Name: Utilisation du cerveau de l’embryon de poussin comme modèle pour les analyses in vivo et ex vivo du comportement des cellules de glioblastome humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Découvrez l'analyse du comportement des cellules de glioblastome humain dans le cerveau d'embryon de poussin. Cette méthode permet l'observation en temps réel de l'invasion tumorale et du rôle de L1CAM.

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Ce travail a été financé en partie par une subvention au D.S.G. du National Cancer Institute (R03CA227312) et par une généreuse subvention de la Fondation Lisa Dean Moseley. Des échantillons de GBM vivants ont été obtenus avec le consentement du patient par l’intermédiaire du Tissue Procurement Center du Helen F. Graham Cancer Center and Research Institute. Le financement de A.R. a été fourni par le National Center for Research Resources et le National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health (UL1TR003107). Des bourses de recherche d’été de premier cycle à N.P., A.L., Z.W. et K.S. ont été fournies par le programme de recherche de premier cycle de l’Université du Delaware.

Utilisation du cerveau d’un embryon de poulet comme modèle pour étudier le comportement des cellules de glioblastome humain

<ol><li>Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+rat+glioma+growth%2C+invasion%2C+and+vascularization+in+a+novel+chick+embryo+brain+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 22 (3), 225-236 (2005).</li>
<li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+stimulation+of+human+glioma+cell+motility+correlates+with+FAK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">L1 stimulation of human glioma cell motility correlates with FAK activation.</a> Journal of Neuro-Oncology. 105 (1), 27-44 (2011).</li>
<li>Mohanan, V., Temburni, M. K., Kappes, J. C., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1CAM+stimulates+glioma+cell+motility+and+proliferation+through+the+fibroblast+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">L1CAM stimulates glioma cell motility and proliferation through the fibroblast growth factor receptor.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 30 (4), 507-520 (2013).</li>
<li>Anderson, H. J., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+FGFR%2C+integrins+and+FAK+selectively+decrease+L1CAM-stimulated+glioblastoma+cell+motility+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of FGFR, integrins and FAK selectively decrease L1CAM-stimulated glioblastoma cell motility and proliferation.</a> Cellular Oncology. 39 (3), 229-242 (2016).</li>
<li>Pace, K. R., Dutt, R., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+L1CAM+stimulates+glioblastoma+cell+motility%2C+proliferation%2C+and+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Exosomal L1CAM stimulates glioblastoma cell motility, proliferation, and invasiveness.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3982(2019).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+of+glioma+cell+invasion+using+organotypic+brain+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture.</a> Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Aaberg-Jessen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+primary+glioma-+and+cell+line-derived+spheroids+implanted+into+corticostriatal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (4), 546-560 (2013).</li>
<li>Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+glioma+cell+invasion+by+confocal+laser+scanning+microscopy+in+a+novel+brain+slice+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 269 (2), 513-520 (2000).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+and+anti-invasion+research+of+glioma+cells+in+an+improved+model+of+organotypic+brain+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Tumori%22%5BJournal%5D)">Invasion and anti-invasion research of glioma cells in an improved model of organotypic brain slice culture.</a> Tumori. 101 (4), 390-397 (2015).</li>
<li>Fayzullin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+phenotyping+of+invasive+glioma+cells+ex+vivo+reveals+subtype-specific+movement+patterns+guided+by+tumor+core+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Time-lapse phenotyping of invasive glioma cells ex vivo reveals subtype-specific movement patterns guided by tumor core signaling.</a> Experimental Cell Research. 349 (2), 199-213 (2016).</li>
<li>Jensen, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+tumor+stem+cell-based+glioblastoma+invasion+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a tumor stem cell-based glioblastoma invasion model.</a> PloS One. 11 (7), e0158746(2016).</li>
<li>Marques-Torrejon, M. A., Gangoso, E., Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+glioblastoma+tumour-host+cell+interactions+using+adult+brain+organotypic+slice+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modelling glioblastoma tumour-host cell interactions using adult brain organotypic slice co-culture.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (2), 031435(2018).</li>
<li>Tamura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+spatiotemporal+dynamics+of+human+glioma+stem+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Visualization of spatiotemporal dynamics of human glioma stem cell invasion.</a> Molecular Brain. 12 (1), 45(2019).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+based+on+in+ovo+electroporation+for+chicken+embryonic+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture based on in ovo electroporation for chicken embryonic central nervous system.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 1813-1826 (2019).</li>
<li>Murrell, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+multipotent+stem+cells+from+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Expansion of multipotent stem cells from the adult human brain.</a> PloS One. 8 (8), e71334(2013).</li>
<li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+time-lapse+microscopy+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration.</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li>
<li>Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shell-less+culture+of+the+chick+embryo+as+a+model+system+in+the+study+of+developmental+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology.</a> Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).</li>
<li>Shoin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+assay+as+chemosensitivity+test+for+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chick embryo assay as chemosensitivity test for malignant glioma.</a> Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (5), 1643-1648 (2005).</li>
<li>Balciūniene, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+of+human+glioblastoma+transplanted+on+chicken+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina%22%5BJournal%5D)">Histology of human glioblastoma transplanted on chicken chorioallantoic membrane.</a> Medicina. 45 (2), 123-131 (2009).</li>
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<li>Jaworski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+tumor+morphology+and+structure+from+U87+and+U118+glioma+cells+cultured+on+chicken+embryo+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of tumor morphology and structure from U87 and U118 glioma cells cultured on chicken embryo chorioallantoic membrane.</a> Journal of Veterinary Research. 57 (4), 593-598 (2013).</li>
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<li>DeBord, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+as+a+versatile+patient-derived+xenograft+%28PDX%29+platform+for+precision+medicine+and+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research.</a> American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).</li>
<li>Han, J. M., Jung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+anticancer+effect+of+a+combination+of+berbamine+and+arcyriaflavin+A+against+glioblastoma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Synergistic anticancer effect of a combination of berbamine and arcyriaflavin A against glioblastoma stem-like cells.</a> Molecules. 27 (22), 7968(2022).</li>
<li>Ruiz-Ontañon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+confers+migratory+and+invasive+advantages+to+a+population+of+glioblastoma-initiating+cells+that+infiltrate+peritumoral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity confers migratory and invasive advantages to a population of glioblastoma-initiating cells that infiltrate peritumoral tissue.</a> Stem Cells. 31 (6), 1075-1085 (2013).</li>
<li>Cage, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+patterns+of+human+medulloblastoma+dissemination+in+the+developing+chick+embryo+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Distinct patterns of human medulloblastoma dissemination in the developing chick embryo nervous system.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 29 (4), 371-380 (2012).</li>
<li>Darrigues, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biobanked+glioblastoma+patient-derived+organoids+as+a+precision+medicine+model+to+study+inhibition+of+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biobanked glioblastoma patient-derived organoids as a precision medicine model to study inhibition of invasion.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10720(2021).</li>
</ol>

Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts.

Les étapes critiques du protocole pour l’injection de cellules dans le ventricule du mésencéphale (tectum optique) comprennent le fait de ne pas endommager les vaisseaux sanguins de la membrane chorio-allantoïdienne de l’œuf ou entourant l’embryon avant et pendant l’injection, bien que la membrane amnionique entourant immédiatement l’embryon puisse être doucement tirée et maintenue pour positionner la tête lors de l’injection des cellules dans le mésencéphale. L’amnion est relativement dur et peut être tiré avec une pince fine pour positionner la tête et la maintenir stable d’une main, pour l’injection de cellules de l’autre main dans le tectum optique, qui est la grande structure ronde au milieu du cerveau. Généralement, la viabilité des embryons injectés varie de 25% à 75%, en fonction de facteurs inconnus, et pratiquement chaque embryon qui survit contient au moins une petite tumeur dans le tectum optique. Les étapes critiques dans la génération de tranches de cerveau viables comprennent le buvard du tissu de l’excès de liquide afin que l’agarose adhère au cerveau pendant le découpage et pour garder les tissus et les tranches froids jusqu’à ce qu’ils soient placés sur l’insert membranaire. Comme différents types de cellules forment les sphéroïdes différemment (en vitesse et en taille), la densité cellulaire plaquée sur les plaques poly-HEMA et le temps avant la récolte des sphéroïdes doivent être optimisés pour chaque type de cellule.
Le travail ici n’a pas fait l’objet d’une étude longitudinale formelle de la viabilité des tranches de cerveau. Yang et al. ont utilisé des cultures de tranches de cerveau d’embryons de poussins similaires à celles utilisées ici et ont montré une bonne viabilité des tranches pendant au moins 7 jours16. Des travaux antérieurs ont montré que lorsque le tissu OT était conservé dans des milieux sous-optimaux, de nombreux noyaux pyknotiques apparaissaient dans le tissu, ce qui ne se produisait pas dans les tranches du travail ici. De plus, lorsque les tranches dégénèrent dans des conditions sous-optimales, les vaisseaux sanguins se fragmentent et apparaissent sous forme de rangées de sphères positives à la laminine (non représentées). Ainsi, bien que la viabilité ici n’ait pas été vérifiée par des méthodes telles que l’électrophysiologie ou l’expression active de la caspase-3, aucun des indicateurs de mort cellulaire observés dans des conditions de culture sous-optimales n’est apparu ici.
L’ergothérapie a été concentrée pour des expériences in vivo sur les tumeurs cérébrales parce que c’est la région la plus facilement injectable avec le plus gros ventricule. À E5, qui est le dernier jour où l’embryon est assez petit pour rester accessible au-dessus du jaune, les injections doivent être faites dans un ventricule, car toutes les régions du cerveau ne sont rien de plus qu’une mince zone ventriculaire. Néanmoins, ces injections aboutissent avec succès à des tumeurs intégrées avec des cellules qui envahissent le parenchyme cérébral. Parfois, les tumeurs résultantes se trouvent dans le cerveau antérieur ou le cervelet, mais ce n’est pas commun. Les tranches ex vivo de tectum optique E15 ont été principalement utilisées pour des expériences ici, de sorte que les résultats de co-culture ex vivo peuvent être corrélés avec les expériences d’injection in vivo . Cependant, les tranches du cerveau antérieur conviennent également et ont une plus grande surface et un ventricule très mince par rapport au tectum optique, ce qui pourrait rendre le cerveau antérieur plus approprié pour les co-cultures ex vivo qui ne sont pas corrélées avec des injections in vivo .
Il a été démontré ici que les injections in vivo , suivies d’une fixation tissulaire, d’une section vibrante de trancheuses de tissus et d’une immunocoloration de la laminine et d’autres marqueurs, ont abouti à des images à haute résolution de cellules GBM et de GSC dans les tissus cérébraux à proximité immédiate des vaisseaux sanguins. La capacité de déterminer les interrelations entre les cellules tumorales et les vaisseaux sanguins a été grandement facilitée par la création de rendus de volume 3D à partir de piles z de sections optiques confocales à l’aide du logiciel confocal et des instructions du fabricant. L’imagerie accélérée utilisant la microscopie à fluorescence à grand champ de cellules marquées GFP, mCherry et DiD était possible; Cependant, les cellules migrantes qui se trouvaient à proximité des sphéroïdes hautement fluorescents étaient parfois obscurcies par la « lueur » du sphéroïde. Cet effet indésirable peut être quelque peu minimisé en ajustant soigneusement les temps d’exposition pour la collecte d’images à grand champ. L’imagerie accélérée utilisant des piles z confocales au fil du temps (4D) a éliminé la lueur floue des sphéroïdes et a abouti à des cellules migratrices nettement définies avec un arrière-plan sombre. Cela n’a pas été décrit dans le protocole, mais a été réalisé de la même manière que l’imagerie accélérée à grand champ, qui a été réalisée alors que des tranches de cerveau étaient sur les inserts de membrane transparente dans une plaque en plastique à 6 puits. Bien que l’imagerie confocale en accéléré donne des images nettement plus claires des cellules individuelles et de leur comportement, une expérience en accéléré multipoint collectant des piles z de 10 plans z / point, à des intervalles de 10 minutes sur une période de 20 heures, est une utilisation intensive des galvanomètres à tête de balayage. Comme cela pourrait réduire considérablement la durée de vie des galvanomètres, cette méthode est utilisée judicieusement.
Bien que le système embryonnaire de poussin soit très approprié pour les expériences d’injection in vivo et de co-culture ex vivo qui étudient le comportement des cellules GBM, ce système modèle présente plusieurs limites. Comme pour tout système de xénogreffe, l’environnement dans lequel les cellules humaines sont implantées n’est pas le cerveau humain, mais le comportement des cellules GBM semble imiter celui des modèles de rongeurs et des patients humains. Après avoir effectué des expériences d’injection in vivo sur E5, les tumeurs sont normalement autorisées à se former pendant 10 jours, jusqu’à E15. Ce n’est clairement pas assez de temps pour étudier tous les aspects de la tumorigenèse et de l’invasion cellulaire. Cependant, il a été démontré ici que des tumeurs solides se forment dans le parenchyme cérébral, que les cellules interagissent et se réorganisent au sein de la tumeur, et qu’une invasion cérébrale significative se produit à la fois le long des vaisseaux sanguins et de manière diffuse dans ce laps de temps relativement court. Une autre limite du système embryonnaire in vivo de poussin est qu’il ne convient pas aux traitements médicamenteux ou autres en raison du grand jaune et du système circulatoire extraembryonnaire qui fonctionne pendant le développement de l’embryon de poussin. Les traitements médicamenteux liquides topiques entraîneraient une concentration très variable et inconnue dans le cerveau en raison de la diffusion loin de l’embryon dans la masse vitelline beaucoup plus grande. De même, l’injection intraveineuse de médicaments dans le système circulatoire extraembryonnaire très délicat fuirait ou diffuserait hors des vaisseaux sanguins et entraînerait également des concentrations inconnues dans le cerveau. C’est l’une des principales raisons pour lesquelles la méthode de culture ex vivo en tranches a été adoptée, afin que non seulement le comportement cellulaire puisse être observé et suivi par microscopie accélérée, mais aussi pour que les traitements qui ont réussi à modifier le comportement des cellules GBM dans une boîte4 puissent être testés dans un environnement de tissu cérébral plus pertinent.
Le développement du système modèle de tumeur cérébrale orthotopique de l’embryon de poussin est considéré comme un ajout important aux systèmes et outils disponibles pour l’étude de la formation de tumeurs GBM et du comportement cellulaire invasif. Les œufs de poule fécondés sont susceptibles d’être facilement disponibles dans la plupart des régions, ils sont peu coûteux par rapport aux rongeurs, il n’y a pas de coûts de soins aux animaux, les embryons sont très résistants et résistants aux infections (c.-à-d. que la plupart du travail est effectué sur une paillasse), les embryons sont hautement manipulables et peuvent être cultivés en culture sans coquille19, et les embryons de poussins ne sont pas considérés comme des animaux vertébrés et ne nécessitent donc pas l’approbation de l’IACUC par les directives des NIH (exigences institutionnelles peut varier). Ainsi, ces multiples avantages rendent le système embryonnaire de poussin très attractif si l’on limite leurs questions et expériences à celles qui en rentrent dans ses limites. Plusieurs études sur les cellules GBM ont été réalisées par d’autres en utilisant l’embryon de poussin, mais celles-ci ont presque exclusivement utilisé la membrane chorio-allantoïdienne (CAM) de l’embryon 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 et le bourgeon du membre 30, et non le cerveau. Il y a également eu un rapport implantant un médulloblastome dans le cerveau du poussin sur E231. Sans aucun doute, l’utilisation de l’embryon de poussin comme système modèle de xénogreffe orthotopique, comme décrit ici, devrait donner des résultats beaucoup plus significatifs pour la biologie tumorale du GBM humain que les études utilisant le CAM.
Bien que ces études aient seulement commencé à utiliser pleinement le système de modèle de tumeur cérébrale embryonnaire de poussin pour des études sur les cellules GBM humaines et le comportement de GSC, on espère que d’autres étendront les utilisations et trouveront d’autres applications potentielles. On pourrait imaginer que non seulement ce système découvrira des mécanismes qui régulent la formation de tumeurs GBM et le comportement cellulaire, mais permettra également des tests précliniques de médicaments et de substances spécifiques sur des cellules de patients spécifiques. Par exemple, si des cultures de tranches cérébrales étaient mises en place à l’avance, des cellules tumorales, des morceaux de résections tumorales chirurgicales ou des organoïdes GBM dérivés de patients32 pourraient être placés directement en co-culture ex vivo , et divers traitements pourraient être évalués en quelques jours. De même, des cellules de patients dissociées pourraient être injectées directement dans le mésencéphale E5 in ovo pour évaluer leur capacité à former des tumeurs et à envahir le parenchyme cérébral. Ainsi, on espère que les descriptions des méthodes et les résultats représentatifs ici faciliteront et encourageront une utilisation accrue de ce système hautement sous-utilisé pour la recherche sur le cancer du cerveau.

Les études in vitro des comportements des cellules cancéreuses sont souvent utilisées pour disséquer les mécanismes potentiels qui opèrent pendant le comportement plus complexe observé lors de la formation de tumeurs et de l’invasion cellulaire dans des modèles de xénogreffes in vivo. Par exemple, avec le glioblastome (GBM), des études in vitro ont révélé des mécanismes de la façon dont L1CAM fonctionne potentiellement pendant la formation de tumeurs et l’invasion cérébrale dans un nouveau modèle de tumeur cérébrale de xénogreffe d’embryon de poussin 1,2,3,4,5. Bien que les expériences in vitro et in vivo se complètent de manière utile, elles laissent un vide substantiel dans la façon dont les résultats peuvent être corrélés. Par exemple, les analyses mécanistes de la motilité des cellules GBM sur une boîte sont une situation hautement artificielle, et les modèles de xénogreffes in vivo ne peuvent révéler que des analyses statiques ponctuelles ou finales de la formation tumorale et du comportement cellulaire. Les études in vivo utilisant des rongeurs ou des embryons de poussins ne se prêtent pas facilement à la surveillance du comportement cellulaire alors que les cellules envahissent le tissu cérébral dans ces modèles de xénogreffes. Néanmoins, le modèle de xénogreffe d’embryon de poussin a démontré que la protéine d’adhésion L1CAM joue un rôle stimulant dans la capacité invasive des cellules GBM T98G humaines 2,5.
Une solution appropriée à ce problème peut être trouvée en faisant le pont entre les méthodes in vivo et in vitro à l’aide d’un modèle organotypique de culture de tranches de cerveau, appelé modèle ex vivo . Dans ce modèle ex vivo , le tissu cérébral vivant peut être maintenu à une épaisseur de plusieurs centaines de microns pendant quelques semaines, ce qui permet d’implanter des cellules cancéreuses, d’observer leur comportement dans les tissus réels au fil du temps, puis d’effectuer une analyse plus détaillée des marqueurs à la fin de l’expérience.
Une méthode de culture de tranches organotypiques populaire a consisté à cultiver une tranche de cerveau de plusieurs centaines de microns d’épaisseur sur une membrane poreuse translucide ou transparente, laissant le tissu exposé à l’air, tout en permettant aux milieux nutritifs de soutenir le tissu sous la membrane (voir Stoppini et coll.6). Différentes variantes de cette méthode ont été utilisées pour différentes études, y compris l’utilisation de différents milieux ou de différents inserts membranaires. Les différents inserts membranaires comprennent un insert membranaire poreux (0,4 μm) de diamètre dans une boîte de culture6 de 35 mm et des inserts de culture cellulaire (0,4 μm) pour les plaques6 puits 7. Les différents milieux comprennent 50% MEM/HEPES + 25% de sérum de cheval inactivé par la chaleur + 25% de solution saline équilibrée Hanks (HBSS)8, 50% de milieu sérique réduit + 25% de sérum de cheval + 25% HBSS9, ainsi que d’autres. Si une membrane translucide ou transparente est utilisée avec des cellules GBM marquées par fluorescence, ces cultures peuvent être imagées par le bas à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ inversé ou confocale 10,11,12,13,14,15.
Alors que de nombreux modèles in vivo de xénogreffe de tumeurs cérébrales orthotopiques et de cultures de tranches cérébrales organotypiques ex vivo ont été établis à l’aide de rongeurs, comme indiqué ci-dessus, l’embryon de poussin (Gallus gallus) a été sous-utilisé à ces fins. Cependant, il a été démontré que l’embryon de poussin peut être utilisé comme modèle de xénogreffe orthotopique in vivo pour l’étude de l’invasion du gliome humain et du rat 1,2,5. Les cellules xénogreffées dans le cerveau d’embryons de poussins ont présenté des schémas d’invasion similaires à ceux observés dans les modèles de rongeurs, ce qui renforce l’utilisation d’embryons de poussins comme modèle in vivo pour l’analyse des cellules tumorales GBM. Les embryons de poussins sont également peu coûteux, peuvent être plus facilement entretenus que les rongeurs (c.-à-d. dans leurs coquilles d’œufs dans un incubateur de laboratoire) et sont beaucoup plus faciles à travailler, ce qui en fait une option attrayante pour les études in vivo à court terme sur le GBM. Un article récent a décrit l’utilisation de cultures de tranches de cerveau d’embryons de poussins pour la formation et la croissance d’axones au cours du développement normal du cerveau où les tranches étaient viables pendant au moins 7 jours16. Cependant, l’utilisation de telles cultures de tranches de cerveau d’embryons de poussins pour l’analyse ex vivo du comportement des cellules GBM dans un environnement tissulaire fait défaut. Dans cet article, la transplantation de cellules GBM humaines et de cellules souches GBM (GSC) dans le cerveau embryonnaire précoce de poussin in vivo, ainsi que l’introduction de cellules GBM sur des cultures de tranches de cerveau d’embryons de poussins vivants ex vivo, sont décrites. Quelques exemples représentatifs des tumeurs résultantes et des modèles d’invasion cellulaire obtenus à partir de ces préparations sont également fournis.

<table><tbody><tr><td>Perforatrice à papier à trous carrés de 1 cm x 1 cm</td><td>Birabira</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stylo à biopsie de 1 mm</td><td>Robbins Instruments</td><td>20335</td><td></td></tr><tr><td>Plaque d’insertion à 6 puits (Corning Transwell)</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3450</td><td></td></tr><tr><td>9" Pipettes Pasteur jetables</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 24 puits</td><td>Corning Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-9</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1423-500</td><td>pour l’intégration de cerveaux fixes</td></tr><tr><td>IgG GAM conjugués à Alexafluor 488</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-605-146</td><td></td></tr><tr><td>IgG GAM conjugués à Alexafluor 647 Jackson</td><td> Immunoresearch</td><td>115-545-146</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>ReynoldsWrap</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-9518</td><td></td></tr><tr><td>anti-intégrine alpha-6 anticorps monoclonal GOH3</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-19622</td><td></td></tr><tr><td>anti-L1CAM anticorps monoclonal UJ127</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53386</td><td></td></tr><tr><td>anti-laminine Hybridoma</td><td>Bank</td><td>3H11</td><td></td></tr><tr><td>anticorps monoclonal anti-nestine 10c2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927</td><td></td></tr><tr><td>anticorps monoclonal anti-Sox2 E-4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365823</td><td></td></tr><tr><td>Supplément de B27 sans vitamine A</td><td>GIBCO</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>bisbenzimide (Hoechst 33258)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2883</td><td>Coloration nucléaire</td></tr><tr><td>Incubateur de culture cellulaire Incubateur</td> CO<td>2 humidifié</td><td>Forma</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Nikon Instruments</td><td>C2si+</td><td>Avec chambre d’incubateur de cellules sur mesure</td></tr><tr><td>Microscope confocal Objectifs</td> Nikon <td>Instruments</td><td></td><td>Objectifs Plan Apo, sauf S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA Objectif pour l’imagerie confocale time-lapse Logiciel</td></tr> de <tr><td>microscope confocal</td><td>Nikon Instruments</td><td>NIS Elements</td><td>Version 5.2</td></tr><tr><td>Foreceps</td><td>incurvés World Precision Intruments</td><td>504478</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux courbes</td><td>Outils</td><td></td><td></td>de sciences fines</tr><tr><td>Spatule incurvée</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-375-20</td><td></td></tr><tr><td>Colle cyanoacrylate</td><td>Krazy Glue</td><td>KG-585 12R</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DiD far red fluorescent colorant</td><td>Invitrogen</td><td>V22887</td><td>Vybrant DiD</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate buffered salin (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>incubateur d’œufs</td><td>Ruban isolant Humidaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10 mil d’épaisseur/254 & micro ; m)</td><td>Scotch</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol 200 proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Vert rapide Colorant FCF</td><td>Avocado Research Chemicals</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini Bio-products</td><td>900-108</td><td></td></tr><tr><td>papier filtre</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Dynarex</td><td>3353</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre pour micro-injection</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP228-1</td><td>pour milieux de montage</td></tr><tr><td>Cellules souches de glioblastome humain (CSG)</td><td>Sans objet</td><td></td><td>Isolé à partir d’échantillons de GBM de patient dans un laboratoire Galileo dans un milieu de CSG, puis transduit avec une GFP codant pour un vecteur lentiviral.&nbsp ; Les cellules utilisées se trouvaient entre le passage 10 et 30.</td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée Hanks (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hémacytomètre</td><td>Hausser scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2524-100</td><td></td></tr><tr><td>Tampon HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval (HI)</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Humain FGF-2</td><td>BioVision</td><td>4037-1000</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&alpha humain ;</td><td>BioVision</td><td>4339-1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à contraste de phase inversé</td><td>Nikon Instruments</td><td>TMS</td><td>pour l’observation de routine de cellules cultivées</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Film de laboratoire</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labquake Shaker</td><td>LabIndustries</td><td>T400-110</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut :Pen :Strep</td><td>Gemini Bio-products</td><td>400-110</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1360</td><td>pour l’intégration de cerveaux vivants</td></tr><tr><td>Matrix</td><td>Corning Matrigel</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>GIBCO</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Bloc vibratome métallique Pointes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de micropipette (20, 200, 1 000 & micro ; L)</td><td>Micropipettes Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(20, 200, 1 000 & micro ; L)</td><td>Verre</td> de protection de microscope Gilson <td></td><td></td></tr><tr><td>(n° 1,5 d’épaisseur)</td><td>Fisherbrand</td><td>12544A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 + H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Millipore Sigma</td><td>526-M</td><td></td></tr><tr><td>N-propyl gallate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3130</td><td>pour support de montage</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>Crayon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope ordinaire</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Plastique 35 mm Boîte de Pétri</td><td>Becton Dickinson</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>picopompe pneumatique</td><td>World Precision Intruments</td><td>PV830</td><td></td></tr><tr><td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)&nbsp ; (poly-HEMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3932</td><td></td></tr><tr><td>lame de rasoir - double tranchant</td><td>PACE</td><td></td><td>pour couper des tranches de cerveau fixes couteau</td></tr><tr><td>saphir</td><td>Delaware Diamond Knives</td><td></td><td>pour couper des tranches de cerveau vivant</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>TruMed</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de cacodylate de sodium 0,2 M pH 7,4</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’échantillon pour vibratome</td> Microscope stéréo de dissection <td>sur</td><td></td><td></td>mesure</tr> Nikon <tr><td></td><td>Instruments</td><td>SMZ1500</td><td>Équipé d’une épifluorescence</td></tr><tr><td>foreceps droits World</td><td>Precision Intruments</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>de ciseaux droits</td><td>Outils de sciences</td><td></td><td></td>fines</tr><tr><td>Sucrose</td><td>Mallinckrodt</td><td>7723</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence time-lapse microscope (fluorescence à champ large)</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000-E</td><td>Avec chambre d’incubation cellulaire sur mesure (voir Fotos et al., 2006)</td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire en polystyrène 100 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130182</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire en polystyrène 60 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>353004</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Pipette de transfert</td><td>American Central Scientific Co.</td><td>FFP011</td><td></td></tr><tr><td>Ruban transparent</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine (0,25 %) + 2,21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>U-118 MG lignée cellulaire GBM humaine</td><td>ATCC</td><td>HTB-15</td><td>Les cellules ont été transduites avec un vecteur lentiviral codant pour la séquence entière de l’ectodomaine de la protéine d’adhésion L1CAM, puis avec un vecteur lentiviral pEncodage ultra-chaud mCherry.&nbsp ; Le nombre de passages est inconnu.</td></tr><tr><td>Pompe à vide</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07532-40</td><td>"Air Cadet"</td></tr><tr><td>Trancheuse vibrante</td><td>à tissus Vibratome</td><td>3000</td><td>pour la découpe de tranches de cerveau vivantes et fixes</td></tr></tbody></table>

utilisation du cerveau de l’embryon de poussin comme modèle pour les analyses in vivo et ex vivo du comportement des cellules de glioblastome humain

Using the Chick Embryo Brain as a Model for In Vivo and Ex Vivo Analyses of Human Glioblastoma Cell Behavior

L’embryon de poussin a été un système modèle idéal pour l’étude du développement des vertébrés, en particulier pour les manipulations expérimentales. L’utilisation de l’embryon de poussin a été étendue pour étudier la formation de tumeurs cérébrales du glioblastome humain (GBM) in vivo et le caractère invasif des cellules tumorales dans les tissus cérébraux environnants. Les tumeurs GBM peuvent être formées par injection d’une suspension de cellules marquées par fluorescence dans le ventricule du mésencéphale E5 (tectum optique) in ovo. 
Selon les cellules GBM, des tumeurs compactes se forment au hasard dans le ventricule et dans la paroi cérébrale, et des groupes de cellules envahissent le tissu de la paroi cérébrale. Des coupes de tissus épais (350 μm) de tecta E15 fixe avec des tumeurs peuvent être immunocolorées pour révéler que les cellules envahissantes migrent souvent le long des vaisseaux sanguins lorsqu’elles sont analysées par reconstruction 3D d’images confocales z-stack. Des tranches vivantes de cerveau moyen et antérieur E15 (250-350 μm) peuvent être cultivées sur des inserts membranaires, où des cellules GBM marquées par fluorescence peuvent être introduites dans des endroits non aléatoires pour fournir des co-cultures ex vivo pour analyser l’invasion cellulaire, qui peut également se produire le long des vaisseaux sanguins, sur une période d’environ 1 semaine. Ces co-cultures ex vivo peuvent être surveillées par microscopie à fluorescence large ou confocale pour observer le comportement des cellules vivantes. 
Les tranches co-cultivées peuvent ensuite être fixées, immunocolorées et analysées par microscopie confocale pour déterminer si l’invasion s’est produite le long des vaisseaux sanguins ou des axones. De plus, le système de co-culture peut être utilisé pour étudier les interactions cellule-cellule potentielles en plaçant des agrégats de différents types et couleurs cellulaires à différents endroits précis et en observant les mouvements cellulaires. Les traitements médicamenteux peuvent être effectués sur des cultures ex vivo , alors que ces traitements ne sont pas compatibles avec le système in ovo . Ces deux approches complémentaires permettent des analyses détaillées et précises du comportement des cellules GBM humaines et de la formation de tumeurs dans un environnement cérébral de vertébrés hautement manipulable.

Les embryons de poussins sont utilisés pour étudier les tumeurs cérébrales du glioblastome humain (GBM) en co-cultures ovo et ex vivo de tranches cérébrales. Le comportement des cellules GBM peut être enregistré par microscopie time-lapse dans des co-cultures ex vivo , et les deux préparations peuvent être analysées au point final expérimental par une analyse confocale 3D détaillée.

Utilisation du cerveau de l’embryon de poussin comme modèle pour les analyses in vivo et ex vivo du comportement des cellules de glioblastome humain

The chick embryo has been an ideal model system for the study of vertebrate development, particularly for experimental manipulations. Use of the chick ...

La portée de notre recherche est d’essayer de découvrir des mécanismes qui favorisent la propagation des cellules de glioblastome dans le tissu cérébral. Des questions spécifiques tournent autour des différences dans les types ou les états de cellules de glioblastome et les mécanismes moléculaires qui favorisent ces cellules à être hautement invasives. Par exemple, comment l’expression de L1CAM favorise-t-elle le caractère invasif?Les modèles in vitro et in vivo sont insuffisants pour analyser avec précision le comportement des cellules de glioblastome. Les modèles in vitro modifient presque certainement et simplifient à l’excès les comportements cellulaires in vivo. Bien que les modèles in vivo ne permettent pas une observation facile des comportements au fur et à mesure qu’ils se produisent, ils permettent plutôt des analyses après que les comportements se sont produits.Nous avons montré que le cerveau de l’embryon de poussin est un bon modèle pour étudier le comportement des cellules cancéreuses du cerveau humain à la fois in vivo et dans des cultures de tranches ex-vivo. Nous avons également établi que l’expression de L1CAM par les cellules de glioblastome peut avoir des effets profonds sur la prolifération, l’invasion et l’arrangement cellulaires dans la tumeur. Outre plusieurs avantages de l’utilisation d’embryons de poussins, notre protocole sphéroïde ex-vivo introduit des cellules sur des tranches vivantes sans dommages supplémentaires, alors que d’autres méthodes d’introduction cellulaire impliquent de percer le tissu et d’implanter des cellules.De plus, le protocole permet une imagerie en accéléré en direct que les techniques in vivo ne font pas. Nos résultats suggèrent que l’embryon de poussin est un bon modèle pour la recherche sur le cancer, en particulier le cancer du cerveau, et est extrêmement bénéfique pour la communauté scientifique, car il est beaucoup plus facilement accessible à ceux qui n’ont peut-être pas les fonds, les installations ou l’expertise pour les modèles de rongeurs. Nous continuerons de nous concentrer sur les mécanismes moléculaires qui contrôlent l’invasion des cellules de glioblastome dans les tissus cérébraux, en particulier le long des vaisseaux sanguins.Une autre question cruciale est de savoir si les cellules souches du glioblastome sont un phénotype distinct et stable ou un état fonctionnel qui peut être adopté en cas de besoin. Cela a d’énormes implications pour les traitements.

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Utilisation du cerveau de l’embryon de poussin comme modèle pour les analyses in vivo et ex vivo du comportement des cellules de glioblastome humain (Vidéo) | JoVE Journal

Utilisation du cerveau de l’embryon de poussin comme modèle pour les analyses in vivo et ex vivo du comportement des cellules de glioblastome humain

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