Analyse de l’hérédité épigénétique transgénérationnelle chez C. elegans à l’aide d’un rapporteur fluorescent et de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
5 mai 2023
Ce protocole décrit un test d’interférence de l’ARN et de ChIP pour étudier l’hérédité épigénétique du silençage induit par l’ARNi et des modifications de la chromatine associées chez C. elegans.
Les recherches menées dans notre laboratoire examinent comment les protéines associées à la chromatine, les modifications des histones et les petits facteurs de voie de l’ARN fonctionnent ensemble dans le contexte du développement et de l’hérédité épigénétique transgénérationnelle. Le test d’hérédité de l’ARN, à l’aide d’un rapporteur GFP, est devenu un outil très puissant. Ce protocole décrit comment normaliser la préparation, le marquage et le passage des vers, ainsi que la préparation des échantillons ChIP, ce qui peut aider à générer des résultats reproductibles.
L’un des défis expérimentaux lors de l’étude des transgènes exprimés par la lignée germinale est d’isoler les effets dans la lignée germinale de l’animal. Nous utilisons actuellement des animaux entiers pour ChIP, mais à l’avenir, nous aimerions développer des tests pour examiner la chromatine, en particulier dans la lignée germinale. Notre laboratoire s’intéresse à la méthylation des histones et aux protéines qui reconnaissent ces marques.
À l’avenir, nous aimerions étudier l’interaction entre ces lecteurs de chromatine et les petites voies de l’ARN dans le contexte de l’hérédité de l’ARNi au niveau des transgènes et de la régulation des séquences endogènes.
Aperçu
Ce protocole décrit un dosage d'interférence par ARN et de ChIP afin d'étudier l'héritage épigénétique du silençage induit par ARN et des modifications de la chromatine chez C. elegans.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Épigénétique
- Biologie moléculaire
Contexte
- Les recherches portent sur les protéines associées à la chromatine et les modifications des histones.
- Les voies des petits ARN jouent un rôle crucial dans le développement et l'hérédité.
- Le test d'héritage de l'ARN utilise un marqueur GFP pour une analyse efficace.
- Les difficultés incluent l'isolement des effets germinaux sur les transgènes.
Objectif de l'étude
- Standardiser la préparation et l'évaluation de C. elegans pour les tests d'héritage d'ARNi.
- Étudier l'interaction entre les lecteurs de chromatine et les voies des petits ARN.
- Comprendre les mécanismes de l'héritage épigénétique transgénérationnel.
Méthodes utilisées
- Préparation d'embryons de C. elegans à l'aide d'une solution de blanchiment.
- Traitement par ARNi avec des vecteurs GFP ou témoins sur des boîtes de gélose.
- Évaluation de l'expression de la GFP au cours de diverses générations.
- Cross-linkage au formaldéhyde pour les tests ChIP.
Résultats principaux
- Le silencement du transgène était complètement pénétrant chez les générations P0 et F1.
- Environ 50 % d'héritage du silencement de la GFP observé chez la génération F2.
- À la génération F5, la plupart des vers n'ont pas montré d'héritage du silencement.
- Tous les vers exprimaient la GFP à la génération F10, indiquant une perte de l'héritage.
Conclusions
- L'étude fournit des informations sur l'héritage de l'ARNi et les modifications de la chromatine.
- Les méthodes standardisées améliorent la reproductibilité dans la recherche épigénétique.
- Les travaux futurs se concentreront sur l'analyse de la chromatine spécifique à la lignée germinale.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'héritage épigénétique transgénérationnel (TEI) chez C. elegans constitue un modèle robuste pour étudier les mécanismes régulant l'hérédité de l'expression génique sans modification de la séquence d'ADN. L'intégration de tests rapporteurs fluorescents et de la technique ChIP-qPCR permet une analyse quantitative, résolue par génération, des modifications de la chromatine et du silençage induit par ARNi. Ce flux opérationnel renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques aux points critiques de découverte précoce.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'interrogation directe des mécanismes héréditaires de silençage génique, pertinents pour la validation des cibles.
- Contribue à l'atténuation des risques mécanistiques en associant les modifications de la chromatine aux résultats fonctionnels de l'expression génique.
- Facilite le tri du portefeuille en fournissant des lectures quantitatives et résolues selon les générations de la régulation épigénétique.
Développement de criblages et de tests
- Établit des systèmes biologiques validés et reproductibles pour le criblage en aval de modulateurs des voies de la chromatine et de l'ARNi.
- Standardise l'évaluation quantitative de la suppression du rapporteur et de l'enrichissement en modifications des histones.
- Permet des formats d'essai évolutifs et multi-générationnels pour l'évaluation de composés et l'analyse des voies.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les mécanismes épigénétiques pertinents pour la maladie en modélisant les modifications chromatiniennes héréditaires.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique des cibles et voies épigénétiques.
- Permet de prendre des décisions d'avancement ajustées au risque en quantifiant la persistance et la réversibilité de la silencing génique.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode fait le lien entre la découverte précoce et la recherche préclinique en permettant la vérification d'hypothèses sur l'héritage épigénétique et la dynamique de la chromatine au fil des générations.
- Biologie de la découverte : Quantifie l'impact des ARNi et des modifications de la chromatine sur la régulation génique héréditaire.
- Criblage : Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs concernant le silençage de rapporteurs et l'enrichissement en marques histoniques.
- Analytique : Permet la comparaison statistique de la persistance du silençage et de l'état de la chromatine à travers les générations.
- Recherche translationnelle : Modélise les mécanismes épigénétiques associés aux maladies et aux interventions thérapeutiques.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme modulaire adaptable à diverses cibles génétiques et voies de la chromatine.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la régulation épigénétique.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité des tests multi-générationnels.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'orientation (go/no-go) et l'affectation des capitaux en quantifiant la dynamique de silencing héréditaire.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des cibles et voies épigénétiques à promouvoir.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation de C. elegans, l'ARNi et les techniques de chromatine immunoprécipitée.
- Exige un accès à une microscopie à fluorescence et à des instruments de qPCR pour des mesures quantitatives.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles d'évaluation et de préparation des échantillons.
- Peut être adapté à différents constructions rapporteuses et marques de chromatine moyennant des modifications du protocole.
- La ChIP sur organisme entier peut limiter la spécificité germinale ; des adaptations futures pourraient remédier à cette limitation.
F.A.Q. sur la bio-pharmacie
Chapters in this video
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Introduction
1:17
Bleaching and Plating Caenorhabditis elegans P0 Generation Embryos onto RNAi-NGM plates
3:47
Passaging and Scoring the Caenorhabditis elegans P0 Generation for Germline GFP Expression
5:42
Collection of F1 Generation Caenorhabditis elegans for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
6:38
Formaldehyde Crosslinking of the F1 Generation of Caenorhabditis elegans for ChIP
7:50
Sonication of Formaldehyde-Crosslinked Caenorhabditis elegans and Chromatin Immunoprecipitation
