Name: Analyse de l’hérédité épigénétique transgénérationnelle chez C. elegans à l’aide d’un rapporteur fluorescent et de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Découvrez une méthode standardisée d'ARN interférence et de ChIP pour étudier l'héritage épigénétique transgénérationnelle chez C. elegans. Ce protocole permet d'analyser les modifications chromatiniennes et l'héritage de l'ARNi.

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Nous tenons à remercier les laboratoires de la communauté C. elegans qui ont développé et partagé les outils et dont le travail est cité dans ce manuscrit. Certaines souches ont été fournies par le CCG, qui est financé par le Bureau des programmes d’infrastructure de recherche des NIH (P40 OD010440). Ces travaux ont été financés par une subvention Projet des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) à A.L.S. (PJT-175245). C.L. bénéficie d’une bourse d’études supérieures du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG).

Héritage épigénétique et ChIP chez Caenorhabditis elegans

<ol><li>Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+dynamics+of+heritable+silencing+induced+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).</li>
<li>Ashe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+can+trigger+a+multigenerational+epigenetic+memory+in+the+germline+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans.</a> Cell. 150 (1), 88-99 (2012).</li>
<li>Buckley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+Argonaute+promotes+multigenerational+epigenetic+inheritance+and+germline+immortality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality.</a> Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).</li>
<li>Vastenhouw, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+silencing+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term gene silencing by RNAi.</a> Nature. 442 (7105), 882(2006).</li>
<li>Lee, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+piRNAs+mediate+the+genome-wide+surveillance+of+germline+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts.</a> Cell. 150 (1), 78-87 (2012).</li>
<li>Luteijn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+stable+Piwi-induced+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).</li>
<li>Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+siRNAs+mediate+paramutation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 11 (3), e1005078(2015).</li>
<li>Shirayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+initiate+an+epigenetic+memory+of+nonself+RNA+in+the+C.+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline.</a> Cell. 150 (1), 65-77 (2012).</li>
<li>Minkina, O., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+heritable+germline+silencing+directs+somatic+silencing+at+an+endogenous+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus.</a> Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).</li>
<li>Seroussi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+epigenetic+regulation+by+C.+elegans+nuclear+RNA+interference+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).</li>
<li>Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3+is+required+for+inheritance+of+small+RNAs+that+target+a+unique+subset+of+newly+evolved+genes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes.</a> eLife. 8, e40448(2019).</li>
<li>Woodhouse, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifiers+SET-25+and+SET-32+are+required+for+establishment+but+not+long-term+maintenance+of+transgenerational+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance.</a> Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+resets+ancestral+heritable+small+RNA+responses%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Stress resets ancestral heritable small RNA responses.</a> eLife. 10, e65797(2021).</li>
<li>Houri-Ze'evi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+mechanism+determines+the+duration+of+the+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 165 (1), 88-99 (2016).</li>
<li>Spracklin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNAi+inheritance+machinery+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).</li>
<li>Perales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+epigenetic+inheritance+is+negatively+regulated+by+the+HERI-1+chromodomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein.</a> Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).</li>
<li>Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+coordinate+poly%28UG%29+tailing+to+prevent+aberrant+and+perpetual+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing.</a> Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).</li>
<li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+GeneticsWormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology.</a> WormBook. , https://www.ncbi.nim.nih.gov/books/NBK19711/ (2006).</li>
<li>Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+nematodes+for+live+imaging+using+an+agarose+pad+produced+with+a+Vinyl+Record%5BTitle%5D)+AND+%22microPublication+Biology%22%5BJournal%5D)">Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record.</a> microPublication Biology. 2018, (2018).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+techniques+for+the+analysis+of+chromatin+and+nuclear+organization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).</li>
<li>Gu, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+siRNA+in+Caenorhabditis+elegans+generates+a+transgenerational+sequence-targeted+histone+H3+lysine+9+methylation+footprint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint.</a> Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).</li>
<li>Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+the+downstream+effects+of+germline+nuclear+RNAi+reveals+that+H3K9me3+is+dispensable+for+heritable+RNAi+and+the+maintenance+of+endogenous+siRNA-mediated+transcriptional+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+%26+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Epigenetics & Chromatin. 10, 6(2017).</li>
<li>Kalinava, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+heterochromatin+factor+SET-32+plays+an+essential+role+in+transgenerational+establishment+of+nuclear+RNAi-mediated+epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing.</a> Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).</li>
<li>Lev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MET-2-dependent+H3K9+methylation+suppresses+transgenerational+small+RNA+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance.</a> Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2001).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+Argonaute+protein+promotes+the+inheritance+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi.</a> Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).</li>
<li>Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+requirements+for+inheritance+of+RNAi+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans.</a> Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+rules+explain+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).</li>
<li>Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNAi+maintains+heritable+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).</li>
<li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrde+pathway+mediates+small-RNA-directed+histone+H3+lysine+27+trimethylation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+coupled+to+detection+by+quantitative+real-time+PCR+to+study+transcription+factor+binding+to+DNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).</li>
</ol>

Tous les auteurs confirment qu’ils n’ont aucun conflit à divulguer.

Dans ce protocole, l’ARNdb est introduit par l’alimentation, ce qui est devenu une méthode standard chez C. elegans18. Pour les tests d’hérédité de l’ARNi, l’approche d’alimentation fournit une méthode facile pour obtenir une grande population de P0 2,11,12,22,23,24,25. Cependant, le moment et la durée de l’exposition à l’ARNi affectent l’efficacité du silençage des transgènes26, et la concentration des bactéries ARNi affecte la persistance du silençage de l’ARNi héréditaire1. Par conséquent, la croissance standardisée des bactéries ARNi et des vers est importante pour obtenir un niveau constant de silençage de la GFP et une durée d’hérédité. Ici, les embryons sont plaqués sur des plaques d’ARNi afin que les animaux P0 soient exposés aux bactéries ARNi dès l’éclosion. D’autres approches ont permis de plaquer des animaux synchronisés de stade L1 24,27 ouL4 25 sur des plaques RNAi-NGM. De plus, étant donné que la famine et d’autres stress affectent le maintien de l’hérédité de l’ARNi13, les plaques doivent être surveillées pour éviter le surpeuplement et l’épuisement de l’approvisionnement alimentaire. Comme alternative à l’initiation de l’ARNi par l’alimentation, certaines des études pionnières sur l’hérédité de l’ARNi de C. elegans ont induit l’ARNi par injection de gonades, ce qui permet un meilleur contrôle de la concentration d’ARNdb 1,28.
Dans ce protocole, chaque génération est transmise en tant que population avec un traitement à l’hypochlorite alcalin, comme décrit précédemment 16,22,23,24. Le traitement à l’hypochlorite garantit que la génération F1 ne sera pas contaminée par des bactéries ARNi provenant de l’environnement parental22 et empêche un éventuel goulot d’étranglement indésirable de la population. Cependant, le passage en masse peut également être une limitation, car les animaux individuels peuvent avoir des schémas de transmission distincts 1,29. Une autre méthode pour établir chaque génération consiste à sélectionner des animaux individuels 1,2,9,11,25. Cette approche permet de suivre les phénotypes au sein des lignées et d’incorporer des croisements génétiques. L’analyse de la lignée peut également être avantageuse pour les phénotypes à faible pénétrance12.
L’expression de la protéine fluorescente est une lecture puissante et pratique du silençage induit par l’ARNi 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Comme décrit dans ce protocole, l’expression GFP peut être évaluée manuellement comme ON ou OFF 11,12,15,16,25. La notation manuelle peut être affinée en attribuant des niveaux d’intensité qualitatifs 3,4,14. Alternativement, le score d’intensité automatisé des images microscopiques 11,12,14,25,27 ou la mesure de fluorescence par cytométrie en flux d’animaux vivants2 peuvent fournir une lecture quantitative et à haut débit. Cependant, étant donné que l’expression rapporteur est limitée à la lignée germinale, une mise en garde des approches automatisées est qu’elles doivent également faire la différence entre les animaux dont l’expression de la GFP est réduite au silence et les animaux sans lignée germinale, en particulier si l’étude intègre des mutants ayant un développement anormal de la lignée germinale. Comme alternative à la fluorescence GFP, la transcription inverse (RT)-qPCR peut être utilisée pour quantifier les niveaux de pré-ARNm et d’ARNm ciblesde l’ARNm 2,16,23,24. Cette approche fournit une lecture plus directe du silençage, qui cible l’ARN, et est particulièrement utile pour d’autres cibles d’ARNi où le silençage ne produit pas de phénotype visible. L’une des limites de l’utilisation de rapporteurs GFP artificiels est que les séquences exogènes et endogènes sont régulées de manière différentielle dans l’ARNi transgénérationnel11. Les études portant sur des cibles endogènes, telles que l’allèle létal létal embryonnaire oma-1(zu405)1,11,16,25 sensible à la température, doivent donc être considérées comme une approche complémentaire aux rapporteurs de transgènes fluorescents.
L’analyse de ChIP dans le cadre des tests d’hérédité de l’ARNi nécessite une comparaison entre les traitements et les répétitions. Tout d’abord, pour tenir compte des différences de matériau de départ entre les échantillons, le signal ChIP est normalisé en signal d’entrée au même locus que le « pourcentage d’entrée ». Le traitement d’une histone H3 ChIP en parallèle aidera à déterminer si les altérations de modification des histones correspondent à des changements dans la densité des nucléosomes. De plus, étant donné que ChIP est un processus en plusieurs étapes, l’efficacité peut varier d’un échantillon à l’autre. La sélection de loci de contrôle positifs et négatifs appropriés est utile pour évaluer et comparer le rapport signal/bruit entre les échantillons et les expériences. De plus, pour faciliter les comparaisons entre les échantillons, les valeurs seuils du cycle de qPCR de l’ADN ChIP à la cible de l’ARNi sont souvent normalisées à un locus de contrôle 3,11,15,23,30,31. Pour évaluer les effets du traitement à l’ARNi, le rapport entre le signal ChIP dans l’ARNi de traitement et les conditions de contrôle ou d’absence d’ARNi est également comparé. L’une des limites de l’approche actuelle est que la CHIP est réalisée sur des animaux entiers, alors que la réponse au traitement par ARNi peut être unique à la lignée germinale. Une approche pour surmonter cette mise en garde consiste à effectuer une ChIP à l’aide de noyaux germinaux isolés. D’autres considérations techniques pour l’optimisation de ChIP ont également été discutées en détail ailleurs32,33.
Dans l’ensemble, ce protocole d’hérédité de l’ARNi et de ChIP fournit une base détaillée et facile à adapter qui peut être intégrée à d’autres techniques pour explorer davantage la régulation épigénétique transgénérationnelle. Par exemple, des banques de séquençage à haut débit peuvent être construites à partir de l’ADN ChIP (ChIP-seq) pour une vue plus détaillée du paysage de la chromatine à la fois à proximité de la cible de l’ARNi et à l’échelle du génome.

L’héritage épigénétique permet la transmission de l’information régulatrice des gènes à travers les générations et peut donc permettre à l’environnement ou aux expériences des parents d’affecter leur progéniture. Chez C. elegans, le silençage génique germinal initié par l’ARN double brin exogène (ARNdb) peut être hérité pendant plusieurs générations chez la descendance non exposée au déclencheur d’origine 1,2,3,4. Ce processus, appelé hérédité par interférence ARN (ARNi), est l’un des nombreux phénomènes de silençage épigénétique apparentés chez C. elegans, y compris le silençage multigénérationnel initié par les piARN 2,5, la paramutation/ARNe (silençage épigénétique induit par l’ARN)6,7,8 et le silençage initié par la matrice multicopie9, qui ont des exigences qui se chevauchent mais qui sont distinctes pour les petites machines de régulation de l’ARN et de la chromatine . Dans l’ARNi exogène de C. elegans, l’ARNdb est transformé en petits ARN interférents (siRNA) qui agissent en complexe avec les protéines primaires d’Argonaute pour reconnaître leur ARNm cible. Ce ciblage conduit à l’amplification des siARN secondaires qui s’associent aux Argonautes secondaires pour faire taire l’ARNm cible par des voies de silençage cytoplasmique et nucléaire. Pour les cibles d’ARNi exprimées par la lignée germinale, l’Argonaute secondaire nucléaire HRDE-1 et d’autres facteurs d’ARNi nucléaires ciblent les transcrits naissants, ce qui entraîne une répression transcriptionnelle et le recrutement d’histones méthyltransférases pour déposer des marques de chromatine répressives, y compris H3K9me310. L’histone H3K9me3 favorise l’établissement d’un silençage héréditaire des transgènes de la protéine fluorescente verte (GFP) exprimée par la lignée germinale par l’hérédité de l’ARNi11,12.
L’objectif de ce protocole est d’utiliser un transgène exprimant une protéine de fusion GFP-histones dans la lignée germinale comme rapporteur pour l’hérédité de l’ARNi et de tester les changements dans les modifications des histones au locus du transgène rapporteur en utilisant l’immunoprécipitation de la chromatine et la réaction en chaîne par polymérase quantitative (ChIP-qPCR). Ce protocole décrit une approche standardisée d’alimentation en ARNi à base de plaques pour initier le silençage du rapporteur. Il fournit également une chronologie détaillée du passage des animaux d’une génération à l’autre en isolant in utero les embryons d’adultes gravides par un traitement à l’hypochlorite alcalin (« blanchiment »). Des méthodes et des données représentatives pour le suivi de la fréquence du silençage de la GFP dans un sous-ensemble de la population par microscopie à fluorescence et pour l’histone H3K9me3 ChIP-qPCR sont également décrites. Les tests d’hérédité de l’ARNi basés sur des rapporteurs fournissent un système très facile à disséquer fonctionnellement les rôles des facteurs génétiques et environnementaux dans la régulation épigénétique 13,14, et les criblages génétiques utilisant de tels rapporteurs ont identifié à la fois les gènes nécessaires à 2,3,15 et les gènes qui régulent négativement la durée de l’héritage épigénétique transgénérationnel.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Bioshop</td><td>AMP201</td><td>Préparer une solution à 100 mg/mL dans de l’eau ultrapure. Filtrer-stériliser et conserver à -20 °C.</td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal anti-H3K9me3 Rabbit</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td>La concentration dépend du lot (0,9 - 1 mg/mL).</td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal anti-histone H3 Rabbit</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>La concentration dépend du lot (0,7 - 1 mg/mL).</td></tr><tr><td>Eau de Javel (6 % d’hypochlorite de sodium)</td><td>Souche Lavo</td><td>02358107</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans avec GFP RNAi Reporter</td><td>NA</td><td>SX1263</td><td>Sapetschnig et al. 2015 (réf. 7). Un don du laboratoire E. Miska, Université de Cambridge.</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>BioShop</td><td>CAR544</td><td>Préparer une solution à 25 mg/mL dans de l’eau ultrapure. Filtrer-stériliser et conserver à -20 °C.</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G Magnetic Beads</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>E. coli souche HT115(DE3)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>HT115(DE3)</td><td></td></tr><tr><td>E. coli souche OP50-1</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 m, pH 8,0)</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Stéréoscope</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde (37 %)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td>Réaliser une solution de 1,25 M et stocker à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>HEPES-KOH (1 M, pH 7,5)</td><td>Teknova</td><td>H1035</td><td></td></tr><tr><td>Lames imprimées hydrophobes, 10 puits</td><td>VWR</td><td>100488-904</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (Éthoxylate d’octylphénol)</td><td>BioShop</td><td>NON999</td><td>Préparez une solution à 10 % (v/v) dans de l’eau ultrapure et conservez-la à température ambiante.</td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl-&beta ;-D-thiogalactoside)</td><td>BioShop</td><td>IPT001</td><td>Préparer une solution de 0,2 g/mL dans de l’eau ultrapure. Filtrer-stériliser et conserver à -20 °C.</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725122</td><td></td></tr><tr><td>LB Plaques de gélose complétées par 100 &micro ; g/mL d’ampicilline</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Recette de laboratoire standard.</td></tr><tr><td>Lévamisole (chlorhydrate de tétramisole)</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>Préparer une solution de 200 mM dans de l’eau ultrapure. Conserver à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>LiCl (8 M)</td><td>Sigma</td><td>L7026</td><td></td></tr><tr><td>M9 Tampon</td><td>NA</td><td>NA</td><td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4.</td></tr><tr><td>Séparateur magnétique (tubes de 1,5 mL)</td><td>Séparateur magnétique Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>(tubes de 0,2 mL)</td><td>Permagen</td><td>MSR812</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle de microscope en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12541B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscope Slide Technologist Choice</td><td>LAB-037</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5 M)</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td>Pour tampons ChIP.</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>Préparez une solution de 10 M et conservez-la à température ambiante.</td></tr><tr><td>Plaques NGM</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1,7 % (p/v) d’agar, 0,3 % (p/v) de NaCl, 0,25 % (p/v) de peptone, 1 mM de CaCl2, 5 &mu ; g/mL de cholestérol, 25 mM de phosphate de potassium pH 6,0, 1 mM de MgSO4, 50 & micro ; g/mL de streptomycine.</td></tr><tr><td>IgG normales de lapin (1 mg/mL)</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>2729</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri (35 mm x 10 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (10X)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide - ARN de contrôle</td><td>Addgene</td><td>L4440 (Plasmide #1654)</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide - ARNi ciblant la GFP&nbsp ;</td><td>Addgene</td><td>L4417 (Plasmide #1649)</td><td>Notez que d’autres plasmides dérivés de L4440 ciblant la GFP peuvent être utilisés.</td></tr><tr><td>Paire d’amorces [-3,3 kb en amont de gfp]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F : AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R : GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG</td></tr><tr><td>Paire d’amorces [+1,3 kb en aval de gfp]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F : TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R : ACGTGCGGGATCATTTCTTACT</td></tr><tr><td>Paire d’amorces [clec-18]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F : TGCTCCATGACCTCAACAACA, R : AGTACAGTTCACCGATCCAGA</td></tr><tr><td>Paire d’amorces [exon gfp 1]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F : CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R : GGGTAAGTTTTTTTGTATGTTGC</td></tr><tr><td>Paire d’amorces [exon gfp 4]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F : GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R : ATGCCATGTGTAATCCCAGCA</td></tr><tr><td>Paire d’amorces [hrp-2]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F : CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R : CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA</td></tr><tr><td>Comprimé cocktail d’inhibiteur de protéase</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>protéinase K&nbsp ;</td><td>Bioline</td><td>BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de Purification PCR&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Système de détection PCR en temps réel</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Plaques RNAI-NGM</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1,7 % (p/v) de gélose, 0,3 % (p/v) de NaCl, 0,25 % (p/v) de peptone, 1 mM de CaCl2, 5 et micro ; g/mL de cholestérol, 25 mM Tampon phosphate de potassium pH 6,0, 1 mM MgSO4, 25 & micro ; g/mL de carbénicilline et 5 mM d’IPTG.</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl (sel sodique N-Lauroylsarcosine)</td><td>Sigma</td><td>L5777</td><td>Préparer une solution à 10 % (p/v) et conserver à température ambiante à l’abri de la lumière pendant 1 mois maximum.</td></tr><tr><td>FDS</td><td>Sigma</td><td>74255</td><td>Préparez une solution à 10 % (p/v) et conservez-la à température ambiante.</td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td>Préparez une solution à 5 % (p/v) et conservez-la à température ambiante à l’abri de la lumière pendant un maximum de 1 mois.</td></tr><tr><td>Tube de sonication</td><td>Evergreen</td><td>214-3721-010</td><td></td></tr><tr><td>Capuchon de tube de sonication</td><td>Evergreen</td><td>300-2911-020</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q800R3-110</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de streptomycine</td><td>Bioshop</td><td>STP101</td><td>Préparez une solution de 50 mg/mL dans de l’eau ultrapure. Filtrer-stériliser et conserver à -20 °C.</td></tr><tr><td>Tampon TAE (1X)</td><td>NA</td><td></td><td>NA 40 mM Tris, 20 mM acétate, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Tally compteur clicker</td><td>Uline</td><td>H-7350</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Bioshop</td><td>TET701</td><td>Réaliser une solution de 5 mg/mL dans de l’éthanol et stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Thermomélangeur</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-205</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8,0)</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Préparer une solution à 10 % (v/v) dans de l’eau ultrapure et conserver à température ambiante.</td></tr></tbody></table>

analyse de l’hérédité épigénétique transgénérationnelle chez c. elegans à l’aide d’un rapporteur fluorescent et de l’immunoprécipitation de la chromatine (chip)

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

L’héritage épigénétique transgénérationnel (TEI) permet la transmission d’informations à travers la lignée germinale sans modifier la séquence du génome, par le biais de facteurs tels que les ARN non codants et les modifications de la chromatine. Le phénomène d’hérédité par interférence ARN (ARNi) chez le nématode Caenorhabditis elegans est un modèle efficace pour étudier la TEI qui tire parti du court cycle de vie, de l’auto-propagation et de la transparence de cet organisme modèle. Dans l’hérédité de l’ARNi, l’exposition des animaux à l’ARNi entraîne un silençage génique et une altération des signatures de la chromatine au locus cible qui persistent pendant plusieurs générations en l’absence du déclencheur initial. Ce protocole décrit l’analyse de l’hérédité de l’ARNi chez C. elegans à l’aide d’un rapporteur de protéine fluorescente verte nucléaire (GFP) exprimée par la lignée germinale. Le silençage des rapporteurs est initié par l’alimentation des animaux avec des bactéries exprimant de l’ARN double brin ciblant la GFP. À chaque génération, les animaux sont passés pour maintenir un développement synchronisé, et le silençage des gènes rapporteurs est déterminé par microscopie. À certaines générations, les populations sont prélevées et traitées pour l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et la réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) afin de mesurer l’enrichissement en modification des histones au locus rapporteur de la GFP. Ce protocole d’étude de l’hérédité de l’ARNi peut être facilement modifié et combiné avec d’autres analyses pour étudier plus en détail les facteurs TEI dans les petites voies de l’ARN et de la chromatine.

Les animaux porteurs de l’histone Gfp-H2B exprimée par la lignée germinale [mex-5p ::gfp-h2b ::tbb-2 3'UTR]7 rapporteur (Figure 2A) ont été exposés à l’ARNi GFP ou à l’ARNi témoin en se nourrissant et en passant comme décrit dans le protocole et dans la Figure 1. Le signal de GFP nucléaire dans la lignée germinale a été évalué manuellement à l’aide d’un microscope à dissection à fluorescence pour un échantillon de la population à chaque génération. L’inhibition du transgène a été complètement pénétrante chez les animaux P0 et F1 marqués traités avec l’ARNi GFP (Figure 2B). Dans la génération F2, la proportion de la population présentant une hérédité du silençage de la GFP était d’environ 50 %. À la génération F5, la majorité de la population n’a pas montré d’hérédité de silençage, et à la génération F10, aucune hérédité n’a été détectée, car tous les animaux exprimaient la GFP.
Pour déterminer le changement dans l’enrichissement de l’histone H3K9me3 correspondant au silençage induit par l’ARNi, la ChIP-qPCR a été réalisée sur des animaux de génération F1 après un traitement par ARNi GFP ou ARNi témoin. Comme on pouvait s’y attendre, la population traitée par l’ARNi GFP présentait des niveaux plus élevés d’histone H3K9me3 à la cible GFP et à la région aval de 1,3 kb par rapport aux animaux témoins traités à l’ARNi (Figure 2C). La spécificité de l’histone H3K9me3 ChIP est étayée par l’enrichissement à un locus témoin positif (clec-18) connu pour être enrichi en cette marque, mais pas à un locus témoin négatif voisin (hrp-2). L’enrichissement en histone H3 et l’enrichissement proche du bruit de fond dans les immunoprécipitations de contrôle des IgG ont également été détectés à tous les loci qPCR, comme prévu. Lorsque l’enrichissement en ChIP au niveau du rapporteur est normalisé au locus témoin positif clec-18 , un enrichissement plus élevé en histone H3K9me3 sur l’ARNi GFP est montré, tandis que l’enrichissement en histone H3 est similaire entre le traitement par ARNi témoin et GFP (Figure 2D). Étant donné qu’on ne s’attend pas à ce que l’ARNi GFP affecte l’histone H3K9me3 ou l’occupation totale de l’histone H3 au locus clec-18 , cette normalisation atténue les variations techniques, telles que les différences d’efficacité ChIP entre les échantillons d’ARNi GFP et d’ARNi témoin. Le changement de pli des niveaux d’histone H3K9me3 et d’histone H3 entre les traitements à ARNi montre un enrichissement de l’histone H3K9me3 spécifique du rapporteur GFP, indépendant de l’occupation des histones, lors de l’inactivation induite par l’ARNi GFP (Figure 2E).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65285/65285fig02.jpg"> Figure 2 : Le silençage induit par l’ARNi de la GFP correspond à un enrichissement élevé de H3K9me3 au niveau de la cible de l’ARNi. (A) Diagramme de l’ARNi GFP exprimé par la lignée germinale mjIs134[mex-5p ::gfp-h2b ::tbb-2 3'UTR] avec des régions d’amplicon qPCR marquées. (B) Expression de la GFP notée sur plusieurs générations après des traitements à l’ARNi à 21 °C. Les barres d’erreur représentent l’écart-type de deux répétitions biologiques. (C) ChIP-qPCR de H3K9me3, de l’histone H3 et du contrôle IgG chez les jeunes adultes F1 à partir de deux répétitions biologiques. clec-18 et hrp-2 sont les loci de contrôle positifs et négatifs pour l’enrichissement en H3K9me3, respectivement. (D) Enrichissement de H3K9me3 et de l’histone H3 au rapporteur d’ARNi GFP normalisé au locus témoin positif clec-18. (E) Modification de l’enrichissement en H3K9me3 et en histone H3 entre les animaux traités à l’ARNi GFP et les animaux traités à l’ARNi témoin, avec normalisation à clec-18. La ligne pointillée représente un changement de pli de 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65285/65285fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole décrit un test d’interférence de l’ARN et de ChIP pour étudier l’hérédité épigénétique du silençage induit par l’ARNi et des modifications de la chromatine associées chez C. elegans.

Analyse de l’hérédité épigénétique transgénérationnelle chez C. elegans à l’aide d’un rapporteur fluorescent et de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...

Les recherches menées dans notre laboratoire examinent comment les protéines associées à la chromatine, les modifications des histones et les petits facteurs de voie de l’ARN fonctionnent ensemble dans le contexte du développement et de l’hérédité épigénétique transgénérationnelle. Le test d’hérédité de l’ARN, à l’aide d’un rapporteur GFP, est devenu un outil très puissant. Ce protocole décrit comment normaliser la préparation, le marquage et le passage des vers, ainsi que la préparation des échantillons ChIP, ce qui peut aider à générer des résultats reproductibles.L’un des défis expérimentaux lors de l’étude des transgènes exprimés par la lignée germinale est d’isoler les effets dans la lignée germinale de l’animal. Nous utilisons actuellement des animaux entiers pour ChIP, mais à l’avenir, nous aimerions développer des tests pour examiner la chromatine, en particulier dans la lignée germinale. Notre laboratoire s’intéresse à la méthylation des histones et aux protéines qui reconnaissent ces marques.À l’avenir, nous aimerions étudier l’interaction entre ces lecteurs de chromatine et les petites voies de l’ARN dans le contexte de l’hérédité de l’ARNi au niveau des transgènes et de la régulation des séquences endogènes.

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Analyse de l’hérédité épigénétique transgénérationnelle chez C. elegans à l’aide d’un rapporteur fluorescent et de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)

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