Perturbation génique à haute efficacité dans les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse à l’aide de complexes d’ARNsg Cas9-sgRNA électroporés
4 août 2023
Ce protocole décrit la procédure d’édition du génome dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris à l’aide de complexes ribonucléoprotéiques Cas9-sgRNA assemblés in vitro et délivrés par électroporation.
Notre laboratoire étudie l’interaction entre la mycobactérie, la tuberculose et le système immunitaire de l’hôte, en mettant l’accent sur l’interaction initiale entre la bactérie et le macrophage. Il existe une variété de techniques de perturbation génique utilisées dans les macrophages, y compris les technologies ARNi et les technologies CRISPR. L’un des principaux défis est la faible efficacité de la perturbation génique dans les macrophages.
Ce protocole permet la manipulation génétique rapide et efficace des macrophages primaires sans avoir besoin de clonage et de construction de plasmides. Ces méthodes devraient être largement applicables en immunologie, permettant aux chercheurs de perturber les gènes dans les macrophages primaires pour un large éventail d’études.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode d'édition du génome dans des macrophages dérivés de moelle osseuse de souris en utilisant des complexes ribonucléoprotéiques Cas9-sgARN. Cette approche améliore l'efficacité de la manipulation génétique dans les macrophages primaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Génie génétique
- Biologie des macrophages
Contexte
- Les macrophages jouent un rôle crucial dans la réponse immunitaire.
- Les techniques de disruption génique sont essentielles pour l'étude des fonctions des macrophages.
- Les méthodes traditionnelles souffrent souvent d'une faible efficacité.
- Ce protocole permet de surmonter ces difficultés en rendant possible la manipulation génétique à haute efficacité.
Objectif de l'étude
- Améliorer l'efficacité de la disruption génique dans les macrophages primaires.
- Faciliter une manipulation génétique rapide sans étape de clonage.
- Proposer une méthode applicable à diverses études immunologiques.
Méthodes utilisées
- Assemblage in vitro de complexes ribonucléoprotéiques Cas9-sgARN.
- Délivrance de ces complexes par électroporation.
- Réglage de paramètres spécifiques pour l'électroporation (par exemple, 1 900 volts, 20 millisecondes).
- Application chez des macrophages primaires dérivés de moelle osseuse de souris.
Résultats principaux
- Démonstration d'une haute efficacité de disruption génique dans les macrophages.
- Permet une manipulation génétique rapide sans nécessiter de plasmides.
- Montre une applicabilité étendue à diverses recherches en immunologie.
Conclusions
- Ce protocole fournit une méthode fiable pour la manipulation génétique des macrophages.
- Il répond aux défis antérieurs liés à l'efficacité de l'interférence génique.
- Les chercheurs peuvent utiliser cette méthode pour diverses études en immunologie.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'invalidation efficace des gènes dans les macrophages dérivés de moelle osseuse primaires (BMDM) permet de surmonter un goulot d'étranglement critique dans la découverte de médicaments axée sur l'immunologie, en permettant une génomique fonctionnelle rapide et hautement fiable dans des cellules primaires pertinentes pour la maladie. La forte efficacité d'édition et le flux de travail simplifié de ce protocole soutiennent une validation robuste des cibles et une réduction des incertitudes mécanistiques aux points critiques de la phase précoce de découverte. Cette approche renforce la fiabilité prédictive pour le tri du portefeuille et accélère la traduction des connaissances génétiques en hypothèses thérapeutiques exploitables.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'interrogation directe de la fonction des gènes dans les macrophages primaires, soutenant la réduction des risques mécanistiques.
- Facilite la validation rapide de cibles thérapeutiques dans un système physiologiquement pertinent.
- Permet des études de perte de fonction hautement fiables pour la clarification des voies biologiques.
- Améliore la valeur prédictive pour les décisions stratégiques ultérieures du portefeuille.
Développement de tests et criblage
- Prépare des systèmes de cellules primaires validés pour des criblages phénotypiques en aval.
- Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs de perturbation génique pour la standardisation des tests.
- Permet des protocoles évolutifs, sans plasmide, adaptés à des campagnes de criblage itératives.
- Facilite une évaluation fiable des effets des composés sur des macrophages modifiés génétiquement.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne la manipulation génétique avec la biologie des macrophages pertinente pour la maladie afin d'assurer une continuité translationnelle.
- Facilite le développement de modèles précliniques utilisant des cellules primaires portant des modifications génétiques définies.
- Réduit le risque biologique en établissant un lien entre la découverte et la validation préclinique dans des systèmes primaires.
- Permet la découverte de biomarqueurs et des études mécanistiques dans les pipelines d'immunologie.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole CRISPR basé sur l'électroporation s'intègre aux stades précoces de la découverte et de la validation des cibles, permettant une progression fluide vers l'identification des candidats-médicaments et la recherche préclinique dans les pipelines axés sur l'immunologie.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et l'analyse de voies dans les macrophages primaires.
- Criblage : Fournit une disruption génique reproductible et quantitative, prête à l'emploi pour les tests.
- Analytique : Permet la mesure, basée sur le séquençage de Sanger, de l'efficacité d'édition pour la comparaison de conditions.
- Recherche translationnelle : Préserve la pertinence pathologique en utilisant des cellules primaires pour les études génétiques.
- Réutilisation en entreprise : Propose un protocole standardisé et largement applicable de manipulation génétique pour l'ensemble des projets en immunologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Rationalise les flux de travail avec une grande efficacité, une reproductibilité élevée et sans construction de plasmide.
- Valeur stratégique : Permet des décisions rapides d'aller/arrêt et une allocation des ressources efficiente en capital.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque et la progression des actifs en immunologie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des cellules primaires et l'assemblage des complexes RNP CRISPR.
- Requiert un accès à un équipement d'électroporation et à une infrastructure de séquençage de type Sanger.
- Exige une standardisation inter-équipes pour assurer la reproductibilité dans les études menées sur plusieurs sites.
- Une adaptation peut être nécessaire pour d'autres types ou espèces de cellules primaires.
- L'efficacité de l'édition et la viabilité doivent être validées empiriquement pour chaque gène ciblé.
