Name: Perturbation génique à haute efficacité dans les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse à l’aide de complexes d’ARNsg Cas9-sgRNA électroporés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: Découvrez une méthode d'édition génomique à haute efficacité dans les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse de souris en utilisant des complexes Cas9-sgRNA électroporés.

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Ce travail a été financé par la subvention 5R01AI144149 du NIH. Les figures schématiques ont été créées avec BioRender.

Un guide pour une perturbation génique précise dans les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse

<ol><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li>
<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis, and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+suppression+of+gene+expression+by+RNAi+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).</li>
<li>Laugel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+isogenic+cells+deficient+for+MR1+with+a+CRISPR%2FCas9+lentiviral+system%3A+Tools+to+study+microbial+antigen+processing+and+presentation+to+human+MR1-restricted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells.</a> The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).</li>
<li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+macrophages+and+J774+cells+respond+differently+to+infection+with+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis.</a> Scientific Reports. 7, 42225(2017).</li>
<li>Roberts, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9%2B+conditionally-immortalized+macrophages+as+a+tool+for+bacterial+pathogenesis+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond.</a> eLife. 8, e45957(2019).</li>
<li>Oberdoerffer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+RNA+interference+in+the+mouse+hematopoietic+system+varies+between+cell+types+and+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YTHDF2+orchestrates+tumor-associated+macrophage+reprogramming+and+controls+antitumor+immunity+through+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+engineering+in+human+cells+with+the+Cas9+RNA-guided+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> eLife. 2, e00471(2013).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766(2014).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).</li>
<li>Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+California%2C+Davis%22">University of California, Davis</a>. , Master's thesis (2022).</li>
<li>Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+of+primary+macrophages+with+in+vitro+transcribed+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA.</a> Journal of Visualized Experiments. (153), e60143(2019).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+delivery+of+Cas9+protein%2FgRNA+complexes+using+lipofectamine+CRISPRMAX%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX.</a> Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’édition du génome à l’aide de complexes d’ARNsg Cas9 électroporés permet de perturber efficacement la fonction des gènes dans les BMDM. L’efficacité de l’édition varie en fonction de la séquence cible et du gène. En règle générale, quatre à cinq ARNsg sont généralement criblés pour en identifier un qui est très actif. Certains loci ont une efficacité d’édition plus faible, probablement en raison de la structure de la chromatine. Dans ces cas, plusieurs modifications peuvent être apportées pour augmenter l’efficacité de...

Les macrophages sont des cellules immunitaires innées qui jouent un rôle essentiel dans la réparation des tissus et l’immunité 1,2. Les lignées cellulaires de macrophages immortalisées, telles que les cellules RAW 264.7 de souris ou les cellules humaines THP-1, présentent plusieurs caractéristiques bénéfiques, notamment une croissance robuste et une facilité de perturbation génique en délivrant des vecteurs d’interférence ARN ou CRISPR/Cas9 3,4. Cependant, la transformation oncogénique modifie considérablement leur physiologie, ce qui se traduit par l’activation aberrante de certaines voies et des réponses atténuées d’autres 5,6. Les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse (BMDM) récapitulent plus étroitement la physiologie des macrophages in vivo, mais restent difficiles à manipuler génétiquement en raison de la faible efficacité de la transfection plasmidique et de la transduction virale dans ces cellules immunitaires primaires 7,8. Il est donc nécessaire de mettre au point des méthodes plus efficaces pour perturber la fonction des gènes.
L’édition du génome CRISPR/Cas9 est un outil puissant pour la manipulation génétique dans une gamme de systèmes biologiques, y compris les cellules de mammifères 9,10,11,12. La protéine Cas9 de Streptococcus pyogenes clive efficacement et spécifiquement l’ADN double brin lorsqu’elle est complexée avec un ARN guide spécifique à la séquence. La réparation de l’ADN par la jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) de l’ADN clivé entraîne de petites insertions ou délétions (indels) qui créent des mutations de décalage de cadre. Dans les premières études, Cas9 et les ARNsg ont été administrés par des vecteurs plasmides ou lentiviraux, qui sont des méthodes d’administration efficaces pour de nombreuses lignées cellulaires 9,10. Cependant, les cellules primaires et, en particulier, les cellules immunitaires primaires sont souvent réfractaires à ces méthodes en raison de la faible efficacité de l’administration du vecteur par transfection ou transduction. Par la suite, des méthodes ont été développées pour générer des complexes ARNsg-Cas9 in vitro et les délivrer par électroporation, et ces méthodes ont atteint une grande efficacité dans une variété de types de cellules13,14. Les résultats ont suggéré la possibilité d’utiliser cette approche pour effectuer l’édition du génome dans les macrophages primaires.
Ici, nous fournissons un protocole pour l’utilisation des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) sgRNA-Cas9 pour effectuer l’édition du génome dans les BMDM primaires. Il contient des mesures pour atténuer l’activation des capteurs immunitaires présents dans les cellules immunitaires primaires et permet d’éditer jusqu’à 95 % des loci ciblés avec une toxicité minimale. Ce protocole comprend également des flux de travail permettant d’évaluer l’efficacité de l’édition à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) de routine et du séquençage de Sanger, suivis d’une analyse in silico par Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, un outil logiciel en ligne bien validé.

<table><tbody><tr><td>3T3-MCSF Lignée cellulaire</td><td>Don de Russell Vance</td><td>non applicable</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R Cas9 Amplificateur d’électroporation</td><td>IDT</td><td>1075915</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP Perles de réactif</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase alcaline intestinale de veau</td><td>NEB</td><td>M0525S</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DPBS +Ca/Mg (0,9 mM CaCl2 et 0.5mM MgCl2)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS -Ca/Mg</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>ExoI</td><td>NEB</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FCS)</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Herculase ADN polymérase & tampon</td><td>Agilent</td><td>600677</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 Kit de synthèse d’ARN à haut rendement</td><td>NEB</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>LoBind Tubes coniques 15 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30122216</td><td></td></tr><tr><td>LoBind Tubes Eppendorf 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer r2.1</td><td>NEB</td><td>B6002S</td><td></td></tr><tr><td>Système de transfection néon</td><td>Thermo Fisher</td><td>MPK5000, MPP100, MPS100</td><td></td></tr><tr><td>Système de transfection néon 10 uL Embouts</td><td>Thermo Fisher</td><td>MPK1025 ou MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>PBS + 1mM EDTA</td><td>Lonza</td><td>BE02017F</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Fisher</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart Buffer pour ExoI</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>Thermo Fisher</td><td>EO0384</td><td></td></tr><tr><td>Colorant de chargement d’ARN</td><td>NEB</td><td>B0363S</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>S. pyogenes Cas9-NLS</td><td>Macro Lab de l’Université de Californie</td><td>non applicable</td><td>Disponible pour les chercheurs non UC via https://qb3.berkeley.edu</td></tr><tr><td>S. pyogenes Cas9-NLS, IDT de 3e génération modifié</td><td></td><td>1081059</td><td></td></tr><tr><td>SAP</td><td>NEB</td><td>M0371S</td><td></td></tr></tbody></table>

perturbation génique à haute efficacité dans les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse à l’aide de complexes d’arnsg cas9-sgrna électroporés

High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes

Les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) provenant de souris sont un outil clé pour étudier la biologie complexe des macrophages tissulaires. En tant que cellules primaires, elles modélisent la physiologie des macrophages in vivo plus étroitement que les lignées cellulaires de macrophages immortalisées et peuvent être dérivées de souris déjà porteuses de modifications génétiques définies. Cependant, la perturbation de la fonction des gènes dans les BMDM reste techniquement difficile. Ici, nous fournissons un protocole pour l’édition efficace du génome CRISPR/Cas9 dans les BMDM, qui permet l’introduction de petites insertions et délétions (indels) qui entraînent des mutations de décalage de cadre qui perturbent la fonction des gènes. Le protocole décrit comment synthétiser des ARN à guide unique (ARNsg-Cas9) et former des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) ARNsg-Cas9 purifiés qui peuvent être délivrés par électroporation. Il fournit également une méthode efficace pour surveiller l’efficacité de l’édition à l’aide du séquençage de routine de Sanger et d’un programme d’analyse en ligne disponible gratuitement. Le protocole peut être effectué en 1 semaine et ne nécessite pas de construction de plasmide ; Il en résulte généralement une efficacité d’édition de 85 % à 95 %.

Le modèle IVT est un produit PCR de 127 pb (Figure 1B). Le produit IVT pleine longueur est un ARN de 98 nt, qui migre de la même manière qu’un fragment d’ADN double brin de 70 pb (Figure 1C).
Après électroporation, les cellules doivent être viables à &gt;90 %, avec un nombre total de cellules de &gt;70 % du nombre de cellules de départ. Le pool de cellules mutantes résultant devrait avoir un ensemble diversifié d’indels, commençant pr...

Ce protocole décrit la procédure d’édition du génome dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris à l’aide de complexes ribonucléoprotéiques Cas9-sgRNA assemblés in vitro et délivrés par électroporation.

Perturbation génique à haute efficacité dans les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse à l’aide de complexes d’ARNsg Cas9-sgRNA électroporés

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the ...

Notre laboratoire étudie l’interaction entre la mycobactérie, la tuberculose et le système immunitaire de l’hôte, en mettant l’accent sur l’interaction initiale entre la bactérie et le macrophage. Il existe une variété de techniques de perturbation génique utilisées dans les macrophages, y compris les technologies ARNi et les technologies CRISPR. L’un des principaux défis est la faible efficacité de la perturbation génique dans les macrophages.Ce protocole permet la manipulation génétique rapide et efficace des macrophages primaires sans avoir besoin de clonage et de construction de plasmides. Ces méthodes devraient être largement applicables en immunologie, permettant aux chercheurs de perturber les gènes dans les macrophages primaires pour un large éventail d’études.

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Gène ciblé d’édition à l’aide de CRISPR/Cas9 a grandement facilité la compréhension des fonctions biologiques des gènes. Ici, nous utilisons la méthodologie CRISPR/Cas9 à des mutations de la calréticuline modèle de cytokine-dépendante des cellules hématopoïétiques afin d’étudier leur activité oncogénique.

À l’aide de CRISPR/Cas9 gène édition pour étudier l’activité oncogénique de calréticuline mutante dans les cellules hématopoïétiques dépendant de Cytokine

Un protocole pour rapide CRISPR/Cas9-mediated disruption de génique chez la souris et des cellules hématopoïétiques humaines primaires est décrit dans cet article. Ribonucléoprotéines Cas9-sgRNA sont introduits par électroporation avec sgRNAs des vicitimes in vitro de transcription et commerciale Cas9. Édition de hautes efficacités sont réalisées avec peu de temps et de coût financier.

Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

Nous présentons ici un protocole visant à modifier génétiquement les cellules primaires ou agrandis humaines tueuses naturelles (NK) à l’aide de Cas9 ribonucléoprotéines (Cas9/RNP). En utilisant ce protocole, nous avons généré des cellules NK humaines déficients pour transformer le récepteur du facteur de croissance – b 2 (TGFBR2) et de l’hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Génération des cellules de knock-out primaire et élargi NK humaine à l’aide de Cas9 ribonucléoprotéines

Présenté ici est un protocole pour effectuer le temps et l'espace-limité gène knock-out dans les moelles épinières axolotl en injectant CAS9-gRNA complexe dans le canal central de la moelle épinière suivie d'électroporation.

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Les protocoles décrits pour l'édition génomique très efficace des cellules hématopoïétiques et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) par le système CRISPR/Cas9 pour développer rapidement des systèmes de modèle de souris avec des modifications génétiques hématopoïétiques spécifiques au système.

Modification du génome de Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated pour l'étude des cellules hématopoïétiques dans les modèles de maladie

Ce protocole utilise des rapporteurs fluorescents et le tri cellulaire pour simplifier les expériences d’entraînement dans les macrophages et les lignées cellulaires T. Deux plasmides sont utilisés pour ces expériences d’entraînement simplifiées, à savoir un plasmide exprimant CRISPR/Cas9 et DsRed2 et un plasmide donneur de recombinaison homologue exprimant EBFP2, qui est intégré en permanence au locus Rosa26 dans les cellules immunitaires.

Knock-in de gènes par CRISPR/Cas9 et tri cellulaire dans les lignées de macrophages et de lymphocytes T

La méthode présentée décrit la génération d’un gène knock-out médié par CRISPR dans la lignée H9 de cellules souches embryonnaires humaines (hESC), qui exprime de manière stable des sgRNA ciblant le gène L2HGDH à l’aide d’un système de distribution de gènes à médiation lentivirale très efficace.

Délétion de gène médiée par CRISPR-Cas9 dans des cellules souches pluripotentes humaines cultivées dans des conditions sans nourrisseur

La lignée cellulaire THP-1 est largement utilisée comme modèle pour étudier les fonctions des monocytes/macrophages humains dans divers domaines de recherche liés à la biologie. Cet article décrit un protocole pour une ingénierie efficace basée sur CRISPR-Cas9 et l’isolement de clones unicellulaires, permettant la production de données phénotypiques robustes et reproductibles.

Inactivation du gène CRISPR-Cas9 médiée par électroporation dans les cellules THP-1 et isolement de clones unicellulaires

Ici, nous décrivons les paramètres pour surveiller en parallèle la bioluminescence circadienne et l’activité sécrétoire des cellules d’îlots de Langerhans humains et des myotubes primaires. Pour cela, nous avons utilisé l’administration d’un gène lentiviral d’un rapporteur d’horloge à noyau de luciférase, suivie d’une synchronisation in vitro et d’une collecte du milieu d’écoulement par périfusion cellulaire continue.

Mesure parallèle d&#39;expression Circadian Clock génique et la sécrétion d&#39;hormones dans des cultures de cellules humaines primaires

Nous décrivons l’utilisation d’une plateforme d’expression génique multiplexée à haut débit qui quantifie l’expression génique en codant à barres et en comptant les molécules dans les substrats biologiques sans avoir besoin d’amplification. Nous avons utilisé la plateforme pour quantifier l’expression des microARN (miARN) dans le sang total chez des sujets avec et sans syndrome du côlon irritable.

Perturbations de circulation miARN dans le syndrome du côlon irritable détectée en utilisant un multiplexée à haut débit Gene Expression Plate-forme

Découvrez une méthode d'édition génomique à haute efficacité dans les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse de souris en utilisant des complexes Cas9-sgRNA électroporés.

Perturbation génique à haute efficacité dans les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse à l’aide de complexes d’ARNsg Cas9-sgRNA électroporés (Vidéo) | JoVE Journal

Perturbation génique à haute efficacité dans les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse à l’aide de complexes d’ARNsg Cas9-sgRNA électroporés

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