Fluorométrie fonctionnelle dirigée dans des cellules natives pour étudier l’excitabilité des muscles squelettiques
2 juin 2023
La fluorométrie fonctionnelle dirigée par site est une méthode permettant d’étudier les mouvements du domaine protéique en temps réel. La modification de cette technique pour son application dans les cellules natives permet maintenant la détection et le suivi des mouvements du capteur de tension unique à partir de canaux Ca2+ voltage-dépendants dans des fibres musculaires squelettiques isolées murines.
CaV1.1, un membre des canaux ioniques voltage-dépendants, possède quatre capteurs de tension distincts. Les preuves suggèrent que certains capteurs de tension contribuent davantage à l’activation des récepteurs de la ryanodine ou au courant calcique. Notre objectif est de pouvoir identifier le rôle précis de chaque capteur de tension dans le couplage excitation-contraction et l’activation des canaux calciques.
Le couplage excitation-contraction a été étudié depuis le début des années 50, mais les détails moléculaires de la façon dont ce processus se produit sont encore inconnus. Les progrès récents dans la structure microscopique cyro-électronique du canal, la caractérisation d’une nouvelle protéine accessoire CaV1.1, la découverte d’une variante d’épissage alternative du canal et l’identification de mutations pathogènes ont ravivé l’intérêt dans ce domaine. De nombreuses techniques sont utilisées dans notre domaine, de l’électrophysiologie classique et de la biologie moléculaire à des techniques plus novatrices telles que la cryo-microscopie électronique, la simulation dynamique moléculaire, la dégradation ciblée des protéines et la fluorométrie fonctionnelle dirigée sur site ainsi que des cellules modifiées ou des modèles animaux.
Actuellement, le carburant fait face à plusieurs défis expérimentaux. Dans un muscle squelettique, un trafic et une communication appropriés entre CaV1.1 et RyR1, ainsi que de nombreuses protéines régulatrices, sont essentiels pour soutenir le couplage excitation-contraction. Les méthodes permettant d’étudier directement ces interactions protéine-protéine entre CaV1.1 et RyR1 sont manquantes ou incomplètes.
Le laboratoire du Dr Martin Schneider travaille sur le couplage excitation-contraction depuis des décennies, caractérisant les mécanismes de détection de tension dans le CaV1.1, la libération de calcium et les événements localisés de libération de calcium, connus sous le nom d’étincelles de calcium. Récemment, notre laboratoire a mis en œuvre de nouvelles techniques optiques pour étudier diverses étapes du couplage excitation-contraction et du mouvement du capteur de tension dans les cellules musculaires adultes fonctionnelles. Alors que cela a été fait auparavant dans un système d’expression hétérologue, notre protocole permet maintenant de suivre les changements de conformation dans les capteurs de tension CaV1.1 lors d’un potentiel d’action propagé dans son environnement d’origine.
Notre nouvelle technique nous permettra d’étudier le mouvement précis du capteur de tension nécessaire au couplage excitation-contraction. Nous voulons savoir quels résidus de charge dans chaque S4 sont critiques pour sa fonction, ou exactement chaque S4 se transloque, et tout ce qui est translocation est lié à l’ouverture CaV1.1 ou à l’activation du récepteur de la ryanodine.
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Aperçu
Cette étude examine le mouvement des capteurs de tension dans les canaux calciques activés par voltage Kv1.1, essentiels au couplage excitation-contraction dans le muscle squelettique murin. En utilisant une fluorométrie fonctionnelle dirigée par site, les chercheurs permettent le suivi en temps réel des mouvements de ces domaines protéiques dans leur contexte cellulaire d'origine.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Accouplement excitation-contraction
- Canaux ioniques activés par le voltage
- Mouvements des domaines protéiques
Contexte
- Kv1.1 possède quatre senseurs de voltage distincts associés à la signalisation calcique.
- Comprendre leurs rôles précis pourrait éclairer les mécanismes sous-jacents à la contraction musculaire.
- Les techniques précédentes ne permettaient pas d'étudier ces dynamiques dans des environnements natifs.
Méthodes utilisées
- Fluorométrie fonctionnelle dirigée par site
- Fibres musculaires squelettiques de rongeur
- Marquage par protéine fluorescente et enregistrement du courant ionique
Résultats principaux
- Surveillance en temps réel des mouvements des capteurs de voltage pendant les potentiels d'action.
- Modifications de configuration des capteurs de voltage Kv1.1 corrélées au couplage excitation-contraction.
- Validation de l'effet de résidus chargés spécifiques sur la fonctionnalité des capteurs de voltage.
Conclusions
- L'étude fournit des aperçus sur le comportement dynamique des capteurs de tension essentiels à la fonction musculaire.
- Cette méthodologie améliore la compréhension de la physiologie normale ainsi que des états pathologiques liés à l'excitation musculaire.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La fluorométrie fonctionnelle dirigée vers des sites spécifiques dans des cellules musculaires squelettiques natives permet l'analyse en temps réel des changements conformationnels des canaux ioniques voltage-dépendants, fournissant directement des informations pour la validation précoce des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans la recherche sur l'excitabilité musculaire. Cette approche comble l'écart entre les systèmes hétérologues et les modèles physiologiquement pertinents, renforçant la fiabilité prédictive des portefeuilles ciblant les canaux ioniques. Son intégration soutient des décisions plus éclairées d'aller ou de ne pas aller de l'avant dans les phases de découverte et précliniques axées sur les indications neuromusculaires et les channelopathies.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet une interrogation directe de la fonction du capteur de voltage dans des fibres musculaires natives pour une validation robuste de la cible.
- Précise la contribution mécanistique de domaines spécifiques du canal au couplage excitation-contraction.
- Renforce la fiabilité prédictive en reliant les réarrangements structuraux aux résultats fonctionnels dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Facilite la détection biologique des risques en confirmant l'interaction avec la cible dans des contextes physiologiquement pertinents.
Développement de criblages et de tests
- Prépare des systèmes de fibres musculaires validés pour le criblage en aval de modulateurs affectant la conformation ou la fonction des canaux.
- Permet des mesures quantitatives et reproductibles par fluorescence et électrophysiologie afin de normaliser les tests.
- Facilite l'évolutivité et la réutilisation de la plateforme en adaptant le protocole à d'autres canaux ioniques et protéines.
- Améliore la fiabilité de l'évaluation des composés en intégrant des mesures structurelles et fonctionnelles en temps réel.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des modèles pertinents pour la maladie en utilisant des fibres musculaires murines adultes afin d'assurer une continuité translationnelle.
- Permet des décisions d'avancement ajustées au risque en fournissant un éclairage mécanistique sur les défauts du couplage excitation-contraction.
- Facilite l'harmonisation des biomarqueurs grâce à la mesure quantitative de la dynamique des capteurs de voltage liée aux résultats fonctionnels.
- Réduit les risques dans les programmes précliniques ciblant les canalopathies en validant des hypothèses mécanistiques dans un tissu natif.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'intègre dans le continuum de découverte, depuis la validation précoce de cibles jusqu'à l'identification de candidats et les études mécanistiques précliniques, en particulier pour les programmes portant sur les canaux ioniques et l'excitabilité musculaire.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en mesurant directement les déplacements des capteurs de voltage pendant les potentiels d'action.
- Triage : Fournit des systèmes prêts à l'emploi et reproductibles, dotés de sorties quantitatives en fluorescence et en courant.
- Analyse : Offre des mesures quantitatives résolues temporellement des changements conformationnels, permettant des analyses comparatives entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité grâce à l'utilisation de fibres musculaires natives, facilitant l'alignement avec des biomarqueurs et des modèles de maladies.
- Réutilisation à grande échelle : Propose une plateforme réutilisable, adaptable à d'autres canaux ioniques et protéines membranaires dans les tissus musculaires et excitables.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles canaux ioniques.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité des tests fonctionnels dans les systèmes natifs.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions de poursuite ou d'abandon et l'efficacité du capital en permettant une réduction précoce des risques mécanistiques.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement, ajustés au risque, des programmes ciblant les canaux ioniques et les muscles.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en électrophysiologie, en imagerie de fluorescence et en biologie moléculaire pour la conception des constructions et l'interprétation des données.
- Requiert un instrument spécialisé pour l'enregistrement simultané de la fluorescence et du courant dans les fibres musculaires.
- Exige une standardisation interéquipes afin d'assurer la reproductibilité sur différents canaux ioniques et constructions.
- L'adaptation à d'autres systèmes modèles peut nécessiter une optimisation des protocoles de transfection et de marquage.
- Les limites potentielles incluent les colorations de fond et les artefacts de mouvement, nécessitant des contrôles expérimentaux rigoureux.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Introduction
2:55
Construct Design for Transfecting Cysteine‐Engineered Voltage‐Gated Ca2+ Channels in Murine Isolated Skeletal Muscle Fibers
4:05
Assessment of EGFP‐Positive Fiber Electrical Activity, Cysteine Staining, and Signal Acquisition
