondation.

Imagerie en direct de la réception du tube pollinique d’Arabidopsis et de la double fécondation à l’aide de la méthode semi-in vitro cum septum

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female ...

Cette méthode facilitera la recherche sur la reproduction sexuée chez Arabidopsis en permettant l’observation des interactions des gamétophytes avec une grande efficacité et un nombre élevé d’échantillons par séance d’imagerie. Le principal avantage de cette technique est qu’en maintenant les ovules sur le septum, la quantité et la réceptivité des ovules sont considérablement augmentées par rapport aux méthodes précédentes. La technique de dissection peut être difficile au début et nécessite une main ferme.Par conséquent, il est recommandé de pratiquer quelques fois sur des pistils émasculés avant de commencer l’expérience. Commencez par préparer le milieu de germination du pollen comme expliqué dans le texte. Une fois la gélose complètement fondue, pipeter 130 microlitres du milieu dans le puits de 14 millimètres d’un plat à fond en verre de 35 millimètres.Faire pivoter le plat jusqu’à ce que le milieu recouvre le puits. Aspirer 40 microlitres de milieu à partir du centre du plat à l’aide d’une pipette, en laissant derrière lui 90 microlitres de milieu. Pour assurer un refroidissement uniforme du milieu, refroidissez le plat sur un bloc d’aluminium dans une chambre d’humidité avan

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Biology

Biologie

L'imprinting est un phénomène dans l'usine et la reproduction des mammifères. Méthylation de l'ADN joue un rôle important dans les mécanismes de l'empreinte. Isoler l'endosperme et la détermination du statut de méthylation de gènes soumis à empreinte dans...

Détermination de méthylation de l&#39;ADN des gènes soumis à empreinte dans les Arabidopsis Endosperme

Nous rapportons une méthode simple et efficace pour isoler les embryons aux premiers stades de développement...

Isolation efficace et rapide des embryons à un stade précoce de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Graines

imagerie confocale en direct fournit aux biologistes un outil puissant pour étudier le développement. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l'imagerie confocale en direct de développer des fleurs Arabidopsis.

Vivre imagerie confocale de développement Arabidopsis Fleurs

Ce protocole décrit une méthode permettant d’observer l’embryogenèse chez Arabidopsis via clairance ovule, suivie par l’inspection de la formation embryonnaire sous un microscope.

Une méthode de caractérisation de l’embryogenèse chez Arabidopsis

Ce manuscrit décrit une in vitro ovule méthode de culture qui permet l’imagerie de cellules vivantes des Arabidopsis zygotes et des embryons. Cette méthode est utilisée pour visualiser la dynamique intracellulaire au cours de la polarisation du zygote et la spécification des cellules sort dans le développement des embryons.

In Vitro Culture de l’ovule pour vivre-cellule d’imagerie du Zygote polarisation et structuration d’embryon chez Arabidopsis thaliana

Nous démontrons une méthode pour déterminer la fertilisation réussie ou échouée sur la base de la morphologie nucléaire de sperme dans la double fertilisation d'Arabidopsis utilisant un microscope d'épifluorescence.

Évaluation de l'état de fertilisation par la recherche de la morphologie nucléaire du sperme dans la double fécondation de l'arabidopsise

Une méthode améliorée pour mesurer les profils d’hydratation du pollen chez Arabidopsis thaliana est décrite ici. La nouvelle méthode offre une résolution plus élevée, est non invasive et est hautement reproductible. Le protocole représente un nouvel outil pour une dissection plus fine des processus qui régulent les premiers stades de la pollinisation.

Un essai biologique in vivo à haute résolution sur l’hydratation du pollen à grain unique pour Arabidopsis thaliana

Ce protocole décrit la préparation d’échantillons intacts de la couche de cellules de l’endosperme dans les graines d’Arabidopsis thaliana . La méthode ne nécessite que l’équipement de laboratoire courant, tel qu’une aiguille d’injection et des pinces de précision, et permet l’imagerie fluorescente haute résolution de cellules vivantes de cellules endospermiennes dans les graines en développement et matures.

Préparation de tissu intact pour l’analyse microscopique de la couche de cellules de l’endosperme dans des graines d’Arabidopsis en développement et matures

Le mouvement des chromosomes au cours de la prophase méiotique est un phénomène mal compris qui est fondamental pour la formation des spores. Ce protocole décrit une méthode pour acquérir, analyser et quantifier les mouvements du centromère au cours de la prophase méiotique chez les méiocytes mâles d’Arabidopsis thaliana .

Caractérisation par imagerie en direct des mouvements du centromère au cours de la prophase méiotique mâle chez Arabidopsis thaliana

Ceci est un protocole de haut débit de cryoconservation des spermatozoïdes de poisson zèbre. Le sperme cryoconservés en utilisant ce protocole a une moyenne de fertilité de 25% de fécondation in vitro ultérieure et est stable depuis de nombreuses années.

Une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre et de In Vitro La fertilisation

Apprenez la méthode semi-in vitro cum septum pour étudier la réception des tubes polliniques et la fécondation chez Arabidopsis thaliana. Cette technique améliorée permet d'observer les interactions gamétophytes avec une efficacité élevée.

Imagerie en direct de la réception du tube pollinique d’Arabidopsis et de la double fécondation à l’aide de la méthode semi-in vitro cum septum (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie en direct de la réception du tube pollinique d’Arabidopsis et de la double fécondation à l’aide de la méthode semi-in vitro cum septum

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