Name: Une méthode précise et quantifiable pour recueillir l’hémolymphe de petits arthropodes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 39 s
Description: Découvrez une méthode précise pour recueillir l'hémolymphe de petits arthropodes comme la cicadelle brune. Cette technique simple et économique permet d'étudier les interactions virus-vecteur et la transmission des arbovirus.

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Ce travail a été soutenu par le National Key R&D Program of China (No. 2022YFD1401700) et par la National Science Foundation of China (No. 32090013 et No. 32072385).

1. Élevage d’insectes
<ol><li>Augmenter les SBPH utilisés dans cette expérience dans les plants de riz (Oryza sativa cv. Nipponbare). Planter 20 plants de riz dans un incubateur (65 mm x 200 mm) et pousser à 25 °C sous une photopériode de 16 h de lumière / 8 h d’obscurité.</li>
</ol>2. Dissection des SBPH pour le prélèvement de l’hémolymphe
<ol><li>Mettez les SBPH dans un tube à centrifuger et placez-les dans un bain de glace pendant 10-30 min. REMARQUE: Ne placez pas les SBPH dans le bain de glace pendant moins de 10 minutes, sinon les insectes pourraient revivre.</li>
	<li>Placer une SBPH congelée sur une lame de verre (voir Tableau des matériaux) sous un stéréomicroscope (voir Table des matériaux) avec son abdomen tourné vers le haut. Ajustez la mise au point sur les six pattes de l’insecte.</li>
	<li>Préparez deux pinces à épiler de haute précision (voir Tableau des matériaux) avec des pointes ultra-fines. Utilisez une pince à épiler pour appuyer sur le corps de l’insecte afin de le maintenir en place, et utilisez l’autre pour retirer soigneusement l’une des pattes de l’insecte. REMARQUE: Pour les insectes à coquille dure, un scalpel ophtalmique peut être utilisé pour couper l’une des jambes.</li>
	<li>Appuyez doucement sur la poitrine de l’insecte avec une pince à épiler pour faire couler l’hémolymphe à travers la plaie. REMARQUE: L’hémolymphe se présente sous forme de gouttelettes transparentes sans flocule blanche visible. Jetez le lipide s’il y a de la flocule blanche, qui représente la contamination du corps gras.</li>
</ol>3. Prélèvement d’hémolymphe à l’aide de micropipettes
<ol><li>Préparez une micropipette. Placez un tube capillaire (voir le tableau des matériaux) d’un volume de 1 μL dans l’ampoule de la pipette (voir le tableau des matériaux). Pour des mesures précises, assurez-vous que la ligne d’échelle est visible. REMARQUE: Un petit trou présent sur le dessus de l’ampoule de la pipette est nécessaire.</li>
	<li>Lors de la collecte de l’hémolymphe, tenez le bulbe de la pipette de la micropipette et placez le tube capillaire près de la plaie de l’insecte. Recueillir l’hémolymphe exsudant de la plaie en touchant simplement l’extrémité du capillaire à l’hémolymphe.</li>
	<li>Boucher légèrement le petit trou sur le dessus de l’ampoule de la pipette avec le doigt pour arrêter le processus d’absorption lorsque le liquide à l’intérieur du tube capillaire atteint la ligne d’échelle souhaitée. REMARQUE : Prélever un échantillon de 1 μL d’hémolymphe sans cesse et rapidement pour éviter la contamination lipidique et le colmatage des tubes.</li>
	<li>Appuyez sur l’ampoule de la pipette pour évacuer l’hémolymphe recueillie dans 100 μL de tampon PBS (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/LNa2HPO4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4). REMARQUE: Le tube capillaire est inséré dans le tampon PBS.</li>
	<li>Passez à un nouveau tube capillaire lors du prélèvement d’un autre échantillon de 1 μL d’hémolymphe.</li>
</ol>4. Coloration Coomassie Blue
<ol><li>Prélever 3 échantillons d’hémolymphe de même volume (1 μL) de larves de 3e stade selon les protocoles décrits à l’étape 3, et déverser l’hémolymphe recueillie dans le tampon PBS pour obtenir un volume total de 100 μL.</li>
	<li>Ajouter 25 μL de tampon de charge protéique 5x (250 mmol/L de Tris-HCI [pH 6,8], 10 % P/V SDS, 0,05 % P/V de bleu de bromophénol, 50 % P/V de glycérol, 5 % P/V β-mercaptoéthanol) dans 100 μL des échantillons d’hémolymphe dilués, et chauffer pour dénaturer les protéines.</li>
	<li>Charger 20 μL des échantillons bouillis sur un gel protéique SDS-PAGE à 10 % (voir le tableau des matières) pour séparer les protéines.</li>
	<li>Colorer le gel dans une solution de Coomassie Blue (mélanger 1 g de Coomassie Brilliant Blue R-250 avec 250 mL d’isopropanol, 100 mL d’acide acétique glacial et 650 mL deddH2O, et filtrer les particules éventuelles à l’aide de papier filtre) pendant 1 h à température ambiante, puis décolorer le gel pendant 1 h avec une solution décolorante (100 mL d’acide acétique, 400 mL de méthanol, 500 mL deddH2O).</li>
</ol>5. Détermination de la concentration en protéines
<ol><li>Diluer 10 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 5 mg/mL, 2,5 mg/mL, 1,25 mg/mL, 0,625 mg/mL et 0,3125 mg/mL avec un tampon PBS en utilisant la méthode de dilution double.</li>
	<li>Aspirer 5 μL de tampon PBS et chaque concentration de solutions BSA à l’étape 5.1, ajouter 1 mL de 1x réactif colorant Bradford (voir Tableau des matériaux) et incuber pendant 5 min à température ambiante. Utilisez le tampon PBS dans le réactif de colorant Bradford comme témoin, et zéro à OD = 595 nm. Mesurez les valeurs d’absorbance de chacune des concentrations de protéines restantes et faites une courbe standard.</li>
	<li>Ajouter 1 μL d’hémolymphe provenant de SBPH larvaires, femelles ou mâles dans 100 μL de tampon PBS, puis centrifuger les échantillons à 1 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C pour éliminer les hémocytes.</li>
	<li>Aspirer 90 μL de surnageant dans un nouveau tube à centrifuger et mesurer les valeurs d’absorbance du surnageant conformément aux instructions de l’étape 5.2.</li>
	<li>Calculer les concentrations protéiques des échantillons d’hémolymphe selon l’équation de régression de la courbe standard. Inclure trois réplicats biologiques avec trois réplicats techniques dans les expériences.</li>
</ol>6. Détections microscopiques
<ol><li>Utilisez des micropipettes pour recueillir l’hémolymphe de 10 à 15 SBPH à différents stades de développement. Ajouter l’hémolymphe recueillie dans un tube contenant 20 μL de solution de paraformaldéhyde à 4 % (voir le tableau des matières). Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 min pour fixer l’hémolymphe.</li>
	<li>Pipeter 20 μL d’hémocytes fixes sur le centre d’une lame recouverte de silane (voir Tableau des matières).</li>
	<li>Sécher la gouttelette dans un séchoir à lames. REMARQUE: Évitez le séchage excessif.</li>
	<li>Couvrir l’échantillon avec le réactif antidécoloration à l’or 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (voir le tableau des matières) et inspecter la lame au microscope inversé (voir le tableau des matériaux).</li>
</ol>7. Quantification cellulaire
<ol><li>Prélever 1 μL d’hémolymphe des SBPH avec une micropipette et le dissoudre dans 20 μL de tampon PBS.</li>
	<li>Diluer les échantillons d’hémolymphe cinq fois avec un tampon PBS.</li>
	<li>Pipeter 20 μL de solution d’hémolymphe au centre de la chambre de comptage cellulaire (voir Tableau des matériaux). Couvrir la gouttelette avec un bordereau de couverture (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Comptez les cellules dans les cinq carrés de la chambre de comptage des cellules (figure supplémentaire 1), sous un microscope inversé (voir le tableau des matériaux). Inclure trois réplicats biologiques avec trois réplicats techniques dans chacune des expériences. Cellules/μL = numération totale de cinq carrés du milieu × 5 × facteur de dilution × 104</li>
</ol>8. Analyses statistiques
<ol><li>Effectuer des analyses statistiques avec le logiciel correspondant (voir Tableau des matières). Créez un nouveau fichier, sélectionnez la colonne, importez les données et générez un nuage de points avec une barre.</li>
	<li>Calculez la moyenne et l’écart type pour chaque groupe de données à l’aide de statistiques sur colonne et utilisez un outil d’ANOVA unidirectionnel pour évaluer la signification des différences entre les groupes. Déterminez la moyenne et l’écart-type de trois répétitions biologiques à l’aide de trois expériences indépendantes.</li>
</ol>

Collecte de l’hémolymphe sur de petits arthropodes

<ol><li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
<li>Ray, S., Casteel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector-mediated+plant-virus-vector+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Effector-mediated plant-virus-vector interactions.</a> Plant Cell. 34 (5), 1514-1531 (2022).</li>
<li>Islam, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-insect+vector-virus+interactions+under+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Plant-insect vector-virus interactions under environmental change.</a> Science of the Total Environment. 701, 135044(2020).</li>
<li>Cory, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+virus+transmission%3A+Different+routes+to+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Insect virus transmission: Different routes to persistence.</a> Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).</li>
<li>Wang, X. W., Blanc, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+transmission+of+plant+single-stranded+DNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses.</a> Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).</li>
<li>Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antimicrobial+peptides+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Insect antimicrobial peptides and their applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).</li>
<li>Liu, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+interaction+between+a+plant+virus+and+its+vector+insect+reveals+new+functions+of+hemipteran+cuticular+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).</li>
<li>Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bee+hemolymph+metabolome%3A+A+window+into+the+impact+of+viruses+on+bumble+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees.</a> Viruses. 13 (4), 600(2021).</li>
<li>Jia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+mediated+transmission+of+persistently+transmitted+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses.</a> Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).</li>
<li>Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+and+vertical+transmission+of+West+Nile+Virus+by+Aedes+vexans+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).</li>
<li>Gadhave, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+frequency+of+horizontal+and+vertical+transmission+of+cucurbit+leaf+crumple+virus+in+whitefly+Bemisia+tabaci+Gennadius%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius.</a> Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).</li>
<li>Logan, R. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+and+horizontal+transmission+of+cell+fusing+agent+virus+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222(2022).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+transmission+of+a+plant+virus+is+mediated+by+vitellogenin+of+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949(2014).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).</li>
<li>Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antiviral+innate+immunity%3A+Pathways%2C+effectors%2C+and+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).</li>
<li>Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+hepatitis+B+virus+replication+by+interferons+and+Toll-like+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).</li>
<li>Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+dengue+virus+circumvents+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How dengue virus circumvents innate immunity.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2860(2018).</li>
<li>Gilliam, M., Shimanuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+of+hemolymph+of+the+larval+honey+bee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L).</a> Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909(2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant+virus+ensures+viral+stability+in+the+hemolymph+of+vector+insects+through+suppressing+prophenoloxidase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation.</a> mBio. 11 (4), e01453(2020).</li>
<li>Vidano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phases+of+maize+rough+dwarf+virus+multiplication+in+the+vector+Laodelphax+striatellus+%28Fall%C3%A9n%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén).</a> Virology. 41 (2), 218-232 (1970).</li>
<li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laodelphax+striatellus+Atg8+facilitates+Rice+stripe+virus+infection+in+an+autophagy-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner.</a> Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).</li>
<li>Zhang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+monooxygenases+CYP6AY3+and+CYP6CW1+regulate+Rice+black-streaked+dwarf+virus+replication+in+Laodelphax+striatellus+%28Fallen%29%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen).</a> Viruses. 13 (8), 1576(2021).</li>
<li>Ribeiro, C., Brehelin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+haemocytes%3A+What+type+of+cell+is+that%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Insect haemocytes: What type of cell is that.</a> Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).</li>
<li>Butolo, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+quality+method+for+hemolymph+collection+from+honeybee+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae.</a> PLoS One. 15 (6), e0234637(2020).</li>
<li>Nesa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+potential+of+a+ponericin-like+peptide+isolated+from+Bombyx+mori+L.+hemolymph+in+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Scientific Reports. 12 (1), 15493(2022).</li>
<li>Mahmoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-injected+Musca+domestica+larval+hemolymph%3A+Cecropin+upregulation+and+potential+anticancer+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect.</a> Molecules. 27 (5), 1570(2022).</li>
<li>Patton, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((salivary+gland%2C+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3894(2012).</li>
<li>Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolymph+amino+acid+variations+following+behavioral+and+genetic+changes+in+individual+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae.</a> Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).</li>
<li>Fiorotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disclosing+hemolymph+collection+and+inoculation+of+metarhizium+blastospores+into+Rhipicephalus+microplus+ticks+towards+invertebrate+pathology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59899(2019).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

L’hémolymphe est le milieu du système circulatoire chez les arthropodes, et les arbovirus ne peuvent envahir d’autres tissus d’arthropodes que s’ils sont capables de survivre à l’environnement hostile de l’hémolymphe. La collecte d’un échantillon d’hémolymphe de haute qualité est la première étape de l’étude des interactions vecteur-virus qui se produisent dans l’hémolymphe. Il a été rapporté que l’hémolymphe d’insecte peut être obtenue à partir de plusieurs sites sur le corps de l’insecte, y compris une plaie sur la pat...

Les virus animaux et végétaux peuvent être transmis par les arthropodes, et ces virus constituent une grave menace pour la santé humaine et causent d’énormes pertes économiques dans l’agriculture 1,2,3. Il est important de noter que l’hémolymphe des arthropodes, qui sert de système circulatoire et d’élément vital du système immunitaire chez les arthropodes, joue un rôle important dans la régulation de la transmission des arboviraux. Les virus acquis par les intestins des arthropodes ne sont transportés vers d’autres tissus qu’après avoir réussi à s’échapper de l’environnement hémolymphe indésirable 4,5,6,7. Le cycle de vie des virus dans l’hémolymphe arthropode implique la survie du virus dans le plasma fluide, l’entrée dans l’hémocyte et le transport vers d’autres tissus, et divers mécanismes d’interaction virus-vecteur se produisent dans l’hémolymphe 8,9,10,11,12. Par exemple, la transmission verticale du VRS par l’HBPS dépend d’une interaction moléculaire entre la protéine vitellogénine SBPH et la protéine de capside RSV (virus de la bande de riz)13,14. Certains virus peuvent échapper à la réponse immunitaire de l’hémolymphe en se liant à des facteurs vectoriels spécifiques15,16,17,18. Par conséquent, il est important d’étudier les interactions vecteur-virus dans l’hémolymphe des arthropodes pour mieux comprendre la transmission des arbovirus.
L’hémolymphe de certains petits insectes, tels que les cicadelles, les cicadelles et certains moustiques, est difficile à recueillir en raison de leur taille. Pour résoudre ce problème, plusieurs méthodes ont été développées pour recueillir l’hémolymphe, y compris l’insertion d’une aiguille de seringue directement dans le corps de l’insecte pour extraire un microvolume de l’hémolymphe, la collecte de l’exsudat du site de la plaie avec une pince à épiler à pointe fine et la centrifugation directe. Ces méthodes ont permis de mesurer les niveaux relatifs d’expression génique et les titres viraux dans l’hémolymphe 19,20,21. Cependant, une méthode efficace pour quantifier le volume de l’hémolymphe, qui est nécessaire pour le comptage des hémocytes, la quantification des protéines et l’analyse de l’activité enzymatique, n’est actuellement pas disponible pour ces petits insectes.
Le SBPH (small brown planthopper) est un type de petit insecte vecteur d’une longueur de corps d’environ 2-4 mm. Le SBPH est capable de transmettre une variété de virus végétaux, y compris le VRS, le virus nain rugueux du maïs et le virus nain strié noir de riz22,23,24. L’interaction entre l’HBP et le VRS a été étudiée en profondeur au cours de la dernière décennie. Pour faciliter le travail avec les SBPH, nous avons développé une méthode nouvelle et simple de collecte de l’hémolymphe. Cette méthode, basée sur le principe des forces capillaires, utilise un capillaire avec un repère d’écaille pour acquérir l’hémolymphe de l’insecte de manière précise et quantifiable. Cela nous permet de collecter efficacement un volume spécifique d’hémolymphe de petits insectes et d’étudier plus en détail l’environnement hémolymphe de petits vecteurs.

<table><tbody><tr><td>10 % SDS-PAGE Gel protéique</td><td>Bio-rad</td><td>4561035</td><td>Séparation et détection</td></tr><tr><td>des protéines 4 % paraformaldéhyde</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>Pour la fixation des cellules ou des tissus&nbsp ;</td></tr><tr><td>Réactif de colorant Bradford</td><td>Bio-rad</td><td>5000205</td><td>Détection de concentration en protéines</td></tr><tr><td>Capillaire</td><td>Hirschmann</td><td>9000101</td><td>Pour la collecte de l’hémolymphe</td></tr><tr><td>Chambre de comptage</td> cellulaire <td>ACMEC</td><td>AYA0810</td><td>Comptage des hémocytes</td></tr><tr><td>Lame</td><td>de verre Gitoglas</td><td>10127105A</td><td>Pour la rétention des insectes</td></tr><tr><td>Lame de verre recouverte de silane</td><td>Sigma</td><td>S4651-72EA</td><td>Pour la conservation d’échantillons de microscope</td></tr><tr><td>Réactif anti-décoloration en or avec DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>Coloration du noyau</td></tr><tr><td>Verre de couverture du microscope</td><td>Gitoglas</td><td>10212424C</td><td>Pour l’observation microscopique</td></tr><tr><td>Poire de pipette</td><td>Hirschmann</td><td>9000101</td><td>Pour la collecte de l’hémolymphe</td></tr><tr><td>Logiciel Prism 8.0 Logiciel</td><td>GraphPad</td><td>/</td><td>Analyses statistiques</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>Pour la dissection d’insectes</td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>Tianld</td><td>P5622</td><td>Pour la dissection</td></tr><tr><td>d’insectes Microscope inversé Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>Observer Z1</td><td>Observation des hémocytes</td></tr></tbody></table>

une méthode précise et quantifiable pour recueillir l’hémolymphe de petits arthropodes

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

Les arthropodes sont connus pour transmettre une variété de virus d’importance médicale et agricole par leur hémolymphe, qui est essentielle à la transmission du virus. La collecte d’hémolymphe est la technologie de base pour étudier les interactions virus-vecteur. Ici, nous décrivons une méthode nouvelle et simple pour la collecte quantitative de l’hémolymphe de petits arthropodes en utilisant Laodelphax striatellus (la petite cicadelle brune, SBPH) comme modèle de recherche, car cet arthropode est le principal vecteur du virus de la bande du riz (VRS). Dans ce protocole, le processus commence par pincer doucement une jambe de l’arthropode congelé avec une pince à épiler à pointe fine et presser l’hémolymphe hors de la plaie. Ensuite, une micropipette simple composée d’un capillaire et d’un bulbe de pipette est utilisée pour recueillir l’hémolymphe transsudative de la plaie selon le principe des forces capillaires. Enfin, l’hémolymphe recueillie peut être dissoute dans un tampon spécifique pour une étude plus approfondie. Cette nouvelle méthode de collecte de l’hémolymphe de petits arthropodes est un outil utile et efficace pour la poursuite des recherches sur les arbovirus et les interactions vecteur-virus.

Modèle de micropipette et collecte d’hémolymphe Nous avons développé une micropipette simple dont l’action est basée sur les forces capillaires du tube capillaire. La micropipette est composée d’un tube capillaire et d’une ampoule de pipette (Figure 1A). Les tubes capillaires sont disponibles en différentes tailles de volume allant de 1 μL à 20 μL, et les volumes de tubes capillaires sont sélectionnés en fonction des exigences. Les tubes capillaires avec des volumes plus ...

Nous décrivons une méthode pour recueillir efficacement l’hémolymphe quantifiable de petits arthropodes pour une analyse ultérieure.

Une méthode précise et quantifiable pour recueillir l’hémolymphe de petits arthropodes

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus ...

Nos recherches portent sur les arbovirus, les insectes et les interactions entre les plantes. L’obtention d’échantillons d’hémolymphe de petits arthropodes présente un défi technique pour la recherche sur les maladies transmises par les insectes. Ce protocole montre une technique précise et quantifiable pour contrer ce problème.Les développements récents de la recherche sur la transmission des arbovirus ont révélé que les virus peuvent manipuler plusieurs facteurs vectoriels importants pour franchir la barrière de l’hôte. Ce protocole est une technique simple, rentable et précieuse qui permet une quantification précise de l’hémolymphe. Cette méthode offre également une technologie précieuse pour démarrer les interactions entre les virus et les vecteurs.Nos recherches à venir porteront sur la compréhension des mécanismes moléculaires de la transmission des virus par les insectes vecteurs tout en explorant et en améliorant de nouvelles techniques opérationnelles.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Le crabe fer à cheval, américains, Limulus polyphemus, est sans doute la source la plus commode pour les grandes quantités de sang de tous les invertébrés. Le sang est simple dans sa composition, avec un seul type cellulaire dans la circulation générale, le Amébocytes granulaire, et seulement trois protéines abondantes dans le plasma, l'hémocyanine, les protéines C-réactive, et α2-macroglobuline. Le sang est recueilli par le cœur et les cellules du sang et le plasma sont séparées par...

Collecte de sang du crabe américaine Horseshoe, Limulus Polyphemus

Signalisation de l'insuline conservées voies trouvés dans la mouche des...

Injection d&#39;insuline et d&#39;extraction hémolymphe pour mesurer la sensibilité d&#39;insuline dans les adultes Drosophila melanogaster</em

Une méthode précise encore simplifiée pour collecter et tacher hémocytes de moustique est décrite. Notre méthode combine la simplicité de la perfusion avec la précision des techniques d'injection élevée pour isoler les préparatifs propre de hémocytes de moustiques du genre Aedes. Cette méthode facilite la connaissance des études nécessitant des types d'hémocytes et leur abondance.

Un protocole pour le recueil et la coloration hémocytes du moustique Fièvre jaune Aedes aegypti</em

Hémocytes d'insectes effectuer de nombreuses fonctions importantes, tant immunitaires et non immunitaires, à tous les stades de développement des insectes. Notre connaissance actuelle des types hémocytaires et de la fonction provient d'études sur les insectes des modèles génétiques. Ici, nous présentons une méthode pour l'extraction, la quantification et la visualisation des hémocytes des chenilles sauvages.

Un protocole simple pour extraire l&#39;hémocytes de chenilles sauvages

L’hémolymphe de la drosophile sert à la fois de sang et de liquide interstitiel, circulant dans tout le corps pendant les stades larvaire et adulte. Cette vidéo décrit un protocole de collecte de l’hémolymphe larvaire afin de quantifier les cellules circulantes.

Rupture des cuticules : une méthode pour collecter l’hémolymphe des larves de drosophile

Cette vidéo montre le test de perturbation des hémocytes, évaluant la réadhésion des hémocytes dans les poches hématopoïétiques des larves de drosophile. Les perturbations mécaniques libèrent des hémocytes résidents, ce qui augmente le nombre d’hémocytes circulants. Après la guérison, la réadhésion des hémocytes résidents est confirmée, illustrant la réversibilité.

Un test de perturbation des hémocytes pour évaluer la réadhésion des hémocytes aux poches hématopoïétiques

Les cellules sanguines de la drosophile, ou hémocytes, circulent entre les sites résidents et la circulation.  Chez la larve, les hémocytes résidents (sessiles) se localisent dans des microenvironnements inductifs, les poches hématopoïétiques, tandis que les hémocytes circulants se déplacent librement dans l’hémolymphe. L’objectif de ce protocole est l’isolement et la quantification standardisés de ces deux populations d’hémocytes, distinctes sur le plan comportemental mais interchangeables.

Dosage des populations de cellules de sang de la<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larve

Systèmes hématopoïétiques de mammifères Drosophila et partagent de nombreuses caractéristiques communes, ce qui rend la drosophile un modèle génétique attrayant pour étudier l' hématopoïèse. Ici, nous démontrons la dissection et montage du principal organe hématopoïétique larvaire pour l'immunohistochimie. Nous décrivons également des méthodes pour analyser différents compartiments hématopoïétiques larvaires dont hémocytes circulants et des cellules à cristaux sessiles.

Méthodes pour examiner la lymphe et Gland hémocytes dans<em&gt; Drosophila</em&gt; larves

Cette méthode montre comment visualiser invasion de pathogènes dans les cellules d’insectes avec des modèles tridimensionnels (3D). Hémocytes de larves de drosophile étaient infectées par des pathogènes virus ou bactériens, ex vivo ou in vivo. Hémocytes infectés ont été ensuite fixe et teintés d’imagerie avec un microscope confocal et la reconstruction cellulaire 3D ultérieure.

Extraction des hémocytes de larves de drosophile d’Infection microbienne et d’analyse

L’analyse de l’hémolymphe des tiques représente une source importante d’information sur la façon dont certains agents pathogènes causent la maladie et comment les tiques réagissent immunologiquement à cette infection. La présente étude montre comment inoculer les propagules fongiques et recueillir l’hémolymphe des femelles de Rhipicephalus MICROPLUS engorgés.

Divulgation de la collection d’hémolymphe et inoculation des blastospores de Métarhizium dans les tiques de Rhipicephalus MICROPLUS vers les études de pathologie des invertébrés

Ce protocole décrit un test in vivo de phagocytose utilisé pour évaluer et quantifier la capacité des jeunes et âgés Drosophila melanogaster hémocytes aux bactéries phagocytose.

Évaluation de la capacité phagocytique spécifique à l’âge des hémocytes adultes de Drosophila melanogaster à l’aide d’un test de phagocytose in vivo

Découvrez une méthode précise pour recueillir l'hémolymphe de petits arthropodes comme la cicadelle brune. Cette technique simple et économique permet d'étudier les interactions virus-vecteur et la transmission des arbovirus.

Une méthode précise et quantifiable pour recueillir l’hémolymphe de petits arthropodes

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