Name: Tests indépendants de l’oxygène pour mesurer la fonction mitochondriale chez les mammifères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Découvrez des tests indépendants de l'oxygène pour mesurer la fonction mitochondriale chez les mammifères en hypoxie. Ces protocoles utilisent la spectrométrie de masse et le marquage isotopique pour étudier l'adaptation métabolique cellulaire.

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Les figures produites dans ce manuscrit ont été créées avec BioRender.com. Nous sommes reconnaissants à Amy Walker de nous avoir fait part de ses commentaires sur cet article. J.B.S. a été soutenu par la Worcester Foundation for Biomedical Research Grant.

Traçage d’isotopes stables et analyse LC-MS pour mesurer les activités DHODH et SDH

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<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2, 16080(2016).</li>
<li>Chandel, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+generated+at+mitochondrial+complex+III+stabilize+hypoxia-inducible+factor-1alpha+during+hypoxia%3A+A+mechanism+of+O2+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: A mechanism of O2 sensing.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25130-25138 (2000).</li>
<li>Cadenas, E., Boveris, A., Ragan, C. I., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+superoxide+radicals+and+hydrogen+peroxide+by+NADH-ubiquinone+reductase+and+ubiquinol-cytochrome+C+reductase+from+beef-heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome C reductase from beef-heart mitochondria.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 180 (2), 248-257 (1977).</li>
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<li>Spinelli, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumarate+is+a+terminal+electron+acceptor+in+the+mammalian+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain.</a> Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).</li>
<li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+redox+cycle+with+complex+II+prioritizes+sulfide+quinone+oxidoreductase-dependent+H%282%29S+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A redox cycle with complex II prioritizes sulfide quinone oxidoreductase-dependent H(2)S oxidation.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (1), 101435(2022).</li>
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<li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+the+Crabtree+effect%3A+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicological Sciences. 97 (2), 539-547 (2007).</li>
<li>Attardi, G., King, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cells+lacking+mtDNA%3A+Repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li>
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<li>Heinrich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+for+natural+isotope+abundance+and+tracer+impurity+in+MS-%2C+MS%2FMS-+and+high-resolution-multiple-tracer-data+from+stable+isotope+labeling+experiments+with+IsoCorrectoR%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Correcting for natural isotope abundance and tracer impurity in MS-, MS/MS- and high-resolution-multiple-tracer-data from stable isotope labeling experiments with IsoCorrectoR.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17910(2018).</li>
<li>Lee, P., Chandel, N. S., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+adaptation+to+hypoxia+through+hypoxia+inducible+factors+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (5), 268-283 (2020).</li>
<li>Bisbach, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Succinate+can+shuttle+reducing+power+from+the+hypoxic+retina+to+the+O%282%29-rich+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Succinate can shuttle reducing power from the hypoxic retina to the O(2)-rich pigment epithelium.</a> Cell Reports. 31 (2), 107606(2020).</li>
<li>Angebault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idebenone+increases+mitochondrial+complex+I+activity+in+fibroblasts+from+LHON+patients+while+producing+contradictory+effects+on+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Idebenone increases mitochondrial complex I activity in fibroblasts from LHON patients while producing contradictory effects on respiration.</a> BMC Research Notes. 4, 557(2011).</li>
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<li>Iwai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+accumulation+during+ischemia+induces+mitochondrial+damage+in+perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Sodium accumulation during ischemia induces mitochondrial damage in perfused rat hearts.</a> Cardiovascular Research. 55 (1), 141-149 (2002).</li>
<li>Murphy, E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+and+mitochondrial+sodium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular and mitochondrial sodium in health and disease.</a> Circulation Research. 104 (3), 292-303 (2009).</li>
<li>Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+analysis+of+mitochondria+from+cultured+cells+and+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52076(2015).</li>
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<li>Birsoy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+of+the+mitochondrial+electron+transport+chain+in+cell+proliferation+is+to+enable+aspartate+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An essential role of the mitochondrial electron transport chain in cell proliferation is to enable aspartate synthesis.</a> Cell. 162 (3), 540-551 (2015).</li>
<li>Beigneux, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-citrate+lyase+deficiency+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">ATP-citrate lyase deficiency in the mouse.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (10), 9557-9564 (2004).</li>
<li>Gameiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+HIF-mediated+reductive+carboxylation+is+regulated+by+citrate+levels+and+sensitizes+VHL-deficient+cells+to+glutamine+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo HIF-mediated reductive carboxylation is regulated by citrate levels and sensitizes VHL-deficient cells to glutamine deprivation.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 372-385 (2013).</li>
<li>Fendt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+glutamine+metabolism+is+a+function+of+the+alpha-ketoglutarate+to+citrate+ratio+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reductive glutamine metabolism is a function of the alpha-ketoglutarate to citrate ratio in cells.</a> Nature Communications. 4, 2236(2013).</li>
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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à signaler.

Comme les recherches émergentes démontrent que les mitochondries des mammifères peuvent fonctionner sans consommer d’oxygène moléculaire, il est de la plus haute importance pour les chercheurs d’utiliser des tests orthogonaux, au-delà des mesures OCR, pour quantifier avec précision la fonction mitochondriale. Ici, nous avons compilé une série de tests qui peuvent être utilisés pour évaluer directement les activités des complexes I, II, V et DHODH en mesurant l’équilibre mitochondrial NAD + / NADH, l’utilisation d’accepteurs d’électrons terminaux adaptatifs, la production d’ATP, la biosynthèse de novo de la pyrimidine et les ROS dérivés des mitochondries. Notamment, ces tests mesurent plus directement la fonction mitochondriale que les mesures OCR. En outre, ces tests fournissent aux chercheurs des moyens traitables de quantifier la fonction mitochondriale pendant l’hypoxie, pour laquelle les mesures OCR sont en grande partie hors de propos en raison de l’utilisation du fumarate comme accepteur d’électrons terminal privilégié. Enfin, les méthodes basées sur la prolifération décrites ici sont plus rentables que les expériences classiques de respirométrie, fournissant ainsi un moyen largement accessible d’étudier la fonction mitochondriale dans les systèmes mammifères.
Il y a des considérations clés lors de l’utilisation de ces tests pour mesurer la fonction mitochondriale dans les cellules en culture. En ce qui concerne les essais de prolifération, il est important d’ajuster le nombre de cellules ensemencées pour le taux de doublement de chaque lignée cellulaire. Les cellules doivent être ensemencées à au moins 10% de confluence et avec suffisamment d’espace pour permettre trois à quatre doublages afin que les différences de prolifération puissent être quantifiées. Une autre considération pour chaque essai est la concentration des petites molécules utilisées comme témoins pour les activités de chaque complexe ETC. Comme différentes lignées cellulaires peuvent présenter des sensibilités différentes à ces inhibiteurs, il est essentiel de tester la dose de ces petites molécules pour identifier la concentration optimale.
Une limitation universelle des essais étudiant la fonction mitochondriale in vitro, y compris les mesures OCR et tous les tests décrits ici, est la composition métabolique du milieu de culture. Le milieu de culture cellulaire standard tend à biaiser les systèmes en niveaux superficiellement élevés de fonction mitochondriale. Par exemple, les niveaux supraphysiologiques de glutamine augmentent son anaplérose du cycle25 du TCA, ce qui alimente la synthèse mitochondriale du NADH et, par conséquent, augmente la phosphorylation oxydative. De même, la pression partielle de l’oxygène varie entre 3 mmHg et 100 mmHg (environ 0,1%-13%O2) dans les tissus de mammifères mais est atmosphérique (140 mmHg, environ 21%) in vitro26,27. Cet excèsO2 maximise la capacité respiratoire mitochondriale et la production de superoxyde28. Récemment, des efforts ont été déployés pour concevoir des milieux de culture plus physiologiques29,30. Notamment, la culture de cellules dans des milieux semblables au plasma humain diminue la respiration mitochondriale dans certaines lignées cellulaires cancéreuses30, les ROS mitochondriaux dans les cellules T 31 et les adaptations mitochondriales aux thérapies anticancéreuses32. Ainsi, il est essentiel d’être conscient de la composition des milieux de culture utilisés et de comprendre comment elle peut avoir un impact sur la fonction mitochondriale.
Une autre limitation importante et universelle dans l’interprétation de la fonction mitochondriale est le potentiel de différences dans le nombre de mitochondries. Il est donc essentiel de mesurer le contenu mitochondrial soit par la quantification de l’ADNmt33, soit par la mesure de la masse mitochondriale avec des colorants insensibles au potentiel membranaire34, soit par transfert Western des marqueurs mitochondriaux. Il s’agit d’un contrôle critique afin qu’une diminution du nombre de mitochondries ne soit pas confondue avec une diminution de la fonction mitochondriale.
Il existe également des limitations et des dépannages spécifiques qui s’appliquent aux tests décrits ici. Premièrement, étant donné que les cellules différenciées ne prolifèrent pas, les tests basés sur la prolifération ne seront pas utiles pour évaluer la fonction mitochondriale dans ce contexte. L’une des principales limites du protocole de traçage 13C 4-aspartate pour mesurer l’activité DHODH est que l’absorption d’aspartate dans les cellules peut être extrêmement inefficace35. Pour surmonter cette limitation potentielle, les chercheurs peuvent surexprimer le transporteur d’aspartate, SLC1A3, pour faciliter l’absorption du 13C 4-aspartate35.
Une limitation du protocole utilisant le traçage de la 5-glutamine 13C pour mesurer l’activité SDH est que ce test nécessite que les cellules utilisent la voie de carboxylation réductrice pour enrichir les isotopologues M + 3 afin de mesurer l’activité inverse. Certaines lignées cellulaires sont incapables de flux de carboxylation réductrice en raison d’une faible expression de la citrate lyaseATP 36, d’une stabilisation insuffisante de l’HIF37 ou d’un rapport α-KG:citrate trop faible38. Pour surmonter cette limitation, on pourrait utiliser le traçage 13C 4-aspartate pour mesurer les activités SDH en avant et en arrière7. Dans ce test, l’activité directe de la SDH peut être mesurée par le rapport du fumarate M+2:succinate M+2 et de la réaction inverse par le succinate M+4:fumarate M+4. Notamment, ce traçage contourne la plupart des enzymes dans la voie de carboxylation réductrice.
Une limitation de l’essai d’activité complexe I utilisant la réduction DCPIP comme lecture est que les mitochondries ne sont pas structurellement intactes. Le processus de congélation-décongélation des mitochondries pour permettre leur absorption de NADH pour le test peut certainement ternir l’intégrité structurelle de la membrane mitochondriale39. Ce test doit être effectué parallèlement à des tests tels que le test de prolifération complexe I pour s’assurer que les changements observés dans l’activité du complexe I sont également vrais avec des cellules intactes.
Dans des études futures, certaines de ces techniques pourront être adaptées pour mesurer les fonctions mitochondriales in vivo en utilisant des organismes modèles tels que des souris et Caenorhabditis elegans. Les méthodes actuelles utilisées pour mesurer la fonction mitochondriale in vivo sont centrées sur l’OCR au niveau de l’organisme, en particulier le taux d’échange respiratoire lors de l’utilisation de modèles murins. Une limitation claire de cette méthode est que l’oxygène remplit de nombreuses fonctions biochimiques et de signalisation au-delà de son rôle d’accepteur terminal d’électrons omniprésent dans l’ETC mitochondrial. Par exemple, l’oxygène est « consommé » par l’activité catalytique des enzymes de la famille des dioxygénases. Bien que ces enzymes contribuent au taux de consommation d’oxygène cellulaire, elles ne participent pas, ne régulent pas ou ne reflètent pas la fonction mitochondriale. Les expériences classiques de pneumométrie in vitro contrôlent généralement la « ROC non mitochondriale », tandis que les expériences sur le rapport d’échange respiratoire (RER) de l’organisme ne peuvent pas contrôler cela, ce qui limite l’interprétation du RER en tant que métrique de la fonction mitochondriale in vivo. Cependant, il est possible d’adapter les protocoles pour mesurer l’activité DHODH via le traçage 4-aspartate 13C, l’activité du complexe II via le traçage 13C5-glutamine, l’activité du complexe I sur les mitochondries purifiées à partir de tissus et les ROS mitochondriaux en utilisant des composés favorables à laLC-MS tels que MitoB afin de mesurer la fonction mitochondriale in vivo.. Ces tests directs pour interroger les fonctions mitochondriales, en combinaison avec les expériences classiques de respirométrie, fournissent aux chercheurs une évaluation plus complète et plus précise de la fonction mitochondriale dans les cellules et les tissus de mammifères.

La fonction mitochondriale est une mesure essentielle de la santé cellulaire, car elle soutient les fonctions biosynthétiques, bioénergétiques et de signalisation clés dans les cellules de mammifères1. La grande majorité des fonctions mitochondriales nécessitent un flux d’électrons à travers la chaîne de transport d’électrons (ETC), et les perturbations du flux d’électrons dans l’ETC provoquent une maladie mitochondriale grave2. L’ETC est composé d’une série de réactions de réduction et d’oxydation (redox) qui sont intégrées dans la membrane mitochondriale interne, et ces réactions de transfert d’électrons libèrent de l’énergie libre qui peut être exploitée pour soutenir la synthèse de l’ATP, les processus physiologiques tels que la thermogenèse, les voies de biosynthèse telles que la biosynthèse de novo de la pyrimidine et l’équilibre du statut redox des cofacteurs tels que le NADH. Les complexes ETC I et III produisent des espèces réactives de l’oxygène (ROS)3,4,5, qui, à leur tour, régulent les voies clés de signalisation telles que HIF, PI3K, NRF2, NFκB et MAPK 6. Par conséquent, les métriques du flux d’électrons dans l’ETC sont classiquement utilisées comme proxy de la fonction mitochondriale dans les cellules de mammifères.
Les expériences de respirométrie sont fréquemment utilisées pour mesurer la fonction mitochondriale dans les cellules de mammifères. Puisque O2 est l’accepteur terminal d’électrons le plus omniprésent pour l’ETC chez les mammifères, sa réduction est utilisée comme proxy pour la fonction mitochondriale. Cependant, de nouvelles preuves démontrent que les mitochondries de mammifères peuvent utiliser le fumarate comme accepteur d’électrons pour maintenir les fonctions mitochondriales qui dépendent de l’ETC, y compris la biosynthèse de novo de la pyrimidine 7, l’oxydation du NADH7 et la désintoxication du sulfure d’hydrogène8. Ainsi, dans certains contextes, notamment en milieu hypoxique, les mesures du taux de consommation d’O2 (OCR) ne fournissent pas une indication précise ou précise de la fonction mitochondriale.
Ici, nous décrivons une série de tests qui peuvent être utilisés pour mesurer la fonction mitochondriale indépendamment de l’OCR. Nous fournissons des tests pour mesurer directement l’oxydation NADH médiée par le complexe I, la biosynthèse de novo pyrimidine médiée par la dihydroorotate déshydrogénase, la synthèse complexe V-dépendante de l’ATP, la directionnalité nette du complexe succinate déshydrogénase (SDH) et les ROS dérivés des mitochondries. Ces tests sont destinés à être effectués sur des cellules de mammifères en culture, bien que beaucoup puissent être adaptés pour étudier les fonctions mitochondriales in vivo. Notamment, les tests décrits dans ce protocole sont des mesures plus directes des fonctions mitochondriales que l’OCR. De plus, ils permettent de mesurer la fonction mitochondriale en hypoxie, un contexte dans lequel l’OCR n’est pas une mesure indicative. Pris ensemble, ces essais, combinés à des expériences classiques de respirométrie, fourniront aux chercheurs une évaluation plus complète de la fonction mitochondriale dans les cellules de mammifères.

<table><tbody><tr><td>&nbsp ; Tube de 1,5 mL</td><td>Cell Treat</td><td>667443</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 2,0 mL</td><td>Cell Treat</td><td>229446</td><td></td></tr><tr><td>plaque à 6 puits</td><td>Cell Treat</td><td>229106</td><td></td></tr> plaque <tr><td>à 12 puits</td><td>Cell Treat</td><td></td> 229112<td></td></tr><tr><td>13C4-aspartate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>604852</td><td></td></tr><tr><td>13C5-glutamine</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>285978-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger de 15 mL</td><td>Cell Treat</td><td>667411</td><td></td></tr><tr><td>tube à centrifuger de 50 mL</td><td>Cell Treat</td><td>667421</td><td></td></tr><tr><td>boîte de culture tissulaire de 150 mm</td><td>Cell Treat</td><td>229651</td><td></td></tr><tr><td>1x Saline tamponnée au phosphate</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>2,6- dichlorophénolindophénol</td><td>Honeywell</td><td>33125</td><td></td></tr><tr><td>Carbonate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37999</td><td></td></tr><tr><td>Antimycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ascentis Express C18</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53825-U</td><td></td></tr><tr><td>Filtre supérieur de bouteille 500 mL, 0,22 & micro ; m, PES 9 9 mm de diamètre de membrane</td><td>Cell Treat</td><td>229717</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Brequinar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0113</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter, double extrémité Lame plate et étroite</td><td>Cell Treat</td><td>229305</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap -105 Piège à froid</td><td>Labconco</td><td>7385020</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur complet de protéase Comprimés</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td></td><td></td>4693116001</tr><tr><td>Contre-gobelets Coulter</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-694</td><td></td></tr><tr><td>Decylubiquinone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7911</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medium Eagle modifié (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EGTA Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Eppendorf 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000908</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Eppendorf 5910 Ri</td><td>Eppendorf</td><td>5943000343</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sans glucose</td><td>Gibco</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sans glutamine</td><td>Thermo Fisher</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde d’ammonium à 35 % de qualité HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>460801000</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile de qualité HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900667</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Acide formique de qualité HPLC</td> 366927 <td></td></tr><tr><td>Acide formique de qualité HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol de qualité HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>MeOH de qualité HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>900688</tr><tr><td>Eau de qualité HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Lignée cellulaire d’ostéosarcome humain 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tampon isotone</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MitoSox Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>N-acétyl-L-cystéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Broyeur de tissus, taille 21</td><td>Kimble</td><td>885502-0021</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Média DMEM sans pyruvate</td><td>Spectromètre de masse Gibco</td><td>11965175</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Thermo</td><td>Scientific</td><td>726030</td><td></td></tr><tr><td>ReCO2ver Incubateur</td><td>Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réfrigéré Centrifuge Concentrateur de vide de paillasse</td><td>Labconco</td><td>7310020</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Millipore Sigma</td><td>20188</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC 5&mu ; m 150 x 2,1 mm Colonne analytique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.50460.0001</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC kit de protection</td><td>Millipore Sigma</td><td>1.50438.0001</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium, granulés</td><td>Millipore Sigma</td><td>567530-250GM</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW, TRACEFINDER 5.1 SP3</td><td>Thermo Scientific</td><td>OPTON-31001</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hydroperoxyde de butyle de tert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>25-200-114</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-S01-A-02</td><td></td></tr><tr><td>Z2 Coulter Nombre et taille des particules analyseur</td><td>Beckman Coulter</td><td>BZ10131270</td><td></td></tr></tbody></table>

tests indépendants de l’oxygène pour mesurer la fonction mitochondriale chez les mammifères

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Le flux d’électrons dans la chaîne de transport d’électrons mitochondriales (ETC) soutient des fonctions biosynthétiques, bioénergétiques et de signalisation à multiples facettes dans les cellules de mammifères. Comme l’oxygène (O2) est l’accepteur terminal d’électrons le plus omniprésent pour l’ETC chez les mammifères, le taux de consommation d’O2 est fréquemment utilisé comme indicateur de la fonction mitochondriale. Cependant, des recherches émergentes démontrent que ce paramètre n’est pas toujours indicatif de la fonction mitochondriale, car le fumarate peut être utilisé comme accepteur d’électrons alternatif pour maintenir les fonctions mitochondriales dans l’hypoxie. Cet article compile une série de protocoles qui permettent aux chercheurs de mesurer la fonction mitochondriale indépendamment du taux de consommation d’O2. Ces tests sont particulièrement utiles lors de l’étude de la fonction mitochondriale dans des environnements hypoxiques. Plus précisément, nous décrivons des méthodes pour mesurer la production d’ATP mitochondriale, la biosynthèse de novo de la pyrimidine, l’oxydation du NADH par le complexe I et la production de superoxyde. En combinaison avec les expériences classiques de respirométrie, ces tests orthogonaux et économiques fourniront aux chercheurs une évaluation plus complète de la fonction mitochondriale dans leur système d’intérêt.

Les activités du DHODH, du complexe I et du complexe V peuvent toutes être évaluées à l’aide d’essais de prolifération. Lors de la privation d’uridine du milieu de culture, les cellules deviennent plus dépendantes de la voie de novo pour la biosynthèse de la pyrimidine. Ainsi, lorsque les cellules ont été mises au défi de proliférer dans un milieu exempt d’uridine, elles étaient plus sensibles à l’inhibition de l’activité DHODH par brequinar que les cellules cultivées dans un milieu contenant de l’uridine (Figure 6A). De même, la privation de pyruvate du milieu de culture rend les cellules plus dépendantes de l’activité du complexe I pour la prolifération. Ainsi, lorsque les cellules ont été mises au défi de proliférer dans un milieu exempt de pyruvate, elles étaient plus sensibles à l’inhibition de l’activité du complexe I par la roténone que les cellules cultivées dans un milieu contenant du pyruvate (Figure 6B). L’activité du complexe V peut être évaluée en mettant les cellules au défi de proliférer dans un milieu contenant du galactose au lieu du glucose. Comme le galactose produit zéro ATP net dans la glycolyse, les cellules qui se développent dans ce carburant dépendent davantage de la synthèse mitochondriale de l’ATP via l’activité complexe V. Ainsi, les cellules proliférant dans un milieu contenant du galactose étaient plus sensibles à l’inhibition du complexe V par l’oligomycine que les cellules proliférant dans un milieu contenant du glucose (Figure 6C).
L’activité de la SDH peut être mesurée à l’aide du traçage dela 5-glutamine 13C et en surveillant son incorporation dans les isotopologues du fumarate et du succinate . Dans les conditions traitées par véhicule, le complexe SDH a favorisé l’activité en avant, et l’incorporation du 13 C 4-succinate dans le 13 C4-fumarate était supérieure à l’incorporation du 13 C 3-fumarate dans le 13C 3-succinate (Figure 7). Dans les conditions traitées à l’antimycine, le complexe SDH favorisait l’activité inverse, et l’incorporation du fumarate de 13 C 3 dans le 13 C3-succinate était supérieure à l’incorporation du 13 C 4-succinate dans le 13 C4-fumarate (Figure 7).
La production de superoxyde à l’intérieur des mitochondries peut être mesurée à l’aide du rapporteur fluorescent MitoSox, qui génère du 2-hydroxy-mitoethidium lors de la réaction avec le superoxyde. Dans cette étude, les cellules traitées avec MitoSox en présence de peroxyde d’hydrogène tertbutyle présentaient des niveaux plus élevés de 2-hydroxy-mitoethidium d’une manière qui a été supprimée par l’ajout de NAC, un antioxydant qui éteint les ROS cellulaires (Figure 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig01.jpg"> Figure 1 : Base mécaniste de l’essai complexe de prolifération V. Oxydation du glucose et du galactose par glycolyse. Le glucose produit deux ATP nets de la glycolyse, tandis que le galactose produit un ATP net nul parce que la synthèse UTP est nécessaire pour l’UDP-galactose. Ainsi, les cellules cultivées dans le galactose sont plus dépendantes de la synthèse mitochondriale de l’ATP en raison d’un manque d’ATP produit par glycolyse. Abréviations : GALK = galactokinase; GALT = galactose-1-phosphate uridylyltransférase; PGM1 = phosphoglucomutase 1; GPI = glucose-6-phosphate isomérase, UGP = UDP-glucose pyrophosphorylase; GALE = UDP-galactose-4-épimérase; NDK = nucléotide diphosphate kinase; UMPK = uridine monophosphate kinase; HK = hexokinase; PFK = phosphofructokinase; ALDO = aldolase; TPI = triosephosphate isomérase; GAPDH = glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase; PGK = phosphoglycérate kinase; PGM = phosphoglucomutase; ENO = énolase; PK = pyruvate kinase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig02.jpg"> Figure 2 : Base mécaniste de l’essai complexe de prolifération I. Schéma des voies métaboliques qui sont altérées lors de l’inhibition de l’activité complexe I. Dans les milieux à haute teneur en pyruvate, l’inhibition du complexe I est contournée par oxydation du NADH médiée par la LDH. Dans les milieux à faible teneur en pyruvate, cette adaptation est moins réalisable, ce qui rend les cellules plus dépendantes de l’activité du complexe I pour réoxyder le NADH. Abréviations : LDH = lactate déshydrogénase; Cycle TCA = cycle de l’acide tricarboxylique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig03.jpg"> Figure 3 : Schéma de la réaction DHODH lors du traçage 13C 4-aspartate. Brequinar inhibe l’oxydation du dihydroorotate en orotate, empêchant ainsi la synthèse en aval de l’UMP. 13LeC4-aspartate est incorporé dans le 13C3-UMPvia l’activité DHODH. Abréviations : OMM = membrane mitochondriale externe; IMM = membrane mitochondriale interne; DHODH = dihydroorotate déshydrogénase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig04.jpg"> Figure 4 : Mesure de l’activité du complexe II avant et inverse via le traçage dela 5-glutamine 13C. Pour mesurer l’activité du complexe II direct (à gauche), l’incorporation de 13 C 5-glutamine dans le 13 C 4-succinate et le 13 C4-fumarate est surveillée. Pour mesurer l’activité du complexe inverse II (à droite), l’incorporation de 13 C 5-glutamine dans le 13 C 3-succinate et le 13 C3-fumarate est surveillée. Abréviations : SDH = succinate déshydrogénase; CytC = cytochrome C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig05.jpg"> Figure 5 : Réaction MitoSox Red avec superoxyde. La réaction de MitoSox avec les superoxydes mitochondriaux pour former 2-OH-MitoE2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig06.jpg"> Figure 6 : Tests basés sur la prolifération pour mesurer la fonction mitochondriale (A) Prolifération de cellules d’ostéosarcome 143B traitées avec 5 uM brequinar, un inhibiteur de DHODH, en milieu avec ±100 ug/mL d’uridine. Les données sont moyennes ± SEM; N = 3 par condition. (B) Prolifération de cellules d’ostéosarcome 143B traitées avec la roténone 2 uM, un inhibiteur du complexe I, en milieu avec ±5 mM de pyruvate. Les données sont moyennes ± SEM; N = 3 par condition. (C) Prolifération de cellules d’ostéosarcome 143B traitées avec l’oligomycine 5 uM, un inhibiteur complexe V, en milieu avec 10 mM de glucose ou 10 mM de galactose comme seule source centrale de carbone. Les données sont moyennes ± SEM; N = 3 par condition. * indique p &lt; 0,05 en utilisant un test ANOVA unidirectionnel dans Graphpad Prism. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig07.jpg"> Figure 7 : Traçage de la5-glutamine en C 13C pour mesurer l’activité du complexe II. Oxydation du succinate et réduction du fumarate (SDH inverse) dans les cellules Caki1 et DLD1 traitées à l’antimycine A 500 nM. Les données représentent la moyenne ± SEM; N = 3 par condition. indique p &lt; 0,05 à l’aide d’un test t non apparié dans GraphPad Prism. Abréviations : SDH = oxydation du succinate ; SDH inverse = réduction du fumarate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig08v2.jpg"> Figure 8 : Essai MitoSox basé sur LCMS pour détecter le superoxyde. Extrait du chromatogramme ionique de 2-OH-Mito E2+ isolé à partir de cellules Caki1 traitées avec MitoSox pendant 30 min en présence de tBuOOH ± de NAC. Abréviations : LCMS = chromatographie liquide-spectrométrie de masse; NAC = N-acétyl cystéine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Composition des réactifs, des tampons et des milieux utilisés dans ce protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184_Table%201%20Reaction%20Compositions_Revision%20(2).xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Ici, nous présentons une compilation de tests pour mesurer directement la fonction mitochondriale dans les cellules de mammifères indépendamment de leur capacité à consommer de l’oxygène moléculaire.

Tests indépendants de l’oxygène pour mesurer la fonction mitochondriale chez les mammifères

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