Name: Isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin à l’aide d’un dissociateur tissulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Découvrez l'isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin. Cette méthode améliore la reproductibilité pour la différenciation des adipocytes et la recherche sur l'obésité.

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Les auteurs tiennent à remercier Takahito Wada et Saiko Yoshida (Université de Tokyo, Tokyo, Japon) pour leur aide expérimentale. Ce travail a été financé par les subventions suivantes à Y.H.: subvention de recherche du programme Excellent Young Researcher de l’Université de Tokyo; Subvention KAKENHI de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) pour les scientifiques en début de carrière, numéro de subvention 19K17976; subvention pour le Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) de la Fondation japonaise pour l’enzymologie appliquée, numéro de subvention 17F005; subvention de la Pharmacological Research Foundation; subvention de la Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research; subvention de la Fondation MSD pour les sciences de la vie; subvention de la Daiwa Securities Health Foundation; subvention de la Tokyo Biochemical Research Foundation; Subvention de recherche en sciences de la vie de la Takeda Science Foundation; et subvention de la Fondation pour la recherche médicale SSENSHIN.

Toutes les expériences sur les animaux décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Tokyo et réalisées conformément aux directives institutionnelles de l’Université de Tokyo.
1. Préparation de la solution enzymatique et du milieu
<ol><li>Mettez les deux côtés du tissu adipeux blanc inguinal (côté droit et gauche, environ 150 mg) d’une souris âgée de 7 à 8 semaines et 2,5 mL de solution enzymatique dans le tube C du dissociateur.</li>
	<li>Reconstituer l’enzyme D avec 3 mL de milieu aigle modifié (DMEM)/F12 de Dulbecco sans sérum fœtal bovin (FBS) ni antibiotiques, l’enzyme R avec 2,7 mL de DMEM/F12 sans FBS ni antibiotiques, et l’enzyme A avec 1 mL de tampon A.</li>
	<li>Préparer 2,5 mL de solution enzymatique en ajoutant 100 μL d’enzyme D, 50 μL d’enzyme R, 12,5 μL d’enzyme A et 2,35 mL de DMEM/F12 sans FBS ni antibiotiques dans le tube C. Placer le tube C avec la solution enzymatique sur de la glace.</li>
</ol>2. Isolement du tissu adipeux
<ol><li>Euthanasier des souris C57BL/6J mâles âgées de 7 à 8 semaines (environ 20 g) par luxation cervicale.</li>
	<li>Sur un banc propre, pour isoler le tissu adipeux blanc inguinal, couper la peau avec des ciseaux émoussés / tranchants à l’abdomen et vers les membres inférieurs. Isolez le tissu adipeux de l’intérieur des cuisses à l’aide de ciseaux tranchants/tranchants. Un côté du tissu adipeux inguinal se comporte ~ 75 mg.</li>
	<li>Mettez le tissu adipeux isolé dans le tube C avec une solution enzymatique sur de la glace et maintenez le tube dans le banc propre pour maintenir la stérilité.</li>
</ol>3. Hacher et digestion du tissu adipeux
<ol><li>Au banc propre, ajouter 2,5 mL de solution enzymatique dans le tube C.</li>
	<li>Hacher le tissu adipeux en petits morceaux en coupant 50 fois avec des ciseaux tranchants / tranchants. Couper le tissu adipeux en ~2 mm2 morceaux.</li>
	<li>Fermez hermétiquement le capuchon du tube C, retournez le tube et fixez-le au manchon du dissociateur tissulaire avec le capuchon allumé. Ensuite, digérer l’échantillon pendant ~40 min à 37 °C. REMARQUE: Cette étude a utilisé un dissociateur d’octo doux MACS avec appareils de chauffage (Miltenyi Biotec 130-096-427), et le programme préinstallé « 37C_mr_ATDK_1 » a été suivi.</li>
</ol>4. Filtration de la suspension cellulaire
<ol><li>DMEM/F12 préchaud contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C.</li>
	<li>Détacher le tube C du dissociateur tissulaire et arrêter la digestion en ajoutant 5 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine et en pipetant doucement quatre fois.</li>
	<li>Centrifuger à 700 x g pendant 10 min à 20 °C.</li>
	<li>Aspirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille de cellule.</li>
	<li>Remettez la pastille en suspension en ajoutant 10 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine et en pipetant doucement cinq fois.</li>
	<li>Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 μm de diamètre placée sur un nouveau tube de 50 mL.</li>
	<li>Centrifuger à 250 x g pendant 5 min et remettre la pastille en suspension dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
</ol>5. Placage cellulaire
<ol><li>Centrifuger à 500 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille en ajoutant 10 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine et en pipetant dix fois.</li>
	<li>Déposer la suspension cellulaire sur une capsule enrobée de collagène de 10 cm et placer les plats dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5% CO 2) pendant1-2 h. REMARQUE: Les plats enrobés de collagène ne sont pas absolument nécessaires. Cependant, sur la base de l’expérience, les plats enrobés de collagène aident à l’adhérence des préadipocytes et augmentent ainsi la survie des cellules.</li>
	<li>Aspirer le milieu et laver les cellules deux fois avec 3 mL de PBS par lavage.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine et remettre les plats dans l’incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO2).</li>
</ol>6. Passage des préadipocytes
<ol><li>Le lendemain, aspirez le milieu (les cellules seront adhérentes, et donc le milieu peut être aspiré), laver les cellules deux fois avec 3 mL de PBS par lavage, et ajouter 10 mL de DMEM/F12 contenant 10% FBS et 1% de pénicilline-streptomycine.</li>
	<li>Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence (généralement 4 jours après l’isolement de SVF), divisez les cellules en quatre boîtes enrobées de collagène de 10 cm.<ol><li>Plus précisément, aspirez le milieu, lavez les cellules avec du PBS (température ambiante [RT]), ajoutez 1 mL de trypsine préchauffée à 0,05% et incuber pendant 5 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire.</li>
		<li>Ajouter 10 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine pour éteindre l’activité de la trypsine. Après pipetage, centrifuger à 440 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Aspirer le surnageant, remettre les cellules en suspension en ajoutant 40 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine, et placer les cellules dans quatre boîtes enduites de collagène de 10 cm.</li>
	</ol></li>
	<li>Passez à nouveau les cellules lorsqu’elles atteignent 80% de confluence.</li>
</ol>7. Préparation du rétrovirus exprimant le grand antigène T SV40 pour l’immortalisation des préadipocytes (facultatif)
<ol><li>Au moins 3 jours avant l’immortalisation, plaquer les cellules d’emballage en platine-E (Plat-E)29 à une densité de 3,0 x 105 cellules/mL dans 2 mL de DMEM avec 10% FBS sans antibiotiques. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.</li>
	<li>Le lendemain, transfecter 4 μg de pBABE-neo largeTcDNA (ajouter le plasmide du gène #1780) en utilisant Lipofectamine 2000, selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Après 24 h, aspirer le milieu et ajouter 2 mL de DMEM avec 10% FBS et 1% pénicilline-streptomycine.</li>
	<li>Le lendemain, récoltez le surnageant rétroviral. Le rétrovirus peut être utilisé pour l’immortalisation immédiate ou stocké à -80 °C.</li>
</ol>8. Immortalisation des préadipocytes avec le grand antigène T SV40 (facultatif)
<ol><li>Passage et expansion des préadipocytes deux fois après isolement de SVF.</li>
	<li>Plaquer les cellules dans des plaques à 6 puits à une densité de 0,5-1,0 x 104 cellules/mL dans 2 mL de DMEM/F12 avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.</li>
	<li>Le lendemain, préparer 250 μL de rétrovirus frais ou décongelé exprimant le grand antigène T SV40 par puits des plaques à 6 puits. Centrifuger à 440 x g pendant 5 min et placer le surnageant dans un tube neuf.</li>
	<li>Ajouter 750 μL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine et 1 μL de polybrene par 250 μL de surnageant rétroviral pour fabriquer le virus fonctionnel.</li>
	<li>Aspirer le milieu et ajouter 1 000 μL du rétrovirus fonctionnel à chaque puits contenant des préadipocytes.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de DMEM/F12 avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine 4 h plus tard.</li>
	<li>Le lendemain, séparer les préadipocytes infectés dans une boîte de 10 cm et sélectionner les cellules infectées avec DMEM/F12 contenant 10% FBS, 1% pénicilline-streptomycine et 500 μg/mL de néomycine. Pour surveiller la sélection des antibiotiques, préparez un plat de cellules non infectées avec de la néomycine.</li>
	<li>Continuez à faire passer les cellules infectées avec de la néomycine jusqu’à ce que toutes les cellules non infectées dans la boîte de moniteur soient mortes.</li>
</ol>9. Différenciation des adipocytes
<ol><li>Plaquez les cellules. Pour les plaques à 12 puits, plaquer les cellules à une densité de 4,0 x 104 cellules/mL dans 1 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine.</li>
	<li>Lorsque les préadipocytes deviennent confluents (48-72 h après le placage), aspirer le milieu et le remplacer par un milieu de différenciation (voir tableau 1 pour la composition).</li>
	<li>Au jour 2 de la différenciation (c.-à-d. 48 h après avoir induit la différenciation), remplacer le milieu par un milieu d’entretien (voir le tableau 1 pour la composition). Ensuite, changez le support d’entretien tous les 2 jours. La différenciation terminale est réalisée au jour 7 de la différenciation.</li>
	<li>Coloration rouge huile o<ol><li>Pour la coloration au rouge huile, aspirer le milieu et rincer les cellules avec 1 mL de PBS par puits. Fixez les cellules en ajoutant 1 mL de formaldéhyde à 4 % par puits, et incuber les cellules pendant 15 min à TA.</li>
		<li>Pendant l’incubation, diluer la solution mère d’huile rouge à 0,5 % (dans de l’alcool isopropylique) à 0,3 % à l’aide deddH2Oet filtrer la solution de travail à l’aide d’un papier filtre.</li>
		<li>Après les 15 min d’incubation, retirer le formaldéhyde, rincer les cellules avec de l’alcool isopropylique à 60%, ajouter 1 mL d’huile filtrée rouge o solution de travail, et incuber pendant 1 h à TA.</li>
		<li>Après l’incubation, lavez les cellules à l’eau courante. Ensuite, observez les adipocytes chargés de lipides sous un microscope inversé (grossissement : objectif 20x et oculaire 10x).</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse de l’expression de l’ARNm REMARQUE : Veuillez consulter le tableau 2 pour obtenir la liste des amorces utilisées dans la présente étude.<ol><li>Aspirer le milieu et ajouter 1 mL/puits de trizol au puits.</li>
		<li>Incuber pendant 15 min à TA, détacher les cellules par pipetage et recueillir les échantillons dans des tubes de 1,5 mL. Les échantillons peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à l’extraction de l’ARN.</li>
		<li>Décongeler l’échantillon congelé à TA, ajouter 200 μL de chloroforme à l’échantillon et agiter vigoureusement pendant 15 s.</li>
		<li>Incuber l’échantillon à TA pendant 3 min, puis tourner à 20 000 x g pendant 15 min à 4 °C.</li>
		<li>Retirer délicatement la phase aqueuse (supérieure, incolore) et transférer dans de nouveaux tubes. Ne transférez jamais la phase protéique (moyenne, blanche) ou la phase phénol/chloroforme (en bas, rose).</li>
		<li>Ajouter lentement un volume égal de 70% d’EtOH et mélanger délicatement. Ne pas vortex.</li>
		<li>Chargez l’échantillon (jusqu’à 700 μL) dans une colonne de spin d’ARN placée dans un tube de collecte. Assurez-vous d’inclure tout précipité qui pourrait s’être formé.</li>
		<li>Faire tourner à 9 000 x g pendant 30 s à 4 °C, puis jeter l’écoulement.</li>
		<li>Ajouter 700 μL de tampon RW1, faire tourner à 9 000 x g pendant 30 s à 4 °C, puis jeter l’écoulement.</li>
		<li>Transférer la colonne dans un nouveau tube collecteur et ajouter 500 μL de tampon RPE.</li>
		<li>Faire tourner à 9 000 x g pendant 30 s à 4 °C, puis jeter l’écoulement.</li>
		<li>Ajouter 500 μL de RPE tampon, faire tourner à 9 000 x g pendant 2 min à 4 °C, puis jeter l’écoulement.</li>
		<li>Transférer la colonne dans un nouveau tube collecteur et faire tourner (colonnes sans tampon) à 9 000 x g pendant 1 à 2 min à 4 °C.</li>
		<li>Transférer la colonne dans un nouveau tube collecteur de 1,5 mL et ajouter 30 μL d’eau exempte de RNase directement sur la membrane de la colonne.</li>
		<li>Incuber l’échantillon à TA pendant 1-2 min. Ensuite, faire tourner à 9 000 x g pendant 1 min à 4 °C pour éluer l’ARN.</li>
		<li>Vérifiez la concentration d’ARN à l’aide d’un fluorospectromètre. REMARQUE: Il est recommandé d’aligner la concentration ici.</li>
		<li>Effectuer une transcription inverse en utilisant ~200 ng de modèle d’ARN. Utilisez un kit commercial de réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qPCR-RT) et suivez le protocole du fabricant. Après la réaction, diluer l’ADNc 20 fois à 200 μL.</li>
		<li>Ajouter 2,0 μL d’ADNc, 3,0 μL de Power Sybr Green Master Mix, 0,018 μL d’amorce directe qPCR 100 μM, 0,018 μL d’amorce inversée qPCR 100 μM et 0,96 μL de ddH2O à chaque puits d’une plaque de 384 puits.</li>
		<li>Exécuter une qPCR (maintien : 50°C pendant 2 min et 95°C pendant 2 min ; Phase PCR : 40 cycles de 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 1 min ; stade de courbe de fusion : 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 1 min et 95 °C pendant 15 s). Utilisez la méthode de la courbe standard pour la quantification.</li>
	</ol></li>
</ol>

Isolement semi-automatisé de tissu adipeux blanc murin

<ol><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li>
<li>Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+expression+of+tumor+necrosis+factor-alpha%3A+direct+role+in+obesity-linked+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance.</a> Science. 259 (5091), 87-91 (1993).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+of+the+mouse+obese+gene+and+its+human+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.</a> Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).</li>
<li>Kajimura, S., Saito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+in+brown+adipose+tissue+biology%3A+Molecular+control+of+brown+fat+development+and+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis.</a> Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li>
<li>Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+obesity%3A+from+discovery+to+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of obesity: from discovery to biology.</a> Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).</li>
<li>Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bigger+picture+of+FTO-the+first+GWAS-identified+obesity+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene.</a> Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).</li>
<li>Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+obesity+variant-exercise+interaction+on+changes+in+body+weight+and+BMI%3A+The+Taiwan+biobank+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+activity+attenuates+the+genetic+predisposition+to+obesity+in+20%2C000+men+and+women+from+EPIC-Norfolk+prospective+population+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study.</a> PLoS Medicine. 7 (8), e1000332(2010).</li>
<li>Claussnitzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+obesity+variant+circuitry+and+adipocyte+browning+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).</li>
<li>Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+adipogenesis+in+fibroblasts+by+PPAR+gamma+2%2C+a+lipid-activated+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor.</a> Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).</li>
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<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM16+controls+a+brown+fat%2Fskeletal+muscle+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch.</a> Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).</li>
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<li>Shapira, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBF2+transcriptionally+regulates+brown+adipogenesis+via+the+histone+reader+DPF3+and+the+BAF+chromatin+remodeling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex.</a> Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).</li>
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<li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIA+differentially+controls+adipogenic+and+myogenic+gene+program+through+distinct+pathways+to+ensure+brown+and+beige+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation.</a> PLoS Genetics. 16 (9), e1009044(2020).</li>
<li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIA+determines+the+cis-effect+of+genetic+variation+on+Ucp1+expression+in+murine+thermogenic+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes.</a> iScience. 25 (8), 104729(2022).</li>
<li>Villanueva, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+subtype-selective+recruitment+of+TLE3+or+Prdm16+by+PPAR%CE%B3+specifies+lipid+storage+versus+thermogenic+gene+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).</li>
<li>Pearson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TLE3+promotes+the+mitochondrial+program+in+beige+adipocytes+and+improves+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zfp423+maintains+white+adipocyte+identity+through+suppression+of+the+beige+cell+thermogenic+gene+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program.</a> Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublines+of+mouse+3T3+cells+that+accumulate+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid.</a> Cell. 1 (3), 113-116 (1974).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+established+preadipose+cell+line+and+its+differentiation+in+culture+II.+Factors+affecting+the+adipose+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion.</a> Cell. 5 (1), 19-27 (1975).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+heritable+changes+leading+to+increased+adipose+conversion+in+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells.</a> Cell. 7 (1), 105-113 (1976).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+preadipocytes+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e62005(2021).</li>
<li>Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture%3A+a+simple%2C+reproducible%2C+efficient+and+economic+technique+for+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+adipose+tissue+and+lipoaspirate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).</li>
<li>Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+freshly+isolated+human+adipose+stromal+cells+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Aesthetic+Surgery+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications.</a> Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).</li>
<li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plat-E%3A+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).</li>
<li>Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meaningful+respirometric+measurements+of+UCP1-mediated+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 56-61 (2017).</li>
<li>Hiraike, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+with+mouse+adipocytes+using+hypotonic+buffer+to+enrich+nuclear+fraction+before+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation.</a> STAR Protocols. 4 (1), 102093(2023).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
</ol>

Aucun des auteurs n’a d’intérêt financier concurrent lié à ce travail.

Ici, nous avons décrit un protocole d’isolement de la SVF à partir du tissu adipeux murin pour obtenir des préadipocytes et effectuer une différenciation adipocytaire in vitro. L’utilisation d’un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase a diminué la variation expérimentale, diminué le risque de contamination et augmenté la reproductibilité. Bien que cette procédure soit une étape critique du protocole présenté, le processus est hautement automatisé et l’optimisation n’est pas nécessaire. Cepen...

La biologie du tissu adipeux attire de plus en plus l’attention en raison de la prévalence croissante de l’obésité et du diabète de type 2 dans le monde1. Les adipocytes stockent l’excès d’énergie sous forme de gouttelettes lipidiques, qui sont libérées en cas de famine. De plus, le tissu adipeux maintient l’homéostasie énergétique systémique en servant d’organe endocrinien et en communiquant avec d’autres tissus 2,3. Curieusement, l’excès de tissu adipeux (obésité) et la perte adipeuse (lipodystrophie) sont liés à la résistance à l’insuline et au diabète1. Les adipocytes sont divisés en trois types: blanc, brun et beige1. Les adipocytes blancs stockent principalement l’excès d’énergie sous forme de lipides, tandis que les adipocytes bruns et beiges dissipent l’énergie sous forme de chaleur via la protéine de découplage mitochondrial-1 (Ucp1)1,4. Notamment, les adipocytes beiges (aussi appelés adipocytes bruns « inductibles ») apparaissent dans le tissu adipeux blanc en réponse à une stimulation froide ou sympathique et présentent des schémas d’expression génique qui se chevauchent avec ceux des adipocytes bruns « classiques» 5 mais qui sont distincts de ceux-ci. Récemment, les adipocytes bruns et beiges ont été anticipés comme cibles potentielles des traitements anti-obésité et anti-diabète visant à « améliorer la dissipation énergétique » plutôt qu’à « supprimer l’apport énergétique »4. À l’appui, l’allèle de risque de la variante d’obésité FTO rs1421085 chez l’homme, qui présente la plus forte association avec un indice de masse corporelle (IMC) plus élevé parmi les variantes courantes 6,7 et présente diverses interactions gène-environnement8,9, régulerait négativement la différenciation et la fonction des adipocytes beiges10. Le récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes γ (PPARγ) est connu comme un régulateur transcriptionnel maître de l’adipogenèse et est nécessaire et suffisant pour la différenciation des adipocytes11. Les régulateurs transcriptionnels, tels que le domaine homologue PRD1-BF1-RIZ1 contenant 16 (PRDM16), le facteur 2 précoce des cellules b (EBF2) et le facteur nucléaire I-A (NFIA), sont cruciaux pour la différenciation et la fonction des adipocytes bruns et beiges 12,13,14,15,16,17,18 . D’autre part, la programmation du gène adipocytaire blanc nécessite des régulateurs transcriptionnels, tels que la protéine 3 amplificateur de type transducine (TLE3) et la protéine 423 (ZFP423)19,20,21.
Les systèmes modèles in vitro permettent de réaliser des études moléculaires visant à améliorer la compréhension du ou des mécanismes sous-jacents aux fonctions et aux dysfonctionnements des adipocytes. Bien qu’il existe des lignées cellulaires de préadipocytes accessibles au public et immortalisées telles que 3T3-L1 et 3T3-F442A22,23,24, la culture de préadipocytes primaires et la différenciation en adipocytes seraient un modèle plus approprié pour étudier l’adipogenèse in vivo. L’isolement de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux murin est une méthode bien connue pour obtenir des préadipocytes primaires25,26. Cependant, la digestion de la collagénase du tissu adipeux, qui est généralement effectuée à l’aide d’un agitateur bactérien avec une grille à tubes, peut entraîner des variations expérimentales et est sujette à la contamination27,28. Ici, nous décrivons un protocole alternatif qui utilise un dissociateur de tissu doux de tri cellulaire activé magnétique (MACS) pour la digestion de la collagénase afin d’obtenir une isolation plus facile de la SVF.

<table><tbody><tr><td>Boîte de 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 12 puits</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de 60 mm</td><td>IWAKI</td><td>3010-060</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissociation du tissu adipeux, souris et rat</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-808</td><td>contenu : Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A et Tampon A</td></tr><tr><td>Passoire à cellules 70 &micro ; m</td><td>BD falcon</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>Plats enduits de collagène, 100 mm</td><td>BD#</td><td>356450</td><td></td></tr><tr><td>Plats enduits de collagène, 60 mm</td><td>BD</td><td>#354401</td><td></td></tr><tr><td>Collagène I Coat Microplaque 6 puits</td><td>IWAKI</td><td>4810-010</td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Wako</td><td>041-18861</td><td></td></tr><tr><td>Pince à dissection</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection, émoussé/tranchant</td><td>N/A</td> N<td>/</td><td>A autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection, tranchants/tranchants</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, supplément GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Milteny Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACSOcto Dissociateur avec Radiateurs</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Humulin R Injection U-100</td><td>Eli Lilly</td><td>872492</td><td></td></tr><tr><td>Indométhacine</td><td>Sigma</td><td>I7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Isobutylméthylxanthine (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>17018-1G</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Néomycine Sulfate</td><td>Fujifilm</td><td>146-08871&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>pBABE-neo largeTcDNA (SV40)</td><td>Ajouter gène</td><td>#1780</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>comprimés Takara</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td><td>cell biolab</td><td>RV-101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12996-81</td><td></td></tr><tr><td>Power Sybr Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>#FSQ-201</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Wako</td><td>180-02653</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T2877-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0.05 %)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin à l’aide d’un dissociateur tissulaire

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

L’étude in vitro de la différenciation des adipocytes blancs, bruns et beiges permet d’étudier les fonctions autonomes cellulaires des adipocytes et leurs mécanismes. Les lignées cellulaires de préadipocytes blancs immortalisés sont accessibles au public et largement utilisées. Cependant, l’émergence d’adipocytes beiges dans le tissu adipeux blanc en réponse à des signaux externes est difficile à récapituler dans son intégralité en utilisant des lignées cellulaires adipocytaires blanches accessibles au public. L’isolement de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux murin est couramment exécuté pour obtenir des préadipocytes primaires et effectuer la différenciation des adipocytes. Cependant, le hachage et la digestion de la collagénase du tissu adipeux à la main peuvent entraîner des variations expérimentales et sont sujets à la contamination. Ici, nous présentons un protocole semi-automatisé modifié qui utilise un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase afin d’isoler plus facilement la SVF, dans le but de réduire la variation expérimentale, de réduire la contamination et d’augmenter la reproductibilité. Les préadipocytes obtenus et les adipocytes différenciés peuvent être utilisés pour des analyses fonctionnelles et mécanistes.

Ce protocole produit des adipocytes entièrement différenciés et chargés de lipides 7 jours après avoir induit la différenciation des adipocytes . Le degré de différenciation des adipocytes peut être évalué par la coloration rouge d’huile des triglycérides et des lipides (Figure 1A), ou l’analyse de l’expression de l’ARNm à l’aide de qPCR-RT de gènes adipocytaires, tels que le régulateur maître de l’adipogenèse Pparg et sa cible Fabp4 (Figure 1B).</stron...

Ce protocole décrit l’isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux murin pour obtenir des préadipocytes et obtenir une différenciation adipocytaire in vitro. L’utilisation d’un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase réduit la variation expérimentale et augmente la reproductibilité.

Isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin à l’aide d’un dissociateur tissulaire

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

Nous nous intéressons aux sous-types d’adipocytes bruns et beiges qui dissipent l’énergie sous forme de chaleur, tandis que les adipocytes blancs stockent généralement de l’énergie car Notre objectif est de développer un nouveau traitement pour l’obésité et le diabète basé sur la promotion de la dépense énergétique, plutôt que sur la suppression de l’apport énergétique. Nous avons identifié un facteur de transcription, NFI, comme régulateur critique de la différenciation des adipocytes bruns par une analyse de la chromatine ouverte à l’échelle du génome. NFI et le régulateur transcriptionnel principal de l’adipogenèse, PPAR-gamma, co-localisent en tant qu’activateurs spécifiques de la graisse brune.Dans le processus d’isolement de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux de souris, le hachage manuel et la digestion de la collagénase du tissu adipeux peuvent entraîner une variabilité expérimentale et une contamination. Notre méthode utilise un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase, ce qui facilite l’isolement de la SVF, réduit la variabilité expérimentale et la contamination, et améliore la reproductibilité. L’expérimentation utilisant des adipocytes différenciés individuellement est indispensable pour la recherche dans notre domaine.Notre protocole offrirait une isolation SVF facile et reproductible pour la différenciation ultérieure des adipocytes et accélérerait la recherche dans notre communauté. Actuellement, nous étudions le rôle de l’IFN du métabolisme de tout le corps, comme le poids corporel et le glucose, en utilisant des modèles murins de gain et de perte de fonction. Nous explorerons également d’autres activations pharmacologiques de l’IFN pour chaque voie en aval dans un proche avenir.

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Cette vidéo présente une technique d’isolement et de culture de cellules souches dérivées du tissu adipeux de l’arc périaortique murin marquées par fluorescence à partir de tissus adipeux murins de l’arc périaortique. Après l’isolement, les NCADCs sont détectés, triés à l’aide d’un tri cellulaire activé par fluorescence, puis cultivés sur une plaque, favorisant ainsi la prolifération cellulaire.

Isolement de cellules souches dérivées du tissu adipeux périortique murin

Préadipocytes primaires blanches isolées à partir de tissus adipeux blancs chez la souris peuvent être différenciées en cellules beige / brite. Présenté ici est un système modèle cellulaire fiable pour étudier la régulation moléculaire de "brunissement" de graisse blanche.

L&#39;isolement et la différenciation des cellules stromales vasculaires de cellules Beige / Brite

En 2001, des chercheurs de l'UCLA ont décrit l'isolement d'une population de cellules souches adultes, les cellules appelé ou CSA souches du tissu adipeux, du tissu adipeux. Cet article décrit l'isolement des CSA de lipoaspirates utilisant un protocole de digestion enzymatique manuel à l'aide de la collagénase.

Isolation Manuel des cellules souches du tissu adipeux de Lipoaspirates humaines

Le tissu adipeux (AT) est un site d'activation intense des cellules immunitaires et de l'interaction. Presque toutes les cellules du système immunitaire sont présents dans A et leurs rapports sont modifiés par l'obésité. Une bonne isolation, la quantification et la caractérisation des AT populations de cellules immunitaires sont essentielles pour la compréhension de leur rôle dans la maladie immunometabolic.

Isolement de tissu adipeux cellules immunitaires

Nous présentons un protocole pour isoler des fragments microvasculaires du tissu adipeux dérivé qui représentent des unités de vascularisation prometteuses. Ils peuvent être isolés rapidement, ne nécessitent pas dans le traitement in vitro et, par conséquent, peut être utilisé pour prévascularisation une étape dans différents domaines de l' ingénierie tissulaire.

Isolement des murins dérivés tissu adipeux microvasculaire fragments comme Vascularization unités pour l&#39;ingénierie tissulaire

Le tissu adipeux blanc (WAT) a des lacunes critiques dans ses modèles actuels de la culture primaire, qui entravent le développement pharmacologique et études métaboliques. Nous présentons ici un protocole visant à produire un système adipeux microphysiological par WAT intercaler entre deux feuilles de cellules stromales. Cette construction fournit une plateforme stable et adaptable pour la culture primaire de WAT.

Une plate-forme de Microphysiologic pour la graisse humaine : en sandwich le tissu adipeux blanc

Ce protocole décrit l’approche technique permettant d’isoler des sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts de tissu adipeux blanc (WAT) intra-abdominal murin par tri cellulaire activé par fluorescence ou séparation immunomagnétique des billes.

Isolement de sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts adipeux intra-abdominaux murins

Ce protocole fournit une méthode efficace de digestion de la collagénase pour isoler des adipocytes viables et des cellules stromales de fraction vasculaire-SVF de la graisse viscérale humaine en un seul processus, y compris une méthodologie pour obtenir un ARN de haute qualité à partir d’adipocytes et la phénotypification des macrophages SVF par coloration de plusieurs marqueurs membranaires pour analyse par cytométrie en flux.

Isolement d’adipocytes viables et d’une fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux viscéral humain adapté à l’analyse de l’ARN et au phénotypage des macrophages

Ici, nous décrivons l’isolement, la culture et l’induction adipogénique de préadipocytes dérivés de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux périaortique de souris, permettant l’étude de la fonction du tissu adipeux périvasculaire et de sa relation avec les cellules vasculaires.

Isolement, culture et induction adipogénique de préadipocytes dérivés de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux périaortique de souris

Ici, nous présentons une méthode standard pour isoler efficacement les cellules souches et les adipocytes dérivés de l’adipos, caractérisée par une réduction de &gt; 90 % du temps de traitement, une forte viabilité cellulaire et une large compatibilité.

Isolation efficace des cellules souches et adipocytes dérivés de l’adipeux à partir du tissu adipeux porcine

Découvrez l'isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin. Cette méthode améliore la reproductibilité pour la différenciation des adipocytes et la recherche sur l'obésité.

Isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin à l’aide d’un dissociateur tissulaire (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin à l’aide d’un dissociateur tissulaire

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