Automatisation du traitement des bourgeons d’agrumes pour la détection des agents pathogènes en aval grâce à l’ingénierie des instruments

La technique démontrée utilise un instrument à faible coût pour traiter rapidement le tissu d’agrumes riche en phloème, éliminant ainsi le besoin de protocoles à forte intensité de main-d’œuvre et d’équipements de laboratoire spécialisés. Cela permet une détection et une gestion rapides en aval des viroïdes, des virus et des bactéries des agrumes. Cette méthode pourrait augmenter le débit et améliorer la qualité et l’uniformité des services d’analyse, ce qui profiterait à l’industrie des agrumes et pourrait aider à diagnostiquer et à traiter les maladies dans les pépinières et les opérations sur le terrain.

Les agrumes sont infectés par des agents pathogènes, ce qui entraîne des pertes économiques importantes dans le monde entier. Des techniques avancées de détection des agents pathogènes, comme l’extracteur de tissus de bois de bourgeon, ou BTE, sont nécessaires pour produire des matériaux de propagation testés contre les agents pathogènes pour la production d’arbres à grande échelle. Bien qu’elle ait été testée et validée avec des échantillons d’agrumes, la méthode peut être appliquée dans les laboratoires de diagnostic et les opérations sur le terrain pour de nombreuses autres cultures.

Les débutants qui pratiquent cette technique doivent se familiariser avec le protocole, suivre les instructions avec précision et être patients. Pour commencer, utilisez l’application téléphonique Test Tracker pour sélectionner un arbre et maintenez une étiquette de collier NFC (Near-Field Communication) sur le téléphone pour charger les informations de l’arbre sur l’étiquette. Insérez trois à quatre échantillons de bourgeons d’agrumes dans l’extracteur de tissus Budwood, ou BTE, un support de sac en plastique compatible, et fermez-le avec le clip.

Après vous être assuré de la qualité de l’échantillon en suivant les étapes décrites dans le texte, utilisez l’application téléphonique Test Tracker pour scanner l’étiquette de collier NFC de l’arbre et l’associer à l’étiquette de clip NFC sur le sac d’échantillon. À l’intérieur d’une hotte correctement désinfectée, actionnez l’interrupteur situé à l’arrière de la base de l’extracteur de tissus. Assurez-vous que l’interrupteur sur le côté gauche de la boîte est enfoncé sur le dessus et attendez que la LED verte clignotante indique que la chambre est prête.

Pour préparer la chambre contour d’oreille, fixez un sac d’échantillon vide à l’arrière de la chambre en le fixant à la buse arrière à l’aide d’un joint torique. Inspectez la lame pour détecter des signes d’usure ou de dommages, tels que des coupures sur la lame qui se poursuivent dans le plastique ou des coupures sur la pointe. Assurez-vous que la flèche sur la lame est alignée avec le symbole de verrouillage unique et que le dégagement d’air au bas de la chambre est tourné vers le symbole O.

Placez le couvercle transparent sur l’ouverture de la chambre. À l’aide du rail situé à droite de la chambre, faites glisser la glissière BTE transparente sur la chambre, en poussant le verrou au fond de la chambre aussi loin que possible dans la glissière. Assurez-vous que le capuchon du piston est monté sur le dessus de la glissière.

Pour charger la chambre du contour d’oreille sur la base du contour d’oreille, placez la chambre préparée sur la base avec la buse de base du contour d’oreille qui dépasse à l’arrière de la chambre. Chargez l’échantillon sur la base du contour d’oreille en déplaçant l’autocollant blanc sur l’étiquette de clip NFC dans un mouvement circulaire lent vers un Z sur le côté droit de la boîte jusqu’à ce que le voyant jaune commence à clignoter. Après avoir fixé l’échantillon à la base, assurez-vous que le sac d’échantillon n’a pas de trous.

Placez ensuite le joint torique sur le sac d’échantillon pour le fixer à l’avant de la buse BTE. Pour charger le jeu de seringues inutilisé, déchirez d’abord le jeu de seringues. Placez ensuite le jeu de seringues inutilisé sur la tour de la balance.

Retirez la seringue lorsqu’un voyant rouge commence à clignoter ou que la balance affiche zéro. Retirez le piston avec le filtre de la seringue tout en vous assurant que le liquide reste dans la seringue inférieure. Placez le piston sur une serviette en papier, ou sur la tour, où il ne touche aucune surface.

Enfin, fixez la seringue à l’orifice de sortie coulissant en appuyant sur l’orifice de sortie dans la seringue et en la tournant de 90 degrés. Pour commencer le traitement de l’échantillon de bois de bourgeon, appuyez sur le bouton noir supérieur pour démarrer la machine. Prenez un bâton de bois de bourgeon dans le sac et passez-le dans le haut de la buse BTE.

Saisissez le bâton de bourgeon de l’autre côté de la chambre avec l’autre main et descendez lentement dans la lame. Déplacez lentement le bois de bourgeon d’avant en arrière tout en le faisant tourner. Lorsqu’un léger bourdonnement se fait entendre, déplacez la branche plus profondément dans la machine pour vous concentrer sur le phloème.

Après avoir terminé la même chose pour toutes les branches, appuyez sur le bouton noir supérieur pour arrêter le traitement et attendez que le voyant recommence à clignoter en jaune. Pour vérifier le poids de l’échantillon, faites pivoter la seringue de 90 degrés et tirez-la vers le bas. Replacez le piston sur la seringue et placez la seringue sur la tour.

Une fois que la balance a détecté automatiquement l’échantillon, une LED verte clignotante indique que le poids de l’échantillon se situe dans la plage appropriée. Si le voyant rouge clignote, indiquant un poids d’échantillon trop faible, répétez le traitement de l’échantillon. Si le poids est trop élevé, retirez certains échantillons et le clignotement de la LED jaune deviendra plus lent.

Pour homogénéiser l’échantillon, retirez le piston de la seringue contenant l’échantillon. Poussez le liquide dans la seringue et réinsérez le piston. Poussez le piston pour faire passer le tampon et la sève de la plante à travers le filtre à mailles via le tube en caoutchouc dans la seringue vide.

Mélangez l’échantillon en poussant le tampon et plantez la sève d’avant en arrière trois à quatre fois d’une seringue à l’autre jusqu’à ce que l’échantillon se transforme en un liquide vert homogène. Une fois bien homogénéisé, poussez l’échantillon de sève végétale dans la seringue sans le filtre à mailles, et détachez le tube en caoutchouc et la seringue avec le filtre. Ensuite, expulsez l’échantillon de sève végétale de la seringue dans un tube de microcentrifugation stérile de deux millilitres.

Après avoir étiqueté l’échantillon avec le numéro de sac à l’aide d’un marqueur permanent, conservez-les à moins 20 degrés Celsius jusqu’à leur nouvelle utilisation. Désinfectez la chambre amovible du contour d’oreille une fois le 10e échantillon traité et la LED verte continue de clignoter au lieu de passer au bleu. Pour démonter la chambre et nettoyer tous les contaminants, retirez le couvercle en plastique transparent, la glissière transparente de la chambre et l’orifice d’obstruction de la glissière de la chambre.

Tournez ensuite la soupape de décharge d’air au fond de la chambre jusqu’à la marque de cadenas ouverte. Après avoir placé les composants de la chambre dans le nettoyeur à ultrasons d’installation, placez la chambre dans le bain avec le couvercle en dessous pour éviter que le couvercle ne flotte. Faites fonctionner le nettoyeur à ultrasons pendant 15 minutes.

Rincez les composants de la chambre au bain-marie pendant au moins 30 secondes avant de les déplacer vers la station de séchage. Pour commencer le séchage, positionnez le pistolet à air comprimé dans l’alignement de la rainure de l’ouverture supérieure de la chambre et appuyez sur la gâchette du pistolet pour distribuer de l’air pendant environ 30 secondes. Tournez le pistolet à air comprimé vers les buses supérieures de la chambre et, après avoir appuyé sur la gâchette, tracez lentement trois cercles complets de chaque entrée de buse.

Positionnez le pistolet à air comprimé au centre du contour d’oreille et, en partant du point le plus intérieur, maintenez la gâchette enfoncée et déplacez-vous jusqu’à ce que le pistolet à air comprimé pointe vers la glissière. Faites rapidement couler de l’air sur toute la chambre à l’avant et à l’arrière pour évacuer l’eau de surface de l’extérieur. La comparaison du contour d’oreille et du protocole de laboratoire conventionnel pour le traitement des tissus d’agrumes a indiqué que les concentrations d’acides nucléiques extraites déterminées par la mesure de l’absorbance à 260 nanomètres dans les deux cas étaient comparables.

La pureté des acides nucléiques extraits par le contour d’oreille, déterminée par le rapport des absorbances à 260 et 280 nanomètres, était élevée avec une faible contamination protéique. L’intégrité des acides nucléiques analysée par RT-qPCR ciblant l’ARNm du gène de la NADH déshydrogénase des agrumes était très similaire pour le BTE et le protocole manuel standard. La procédure de laboratoire conventionnelle nécessitait près de sept à 10 minutes pour le hachage manuel par échantillon, et plus de temps pour le traitement des tissus, y compris la lyophilisation, le broyage et la centrifugation.

Cependant, le contour d’oreille a traité chaque échantillon pour une extraction d’acide nucléique en trois minutes, y compris les étapes de préparation, de pesée et de nettoyage. Aucun des 72 échantillons sains du premier traitement d’échantillons d’ATB n’a produit de courbes d’amplification pour les agents pathogènes des agrumes testés, validant ainsi le traitement des contours d’oreille des tissus d’agrumes. Dans le deuxième traitement d’échantillons de BTE, avec deux échantillons infectés par un mélange introduit, les acides nucléiques extraits ont montré la présence de différents virus d’agrumes et viroïdes dans les lots un et cinq.

Cependant, aucune contamination croisée entre les têtes, ni aucun faux positif ou résultat négatif n’ont été détectés. Pendant le traitement, laisser la branche au même endroit pendant trop longtemps peut couper trop profondément dans la branche, augmentant les risques de colmatage et de collecte de matériaux fibreux acellulaires. Une fois traité, le matériau est prêt pour la plupart des protocoles d’extraction et de purification de l’ADN et de l’ARN, et peut être testé avec n’importe quel test de détection moléculaire des agents pathogènes des plantes.

La mise au point de l’extracteur de tissus Budwood a ouvert la voie à un criblage à haut débit et à l’échelle du bosquet. Avec l’extracteur de tissus foliaires, il permet de traiter à grande échelle des tissus végétaux qu’ils étaient auparavant considérés comme difficiles à traiter, tels que les racines et les pédoncules.