Name: Génération transmitochondriale de Cybrides à l’aide de lignées cellulaires cancéreuses (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Découvrez la génération de cybrides transmitochondriaux à partir de lignées cellulaires cancéreuses en suspension pour étudier le rôle des mitochondries dans la tumorigenèse. Cette méthode permet d'élucider les contributions mitochondriales à la progression tumorale.

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Cette recherche a été financée par les numéros de subvention PID2019-105128RB-I00 à RSA, JMB et AA, et PGC2018-095795-B-I00 à PFS et RML, toutes deux financées par MCIN/AEI/10.13039/501100011033 et les numéros de subvention B31_20R (RSA, JMA et AA) et E35_17R (PFS et RML) et financées par Gobierno de Aragón. Le travail de RSA a été soutenu par une subvention de l’Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. Les auteurs tiennent à souligner l’utilisation du Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.

REMARQUE : Tous les milieux de culture et compositions tampons sont spécifiés dans le tableau 1. Avant la génération de cybrides, les profils d’ADN mitochondrial et nucléaire des cellules donneuses et receveuses doivent être typés pour confirmer la présence de différences génétiques dans les deux génomes entre les lignées cellulaires. Dans cette étude, une lignée cellulaire L929 disponible dans le commerce et sa lignée cellulaire dérivée, L929dt, qui a été générée spontanément dans notre laboratoire (voir13 pour plus d’informations) ont été utilisées. Ces lignées cellulaires présentent deux différences dans la séquence de leur gène mt-Nd2 qui peuvent être utilisées pour confirmer la pureté de l’ADNmt une fois le processus de cybridisation terminé13. Dans ce cas, la pureté du fond nucléaire a été confirmée par la sensibilité aux antibiotiques, car, contrairement aux cellules L929dt, les L929 étaient résistantes à la génétique.
1. Déplétion mitochondriale par traitement à la rhodamine 6G (cellules receveuses)
REMARQUE: La première étape pour une génération réussie de cybride est d’abolir complètement et irréversiblement les fonctions mitochondriales dans les cellules receveuses. À cette fin, il est nécessaire de déterminer au préalable, pour chaque lignée cellulaire, la concentration appropriée et la durée du traitement avec la rhodamine 6G. Cette concentration adéquate devrait être juste en dessous de la mort cellulaire induite par le médicament (la plus élevée qui ne tue pas les cellules pendant le traitement). Effectuez les opérations suivantes une fois les conditions optimales définies.
<ol><li>Ensemencer 10 à 6 cellules dans une plaque à 6 puits en utilisant un milieu de culture complet (voir le tableau 1 pour plus de détails) et les traiter quotidiennement avec la concentration optimale de rhodamine 6G pendant 3à 10 jours, selon la lignée cellulaire. Les concentrations traditionnelles varient de 2 à 5 μg/mL pendant 3 à 10 jours20,21. Dans cette étude, pour les cellules dérivées de L929, 2,5 μg/mL de rhodamine 6G pendant 7 jours était le traitement sélectionné13,22.</li>
	<li>Pour garder les cellules en vie, complétez le milieu de culture cellulaire avec 50 μg/mL d’uridine et 100 μg/mL de pyruvate et renouvelez-le toutes les 24 heures.</li>
	<li>Après traitement et avant fusion, changer le milieu des cellules traitées à la rhodamine 6G pour compléter le milieu de culture cellulaire sans rhodamine 6G, et les laisser dans ce milieu pendant 3-4 h dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2. REMARQUE: L’effet toxique de la rhodamine 6G est irréversible et les cellules avec des mitochondries non fonctionnelles ne devraient pas récupérer20. Ainsi, après le traitement, les cellules qui ne reçoivent pas de mitochondries fonctionnelles devraient mourir même dans un milieu de culture supplémenté en uridine. Par conséquent, aucune sélection nucléaire ne devrait être nécessaire. Cependant, une fusion témoin de cellules traitées à la rhodamine 6G sans mitochondries est recommandée.</li>
</ol>2. Expansion et isolement mitochondrial (cellules donneuses)
<ol><li>Développer les cellules donneuses de mitochondries pendant le laps de temps du traitement à la rhodamine 6G pour obtenir environ 25 x 106 cellules.</li>
	<li>Le jour 7, récoltez des cellules à croissance exponentielle dans un tube de 50 ml et recueillez-les par centrifugation à 520 x g pendant 5 minutes à température ambiante (RT). Laver les cellules 3x avec une solution saline froide tamponnée au phosphate (PBS) et les sédimenter par centrifugation à 520 x g pendant 5 min à TA. Désormais, effectuez toutes les étapes de l’extraction mitochondriale à 4 °C, en utilisant des réactifs froids et en maintenant les tubes avec des cellules ou des mitochondries sur de la glace.</li>
	<li>Après la troisième centrifugation, éliminer le surnageant par aspiration à l’aide d’une pipette en verre couplée à une pompe à vide et remettre en suspension les cellules emballées dans un volume de tampon hypotonique égal à 7x le volume de granulés de la cellule. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube homogénéisateur et laissez les cellules gonfler en les incubant sur de la glace pendant 2 min.</li>
	<li>Casser les membranes cellulaires en effectuant 8 à 10 coups dans l’homogénéisateur couplé à un pilon motorisé tournant à 600 tr/min. REMARQUE: L’étape de la perturbation de la membrane cellulaire peut varier selon les types de cellules; Ainsi, il doit être optimisé pour chaque type de cellule.</li>
	<li>Ajouter le même volume de tampon hypertonique à la suspension cellulaire (7x le volume de pastilles de cellule) pour générer un environnement isotonique.</li>
	<li>Transférer l’homogénat dans un tube de 15 mL et le centrifuger dans un rotor fixe à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Ensuite, prélevez seulement les 3/4 du surnageant en laissant une grande marge de la pastille, pour éviter la contamination par des noyaux ou des cellules intactes, et transférez-le dans un autre tube. Répétez le même processus deux fois. Notez que le surnageant doit être conservé et la pastille jetée.</li>
	<li>Conserver la fraction mitochondriale (surnageant). Transvasez-le dans des tubes de 1,5 mL et centrifugez à vitesse maximale (18 000 x g) pendant 2 min à 4 °C.</li>
	<li>Jeter le surnageant et laver la pastille enrichie en mitochondries avec le tampon A, en combinant le contenu des deux tubes en un seul et en centrifugeant dans les mêmes conditions que celles décrites à l’étape 2.7. Répétez le même processus jusqu’à ce que tout le matériau soit dans un seul tube.</li>
	<li>Faites un lavage supplémentaire avec 300 μL de tampon A et quantifiez la concentration en protéines mitochondriales à l’aide du test Bradford23. Pour chaque test de cybridisation, la quantité optimale de mitochondries pour la procédure de transfert doit être déterminée (dans notre cas, une concentration comprise entre 10 et 40 μg de protéines mitochondriales pour 10à 6 cellules).</li>
	<li>Simultanément, préparer les cellules prétraitées à la rhodamine 6G pour la fusion en les recueillant dans un tube de 15 mL et en centrifugeant à 520 x g pendant 5 min à TA. A noter que la pastille acquiert une couleur rose néon grâce au traitement à la rhodamine 6G.</li>
	<li>Pour s’assurer que l’abolition de la fonction mitochondriale dans les cellules réceptrices ainsi que la purification des organites des donneurs ont été correctement effectuées, ensemencer un petit nombre de cellules traitées à la rhodamine 6G et isoler les mitochondries en utilisant le milieu de culture complet dans une plaque à 6 puits et les cultiver pendant un mois pour vérifier qu’il ne reste aucune cellule survivante dans l’un des puits (Figure 2).</li>
	<li>En parallèle, évaluer l’absence de contaminants noyaux dans la fraction mitochondriale par immunodétection de protéines nucléaires (c.-à-d. lamin bêta, histone H3, etc.) ou par amplification quantitative de la réaction en chaîne de la polymérase (qPCR) d’un gène nucléaire (c.-à-d. SDH, ARNr 18S, etc.). REMARQUE: Pour éviter les contaminations, il est recommandé d’effectuer toutes les étapes dans des conditions aseptiques en travaillant sous une hotte à flux laminaire.</li>
</ol>3. Fusion et génération de cybrides
<ol><li>Pour procéder à la fusion, ajoutez soigneusement 106 des cellules traitées à la rhodamine 6G à la pastille de mitochondrie isolée (10-40 μg de protéine mitochondriale) et centrifugez à 520 x g pendant 5 minutes pour permettre aux cellules de se mélanger aux mitochondries.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de polyéthylène glycol (PEG, 50%) et remettre délicatement la pastille en suspension pendant 30 s. Ensuite, laissez reposer intact pendant encore 30 s.</li>
	<li>Enfin, transférer le mélange dans une plaque à 6 puits avec un milieu de culture cellulaire complet frais et placer dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO2. Après quelques jours (généralement 1 semaine), les cybrides transmitochondriales devraient commencer à croître (Figure 2), donnant naissance à des clones qui peuvent être sélectionnés individuellement ou mélangés dans un pool avant leur analyse.</li>
</ol>4. Vérification du fond mitochondrial et nucléaire
REMARQUE: Une fois que la nouvelle lignée cellulaire a été établie et que les cellules commencent à croître exponentiellement, la pureté de leurs ADN mitochondriaux et nucléaires doit être vérifiée. Ainsi, les lignées cellulaires d’origine devraient abriter différentes mutations ou polymorphismes dans leurs génomes pour les rendre reconnaissables.
<ol><li>Isolement total de l’ADN<ol><li>Isoler l’ADN génomique de toutes les lignées cellulaires utilisées pour la génération de cybrides en utilisant une trousse commerciale d’extraction d’ADN génomique (voir le tableau des matériaux) ou en effectuant un protocole standard utilisant l’extraction à l’alcool phénol-chloroforme-isoamylique et la précipitation de l’alcool24.</li>
	</ol></li>
	<li>évaluation de l’ADNmt (Figure 3) REMARQUE: Plusieurs techniques, telles que le séquençage, l’analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) ou la qPCR spécifique aux allèles, peuvent être effectuées pour analyser la pureté de l’ADNmt. Pour confirmer la présence de variations de séquence d’ADNmt par RFLP, suivez les étapes suivantes du protocole.<ol><li>Amplifier un fragment d’ADNmt contenant le changement de nucléotide par PCR.<ol><li>Ici, les cellules L929dt présentent une mutation de l’ADNmt en position 4206, dans un gène mt-Nd2 (m.4206C>T) absent dans les cellules L929. Pour confirmer la présence de cette substitution dans les cybrides transmitochondriales, amplifier un fragment de 397 pb par PCR en utilisant un protocole standard et les amorces suivantes : 1) 5'-AAGCTATCGGG CCCATACCCCG-3' (positions 3862-3884) et 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (positions 4236-4258).</li>
		</ol></li>
		<li>Analyser la présence de la substitution nucléotidique souhaitée par RFLP, en utilisant une endonucléase spécifique qui reconnaît le changement de séquence et génère un modèle de coupe différent pour les deux lignées cellulaires. REMARQUE: Lorsque le variant d’ADNmt L929dt est présent (4206T), l’amplicon obtenu à l’étape 4.2.1 contient deux sites de restriction pour SspI (voir Tableau des matériaux) qui produit trois fragments d’ADN de 306 pb, 52 pb et 39 pb. Le site de restriction qui génère les bandes 52 et 39 est perturbé lorsque la version de type sauvage (WT) C4206 est présente et qu’une nouvelle bande de 91 pb apparaît. Par conséquent, un contrôle interne pour la digestion complète de SspI est inclus dans l’analyse. La réaction de digestion est effectuée à 37 °C, en suivant les instructions du fabricant.</li>
		<li>Séparez les fragments de restriction par électrophorèse et comparez le diagramme de bande.<ol><li>Une fois la digestion effectuée, analyser les fragments de restriction obtenus par électrophorèse dans des gels polyacrylamide-Tris-borate-EDTA (TBE) à 10% (voir Tableau 1 pour 1x composition en TBE). Exécutez l’électrophorèse à 80 V pendant 1 h à TA. Visualisez les fragments d’ADN après coloration au gel dans une solution de bromure d’éthidium dans 1x TBE pendant 15 min à TA (voir le tableau 1 pour la composition de la solution de coloration en gel).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Génotypage de l’ADN nucléaire REMARQUE : Le génotypage de l’ADN nucléaire doit être effectué à l’aide de l’échantillon d’extraction d’ADN précédent utilisé pour l’analyse RFLP.<ol><li>Amplifiez 16 loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 et AMEL) en utilisant un pool d’oligonucléotides spécifiques au commerce (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Effectuer une électrophorèse à l’aide d’un analyseur génétique afin de séparer les fragments précédemment obtenus. NOTE: Une fois amplifiés, les différents loci sont analysés par électrophorèse à l’aide d’un système capilaire (voir tableau des matériaux). Les fragments sont séparés dans une capilaire de 50 cm de long remplie d’un polymère commercial. Des tampons cathodiques et anodiques sont également disponibles dans le commerce, comme le montre le tableau des matériaux. L’électrophorèse est réalisée à 19,5 kV pendant 20 min à 60 °C.</li>
		<li>Utiliser des outils bioinformatiques pour déterminer les allèles correspondant à chaque locus amplifié (voir Tableau des matériaux).</li>
		<li>Comparer les données obtenues à l’étape 4.3.3 avec la base de données du profil d’ADN nucléaire (tableau 1), pour vérifier si le profil d’ADN nucléaire correspond au profil de la lignée cellulaire du récepteur mitochondrial (Figure 4).</li>
	</ol></li>
</ol>

Génération de cybrides transmissibles à partir de cellules cancéreuses en suspension

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Depuis qu’Otto Warburg a rapporté que les cellules cancéreuses modifient leur métabolisme et potentialisent la « glycolyse aérobie »3,4 tout en réduisant la respiration mitochondriale, l’intérêt pour le rôle des mitochondries dans la transformation et la progression du cancer a augmenté de façon exponentielle. Ces dernières années, des mutations dans l’ADNmt et le dysfonctionnement mitochondrial ont été postulés comme caractéristiques de nombreux types de cancer<...

La reprogrammation du métabolisme énergétique est une caractéristique du cancer1 qui a été observé pour la première fois par Otto Warburg dans les années 19302. Dans des conditions aérobies, les cellules normales convertissent le glucose en pyruvate, qui génère ensuite de l’acétyl-coA, alimentant la machinerie mitochondriale et favorisant la respiration cellulaire. Néanmoins, Warburg a démontré que, même dans des conditions normoxiques, la plupart des cellules cancéreuses convertissent le pyruvate obtenu par le processus de glycolyse en lactate, changeant leur façon d’obtenir de l’énergie. Cet ajustement métabolique est connu sous le nom d'« effet Warburg » et permet à certaines cellules cancéreuses de répondre à leurs besoins énergétiques pour une croissance et une division rapides, malgré la génération d’ATP moins efficace que le processus aérobie 3,4,5. Au cours des dernières décennies, de nombreux travaux ont soutenu l’implication de la reprogrammation du métabolisme dans la progression du cancer. Par conséquent, l’énergétique tumorale est considérée comme une cible intéressante contre le cancer1. En tant que plaque tournante du métabolisme énergétique et de l’approvisionnement en précurseurs essentiels, les mitochondries jouent un rôle clé dans ces adaptations cellulaires que, à ce jour, nous ne comprenons que partiellement.
Conformément à ce qui précède, des mutations de l’ADN mitochondrial (ADNmt) ont été proposées comme l’une des causes possibles de cette reprogrammation métabolique, ce qui pourrait entraîner une altération de la performance de la chaînede transport d’électrons (ETC) 6 et expliquerait pourquoi certaines cellules cancéreuses améliorent leur métabolisme glycolytique pour survivre. En effet, il a été rapporté que l’ADNmt accumule des mutations au sein des cellules cancéreuses, étant présent dans au moins 50% destumeurs7. Par exemple, une étude récente menée par Yuan et al. a rapporté la présence de molécules d’ADNmt hypermutées et tronquées dans les cancers du rein, colorectal et thyroïdien8. De plus, de nombreux travaux ont démontré que certaines mutations de l’ADNmt sont associées à un phénotype tumoral plus agressif et à une augmentation du potentiel métastatique des cellules cancéreuses 9,10,11,12,13,14,15,16.
Malgré la pertinence apparente du génome mitochondrial dans la progression du cancer, l’étude de ces mutations et de leur contribution à la maladie a été difficile en raison des limites des modèles expérimentaux et des technologies actuellement disponibles17. Ainsi, de nouvelles techniques pour comprendre l’impact réel de l’ADN mitochondrial dans le développement et la progression de la maladie cancéreuse sont nécessaires. Dans ce travail, nous introduisons un protocole pour la génération de cybrides transmitochondriales à partir de cellules cancéreuses en suspension à croissance, basé sur le repeuplement de cellules prétraitées à la rhodamine 6G avec des mitochondries isolées, qui surmonte les principaux défis des méthodes traditionnelles de cybridisation18,19. Cette méthodologie permet l’utilisation de n’importe quel donneur de noyaux, indépendamment de la disponibilité de leur lignée cellulaire ρ0 correspondante et le transfert de mitochondries à partir de cellules qui, selon les techniques traditionnelles, seraient difficiles à énucléer (c’est-à-dire des lignées cellulaires non adhérentes).

<table><tbody><tr><td>Analyseur génétique 3500XL&nbsp ;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4406016</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 6 puits</td><td>Corning</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>AmpFlSTR Identifiler Plus Kit d’amplification PCR</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4427368</td><td></td></tr><tr><td>Conteneur tampon d’anode 3500 Series</td><td>Applied Biosystems</td><td>4393927</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>PanReac</td><td>131015</td><td></td></tr><tr><td>Bradford assay</td><td>Biorad</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>Cathode Buffer Container 3500 Series</td><td>Applied Biosystems</td><td>4408256</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de culture cellulaire</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131026</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8751</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Gibco</td><td>10131027</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur Pilon en téflon</td><td>Deltalab</td><td>196102</td><td></td></tr><tr><td>L929 lignée cellulaire</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>MiniProtean Tetra4 Gel System</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>amorces PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Produits</td><td></td>personnalisés</tr><tr><td>Polyacrylamide Solution 30 %</td><td>PanReac</td><td>A3626</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7181</td><td></td></tr><tr><td>POP-7 Applied</td><td>Biosystems</td><td>4393714</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>QIAmp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4127</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>SspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3132</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine/pénicilline</td><td>PAN biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac</td><td>P14030b</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td></td></tr></tbody></table>

génération transmitochondriale de cybrides à l’aide de lignées cellulaires cancéreuses

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Ces dernières années, le nombre d’études consacrées à la détermination du lien entre les mitochondries et le cancer a considérablement augmenté. Cependant, des efforts supplémentaires sont encore nécessaires pour bien comprendre le lien impliquant des altérations dans les mitochondries et la tumorigenèse, ainsi que pour identifier les phénotypes mitochondriaux associés aux tumeurs. Par exemple, pour évaluer la contribution des mitochondries dans les processus de tumorigenèse et de métastase, il est essentiel de comprendre l’influence des mitochondries des cellules tumorales dans différents environnements nucléaires. À cette fin, une approche possible consiste à transférer les mitochondries dans un fond nucléaire différent pour obtenir les cellules dites cybrides. Dans les techniques traditionnelles de cybridisation, une lignée cellulaire dépourvue d’ADNmt (ρ0, cellule donneuse nucléaire) est repeuplée avec des mitochondries dérivées de cellules énucléées ou de plaquettes. Cependant, le processus d’énucléation nécessite une bonne adhérence cellulaire à la plaque de culture, une caractéristique qui est partiellement ou complètement perdue dans de nombreux cas dans les cellules invasives. En outre, une autre difficulté trouvée dans les méthodes traditionnelles est d’obtenir l’élimination complète de l’ADNmt endogène de la lignée cellulaire mitochondriale réceptrice pour obtenir des arrière-plans d’ADN nucléaire et mitochondrial pur, évitant ainsi la présence de deux espèces d’ADNmt différentes dans la cybride générée. Dans ce travail, nous présentons un protocole d’échange mitochondrial appliqué aux cellules cancéreuses en suspension basée sur le repeuplement de cellules prétraitées à la rhodamine 6G avec des mitochondries isolées. Cette méthodologie nous permet de surmonter les limites des approches traditionnelles et peut donc être utilisée comme un outil pour élargir la compréhension du rôle mitochondrial dans la progression du cancer et les métastases.

Après avoir suivi le protocole présenté ci-dessus, une lignée cellulaire cybride homoplasmique avec un fond nucléaire conservé mais avec un nouveau génotype mitochondrial devrait être obtenue, comme représenté dans les schémas de la figure 1 et de la figure 2. La pureté de l’ADN mitochondrial et nucléaire présent dans les cybrides peut être confirmée par RFLP, comme le montre la figure 3, et par l’analyse du génotypage de l’ADN nucl...

Ce protocole décrit une technique de génération de cybrides à partir de cellules cancéreuses en suspension comme outil pour étudier le rôle des mitochondries dans le processus tumorigénique.

Génération transmitochondriale de Cybrides à l’aide de lignées cellulaires cancéreuses

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

Cette recherche vise à mieux comprendre la contribution de la mitochondrie dans la progression du cancer et les métastases. La génération transmitochondriale de cybride peut nous aider à élucider comment et à quel niveau les génotypes mitochondriaux sont impliqués dans l’agressivité d’une cellule tumorale. L’une des technologies permettant d’obtenir des informations sur le rôle mitochondrial dans le cancer est la génération de cybrides.Nous combinons cet outil avec une variété d’autres méthodes qui comprennent l’électrophorèse donative, l’analyse de la respiration et d’autres tests fonctionnels mitochondriaux, la cytométrie en flux, la protéomique, etc. La plasticité des cellules cancéreuses ainsi que les réseaux d’interaction entre les gènes nucléaires et mitochondriaux, augmentent la complexité de nos expériences et de l’interprétation des données. C’est l’une des raisons pour lesquelles il est nécessaire de développer de nouvelles approches expérimentales.L’une des découvertes les plus intéressantes de notre recherche a été la découverte de deux mutations de l’ADN mitochondrial associées au détachement des cellules de la boîte de jeu ressemblant à la génération de métastases et rendant les cellules complètement dépendantes de la glycolyse aérobie, et les rendant également plus tumorigènes et métastatiques dans des modèles in vivo. Ce protocole d’échange mitochondrial peut être appliqué aux cellules cancéreuses en croissance en suspension. La chronologie peut surmonter les limites des approches traditionnelles où le processus de nucléation et l’élimination complète de l’ADN mitochondrial des lignées cellulaires réceptrices mitochondriales deviennent souvent un véritable défi.

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