Name: Une technique tridimensionnelle pour la visualisation des changements ultrastructuraux mitochondriaux dans les cellules cancéreuses du pancréas (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Découvrez une technique de microscopie électronique 3D pour visualiser les changements ultrastructuraux mitochondriaux dans les cellules cancéreuses du pancréas. Cette méthode améliore l'efficacité d'imagerie et permet une analyse qualitative et quantitative des organites.

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Cette recherche a été financée par des subventions de la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang (Z23H290001, LY19H280001); subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82274364, 81673607 et 81774011); ainsi que le projet de recherche sur le bien-être public de la subvention scientifique et technologique de Huzhou (2021GY49, 2018GZ24). Nous apprécions l’aide, le soutien technique et le soutien expérimental de la plate-forme publique du Centre de recherche médicale, de l’Académie des sciences médicales chinoises, de l’Université médicale chinoise du Zhejiang.

1. Préparation du matériel
<ol><li>Culture de 2 x 106 cellules Panc02 dans 12 mL de milieu DMEM (10 % de sérum fœtal bovin et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine), et maintenir à 37 °C et 95 % d’humidité dans une atmosphère de 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’air pendant 48 h.</li>
	<li>Recueillir les cellules Panc02, centrifuger à 28 x g pendant 2 min, puis jeter le surnageant. Assurez-vous que l’échantillon est d’une taille appropriée (1 x 107 cellules), sinon les étapes de fixation et de déshydratation suivantes ne fonctionneront pas bien.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de glutaraldéhyde à 2,5 % comme fixateur pour fixer les cellules fraîches de Panc02 dans les tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL pendant une nuit à 4 °C. REMARQUE : Les échantillons doivent être centrifugés à 1 006 x g pendant 5 minutes dans chacune des étapes suivantes (étapes 1.3-1.11).</li>
	<li>Aspirer le fixateur et rincer les échantillons deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 0,1 M, puis rincer deux fois à l’eau bidistillée (ddH2O) à température ambiante pendant 10 minutes chacun.</li>
	<li>Ajouter 50 μL d’une solution contenant 1 % de tétroxyde d’osmium (OsO4) et 1,5 % de ferrocyanure de potassium dans un rapport de 1:1 à 4 °C pendant 1 h. Ensuite, rincez deux fois avec 0,1 M PBS pendant 10 minutes à chaque fois, et rincez avec ddH2O pendant encore 10 min.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de thiocarbohydrazide (TCH) à 1 %, incuber à température ambiante pendant 30 min à 1 h, puis rincer avec duddH2Oquatre fois pendant 10 min à chaque fois.</li>
	<li>Ajouter 50 μL d’OsO4 à 1%, fixer à température ambiante pendant 1 h, puis rincer avec du ddH2O quatrefois pendant 10 min à chaque fois.</li>
	<li>Ajouter 1 mL d’acétate d’uranyle à 2 % à 4 °C pendant une nuit, puis rincer avec duddH2Oquatre fois pendant 10 minutes à chaque fois.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de solution Walton (0,066 g de nitrate de plomb dissous dans 10 mL de solution mère d’acide aspartique 0,03 mol/L) à 60 °C pour 1 heure supplémentaire d’incubation.</li>
	<li>Rincer avec ddH2O quatre fois pendant 10 min à chaque fois, puis déshydrater en série d’alcool gradué pendant 10 minutes à chaque fois: 50% d’alcool, 70% d’alcool, 80% d’alcool et 90% d’alcool 1x et 100% d’alcool 2x. Ensuite, déshydratez deux fois dans de l’acétone à 100% pendant 10 minutes. Utilisez 1 mL de chaque solution pour la déshydratation.</li>
	<li>Mélanger 200 μL d’acétone avec de la résine époxy Pon 812 dans un rapport de 3:1, 1:1 et 1:3. Faire tremper l’échantillon dans de la résine à température ambiante pendant 2 h, 4 h et 4 h, respectivement, puis prélever la résine époxy 100% Pon 812 pour imprégner pendant la nuit. REMARQUE: Lors de l’exécution des étapes de coloration et d’incorporation de résine, il est important de fonctionner dans une hotte car ce sont des substances toxiques. De plus, des blouses de laboratoire et des gants résistants aux solvants doivent être portés pendant l’expérience.</li>
	<li>Mettre les échantillons dans un moule d’encastrement, puis les placer dans une étuve à 60 °C pendant 48 h pour polymériser. Utilisez un enrobage plat29 pour réduire l’apparence de la résine autour de l’échantillon. Cela simplifie l’installation du spécimen et diminue l’impact des artefacts de charge sur la segmentation ultérieure de l’image. REMARQUE: Pour générer par la suite une surface de coupe horizontale, une petite quantité de résine peut être ajoutée dans le trou du moule, en prenant soin de ne pas trop le remplir.</li>
	<li>Préparer les plaquettes de silicium en les lavant d’abord puis en les hydrophilisant avec une solution concentrée deH2SO4/H2O2pendant 30 min. Recueillir en série des bandes de tranches d’une épaisseur de 70 nm sur les plaquettes de silicium hydrophilisé à l’aide d’un ultramicrotome et les sécher dans un four à 60 °C pendant 10 min. REMARQUE: Capturez lentement la tranche pendant que la tranche flotte à la surface des plaquettes pour éviter la perte ou la déformation de la tranche.</li>
</ol>2. Acquisition d’images et reconstruction tridimensionnelle
<ol><li>Avant de monter une plaquette de silicium sur la scène, lavez les sections avec de l’eau distillée trois fois et séchez-les à l’air. Découpez un ruban de carbone conducteur d’une taille de 1 cm x 0,5 cm et collez-le entre la plaquette de silicium et l’étage de l’échantillon MEB pour compléter la configuration de l’échantillon (Figure 2E).</li>
	<li>Réglez le paramètre de tension d’accélération FE-SEM sur 2 kV avec une distance de travail de 4 mm (Figure 3B et Tableau 1). REMARQUE: Afin d’améliorer le rapport signal sur bruit et de réduire le bruit dans l’image, observez à faible grossissement chaque fois que possible. Au fur et à mesure que le multiple augmente, la portée de balayage du MEB diminue, ce qui entraîne une augmentation de l’accumulation de charge sur les images.</li>
	<li>Cliquez sur l’icône H/L dans la barre de menu supérieure. Tout d’abord, à faible grossissement, orientez la première section des bandes de découpe cibles, puis cliquez à nouveau sur l’option H/L (Figure 3A) pour passer en mode de grossissement élevé ; Collectez une image appropriée pour la structure d’intérêt en ajustant la luminosité, le contraste et l’agrandissement de l’image.</li>
	<li>Sélectionnez Project View > Open Data et importez les fichiers image à analyser dans le logiciel.</li>
	<li>Alignez les images en cliquant sur Aligner les tranches > Modifier (Figure 4B) et ajustez la valeur Plage d’intensité dans la barre de menu inférieure gauche en modifiant la transparence de l’image. Ici, utilisez une stratégie d’alignement semi-automatique; Plus précisément, grâce à l’alignement automatique, faites en sorte que les images se chevauchent avec une image précédente, puis effectuez un réglage manuel fin. REMARQUE: Dans ce travail, pendant le processus d’alignement, l’image précédente a été utilisée comme référence, et les opérations de déplacement et de rotation ont été utilisées pour chevaucher au maximum la structure cible des deux images. Cliquer sur Aligner la paire de tranches actuelle peut aider à aligner les images automatiquement, mais un mauvais placement peut se produire.</li>
	<li>Sélectionnez le module Extraire le sous-volume et découpez les ensembles de données alignés pour les adapter à la taille de la partie qui se chevauche de l’ensemble de la pile.</li>
	<li>Sous la sous-section Segmentation (Figure 4C), sélectionnez Rééchantillonner > segmentation > Enregistrer. Choisissez le seuil de la baguette magique et la taille de l’outil Pinceau pour sélectionner la plage appropriée. Là encore, adoptez une méthode de segmentation semi-automatique en utilisant d’abord la baguette magique pour sélectionner automatiquement une grande surface appropriée, puis utilisez le pinceau pour décrire avec précision les détails. REMARQUE: La baguette magique peut être appliquée pour segmenter les images en fonction des différences évidentes d’intensité en pixels existant entre la structure d’intérêt et les structures environnantes en modifiant la valeur de masquage et en utilisant la ligne limite de dessin. Il est incapable de distinguer les artefacts de charge générés lors de l’acquisition d’images. Par conséquent, cela peut entraîner une segmentation incorrecte pour les régions cibles. L’outil Pinceau peut être utilisé pour segmenter manuellement afin de reconstruire avec précision les structures biologiques.</li>
	<li>Sous Segmentation > Selection, cliquez sur l’icône + pour ajouter la zone sélectionnée (Figure 4C).</li>
	<li>Répétez l’étape ci-dessus (2.8) pour sélectionner la même structure cible dans différentes images jusqu’à ce que la sélection soit terminée pour reconstruire les microstructures d’intérêt. REMARQUE: Pendant les processus de remodelage mitochondrial, la sélection de l’objet cible doit être effectuée à partir de l’image au milieu d’un groupe d’images séquentielles. Si la zone requise est sélectionnée à partir de la première ou de la dernière image, le résultat de la reconstruction ne pourra pas présenter une visualisation 3D complète.</li>
	<li>Une fois la segmentation régionale terminée, générez le fichier image en fonction des meilleurs résultats pour la taille de l’objet et la résolution de l’image. Cliquez sur Crop Editor (Éditeur de recadrage), puis entrez le chiffre 6 dans la zone Virtual Slider (Figure 4C).</li>
	<li>Dans le menu déroulant de gauche, cliquez avec le bouton droit sur la zone grise sous la sous-section Projet , puis sélectionnez Générer une surface > Créer > Appliquer. Dans le fichier généré, utilisez le module Surface View pour créer la structure de surface et la représentation 3D.</li>
</ol>3. Quantification
<ol><li>Cliquez sur Remove Small Spots > Apply (Supprimer les petites taches ) (Figure 4D). Dans la sous-section Projet , cliquez avec le bouton droit sur la zone grise, puis sélectionnez Analyse d’étiquette > Appliquer (Figure 4D).</li>
	<li>Personnalisez le nom de la colonne et choisissez un groupe de mesures. Sélectionnez Volume3d et Longueur3d dans la zone Mesures natives. </li>
	<li>Cliquez sur le bouton Appliquer dans le coin inférieur gauche de l’écran. Copiez les données et le graphique dans le logiciel statistique, tel que GraphPad.</li>
</ol>

Technique 3D pour visualiser les crêtes mitochondriales dans les cellules cancéreuses du pancréas

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

La méthode présentée ici est un guide étape par étape utile pour appliquer la technique de reconstruction 3D, qui implique l’application de la microscopie électronique et de la technologie de traitement d’images à l’empilement et à la segmentation d’images tomographiques 2D générées à partir de sections ultraminces en série. Ce protocole met en évidence une limitation des images 2D qui peut être abordée par la visualisation 3D de l’ultrastructure de l’organite, qui présente les avantages d’une forte reproductibilité des ...

Les mitochondries sont l’un des organites les plus importants de la cellule. Ils servent de plaque tournante de la bioénergétique cellulaire et du métabolisme 1,2 et jouent un rôle essentiel dans le cancer3. Le cancer du pancréas (CP) est l’un des cancers les plus difficiles àtraiter4 en raison de sa propagation rapide et de son taux de mortalité élevé. Le dysfonctionnement mitochondrial, qui est principalement causé par des changements dans la morphologie mitochondriale 3,5,6,7, a été lié aux mécanismes de la maladie sous-jacents PC8. Les mitochondries sont également très dynamiques, ce qui se reflète dans les changements fréquents et dynamiques de leur connectivité réseau et de leur structurecritique 9. Le remodelage de la structure des cristae peut avoir un impact direct sur la fonction mitochondriale et l’état cellulaire 10,11, qui sont considérablement modifiés au cours de la croissance des cellules tumorales, des métastases et des changements du microenvironnement tumoral 12,13.
Ces dernières années, les scientifiques ont étudié cet organite en utilisant l’observation EM14,15,16,17; par exemple, les chercheurs ont analysé la dynamique mitochondriale à l’aide de techniques de reconstruction 3D 6,7,18,19. Le concept général et la méthode de reconstruction 3D d’images de microscopie électronique ont été formellement établis dès 196820 et impliquaient la combinaison de la microscopie électronique, de la diffraction électronique et du traitement d’images par ordinateur pour reconstruire la queue du phage T4. Jusqu’à présent, la technologie d’imagerie 3D par microscopie électronique a fait des progrès significatifs en termes de résolution d’image21, de degré d’automatisation 22 et de volume de traitement 23 et a été utilisée à une échelle de plus en plus large dans la recherche biologique, du niveau tissulaire à l’ultrastructure des organites à l’échelle nanométrique24. Ces dernières années, l’imagerie 3D par microscopie électronique est également devenue une technologie prometteuse pour un large éventail d’applications25,26,27.
L’attention croissante portée aux cristae mitochondriales illustre particulièrement les exigences essentielles de l’imagerie ultrastructurale du volume. La microscopie électronique à transmission (MET) a été utilisée pour visualiser des échantillons prélevés sur une grille de cuivre (400 mesh)28, le faisceau d’électrons traversant la section. Cependant, en raison de la portée limitée de la grille de cuivre, il est impossible d’imager complètement des tranches continues du même échantillon29. Cela complique l’étude des structures cibles lors de l’imagerie TEM. De plus, la GDT repose sur des tâches manuelles longues et sujettes aux erreurs, y compris la découpe et la collecte de plusieurs tranches et leur imagerie séquentielle21, de sorte qu’elle n’est pas adaptée aux reconstructions ultrastructurales d’échantillons de grand volume23. À l’heure actuelle, la reconstruction à haute résolution d’échantillons d’échantillons de grand volume est réalisée grâce à l’utilisation d’équipement spécialisé, comme le réseau de caméras TEM (TEMCA)30 ou deux systèmes TEMCA de deuxième génération (TEMCA2)31, qui permettent d’obtenir rapidement des images automatisées à haut débit. Cependant, ce type d’imagerie n’a pas l’avantage d’être facile à obtenir et universel en raison de la nécessité d’un équipement personnalisé.
Par rapport à la TEM, la méthode de génération automatique de milliers d’images volumétriques série pour de grandes surfaces basée sur SEM32,33 améliore l’efficacité et la fiabilité de l’imagerie série et offre des résolutions z34 plus élevées. Par exemple, la microscopie électronique à balayage en bloc en série (SBF-SEM) et la microscopie électronique à balayage par faisceau d’ions focalisés (FIB-SEM) ont toutes deux permis de réaliser la reconstruction 3D de l’ultrastructure avec une vitesse, une efficacité et une résolution élevées35,36. Cependant, il est inévitable que la surface du bloc soit rasée mécaniquement par le couteau diamanté du SBF-SEM ou par fraisage avec le faisceau d’ions focalisé de FIB-SEM33,37. En raison du caractère destructeur des deux méthodes pour les échantillons, il n’est pas possible de reconstruire la même structure cible pour une analyse plus approfondie38,39,40. De plus, peu d’études ont tenté de reconstruire l’ultrastructure 3D des organites des cellules cancéreuses en utilisant EM pour observer des changements pathologiques12. Pour ces raisons, afin d’élucider davantage les mécanismes pathologiques des cellules cancéreuses, telles que les cellules cancéreuses du pancréas, nous proposons une nouvelle technologie pour la reconstruction 3D d’images de coupe en série à l’aide d’un ultramicrotome et d’un microscope électronique à balayage par émission de champ (FE-SEM) pour analyser l’ultrastructure mitochondriale au niveau des crêtes; Grâce à cette technologie, des données haute résolution peuvent être acquises à l’aide d’une méthode efficace et accessible. Les sections ultraminces en série réalisées à l’aide d’un ultramicrotome peuvent être stockées de manière semi-permanente dans un boîtier de grille et réimagées plusieurs fois, même après plusieurs années41. FE-SEM est un outil très apprécié dans divers domaines de recherche en raison de sa capacité à fournir une imagerie haute résolution, un grossissement élevé et une polyvalence42. Dans une tentative d’afficher la structure fine des organites en 3D, la technique de production d’empilements d’images 2D en série avec une résolution utile en utilisant des électrons rétrodiffusés produits par FE-SEM 43,44 peut également être utilisée pour obtenir une imagerie à haut débit et multi-échelle des régions cibles ou de leurs structures associées sans équipement spécial 45. La génération d’artefacts de charge affecte directement la qualité des images acquises, il est donc particulièrement important de garder le temps de séjour court.
Ainsi, la présente étude développe les procédures expérimentales employées dans cette technique SEM pour reconstruire la structure 3D des cristae mitochondriales46. Plus précisément, nous montrons le processus développé pour réaliser la segmentation semi-automatique des régions mitochondriales et numériser la reconstruction 3D à l’aide du logiciel Amira, ce qui implique également de faire des échantillons de tranches en utilisant la méthode conventionnelle de préparation des échantillons OTO44,47, de compléter la collection de sections en utilisant le découpage ultramicrotome et d’acquérir des données 2D séquentielles par FE-SEM.

<table><tbody><tr><td>(1S,3R)-RSL3</td><td>MCE</td><td>HY-100218A</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>SIGMA</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td>2020.2</td></tr><tr><td>Acide aspartique</td><td>MCE</td><td>HY-42068</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s modified Eagle' s medium</td><td>Gibco</td><td>11995115</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Ferrostatine-1</td><td>MCE</td><td>HY-100579</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>10437010</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage à émission de champ</td><td>HITACHI</td><td>SU8010</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10500.22</td><td></td></tr><tr><td>Plomb nitrate</td><td>SANTA CRUZ</td><td>sc-211724</td><td></td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium</td><td>SANTA CRUZ</td><td>sc-206008B</td><td></td></tr><tr><td>Panc02</td><td>Collection européenne de cultures cellulaires authentifiées&nbsp ;</td><td></td><td></td>98102213</tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Biosharp</td><td>BL505A</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>Pon 812 Résine époxy</td><td>SPI CHEM</td><td>GS02660</td> Ferrocyanure de potassium Macklin P816416 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazide</td><td>Merck</td><td>223220</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>LEICA</td><td>EMUC7</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle</td><td>RHAWN</td><td>R032929</td><td></td></tr></tbody></table>

une technique tridimensionnelle pour la visualisation des changements ultrastructuraux mitochondriaux dans les cellules cancéreuses du pancréas

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

Comprendre les caractéristiques dynamiques de l’ultrastructure de l’organite cellulaire, qui est non seulement riche en informations inconnues, mais aussi sophistiquée d’un point de vue tridimensionnel (3D), est essentiel pour les études mécanistes. La microscopie électronique (EM) offre une bonne profondeur d’imagerie et permet la reconstruction d’empilements d’images à haute résolution pour étudier la morphologie ultrastructurale des organites cellulaires, même à l’échelle nanométrique; par conséquent, la reconstruction 3D gagne en importance en raison de ses avantages incomparables. La microscopie électronique à balayage (MEB) fournit une technologie d’acquisition d’images à haut débit qui permet de reconstruire de grandes structures en 3D à partir de la même région d’intérêt dans des tranches consécutives. Par conséquent, l’application du MEB dans la reconstruction 3D à grande échelle pour restaurer la véritable ultrastructure 3D des organites devient de plus en plus courante. Dans ce protocole, nous suggérons une combinaison de coupes ultraminces en série et de techniques de reconstruction 3D pour étudier les cristae mitochondriales dans les cellules cancéreuses du pancréas. Les détails de la façon dont ces techniques sont exécutées sont décrits dans ce protocole étape par étape, y compris la méthode osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO), l’imagerie en série de la section ultramince et l’affichage de visualisation.

Au cours de la culture cellulaire (Figure 1A), nous avons d’abord divisé les cellules cancéreuses du pancréas en un groupe témoin cultivé avec un milieu de culture complet, un groupe (1S,3R)-RSL348 (RSL3, un activateur de la ferroptose, 100 nM) et un groupe RSL3 (100 nM) plus ferrostatine-149 (Fer-1, un inhibiteur de la ferroptose, 100 nM). Grâce aux étapes expérimentales ci-dessus, le microscope électronique à balayage a acquis 38 (figure supp...

Ce protocole décrit comment reconstruire des cristae mitochondriales pour obtenir une imagerie 3D avec une grande précision, une haute résolution et un débit élevé.

Une technique tridimensionnelle pour la visualisation des changements ultrastructuraux mitochondriaux dans les cellules cancéreuses du pancréas

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

Ce projet vise à examiner l’effet anticancéreux des médicaments en modifiant la structure à l’échelle nanométrique subcellulaire et en établissant le lien entre la morphologie des organites et le mécanisme pathologique du cancer. Cette technologie combine la technologie traditionnelle de microscopie électronique avec la technologie de reconstruction tridimensionnelle sans équipement spécial. Par rapport à d’autres techniques, il peut améliorer l’efficacité de l’imagerie et la flexibilité de reconstruction, ainsi que la reconstruction réelle des structures cibles à tout moment.C’est donc très facile et universel. Cette technologie de reconstruction tridimensionnelle des lames ultra-minces continues peut restaurer à plusieurs reprises le stéréochimique réel sans équipement spécifique coûteux. Il peut être utilisé pour l’analyse qualitative et quantitative de tous les organites à tout moment.Il réalise le fonctionnement facile de l’observation.

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Préparation et test métabolique des co-cultures 3-dimensional sphéroïde de fibroblastes et de cellules de cancer du pancréas

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Ultrastructure Mitochondrial 3D de Drosophila vol Indirect musculaire révélée par la série-section Electron Tomography

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Imagerie et quantification de la morphologie mitochondriale chez C. elegans au cours du vieillissement

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