Name: Évaluation de l’impact d’un nouveau système de processeur de cellules de refroidissement sur l’installation d’isolement des cellules d’îlots (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-11T12:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Découvrez l'évaluation d'un système de processeur de cellules refroidi pour l'isolement des îlots, améliorant la viabilité cellulaire humaine en salle blanche GMP. Cette méthode optimise le récupération des cellules mononucléées.

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Les auteurs tiennent à remercier l’Institut européen de génomique pour le diabète (ANR-10- LABEX-0046 à FP) et l’Institut métabolique du Qatar - Hamad medical corporation, Qatar. Les auteurs remercient également le Centre de recherche médicale de la Hamad Medical Corporation pour le soutien aux frais de traitement des articles.

Ce protocole utilise du sang total jeté, impropre à l'usage conformément aux directives d'élimination de l'établissement. L'approbation du comité d'éthique et le consentement éclairé ne s'appliquent pas.
1. Configuration du processeur de cellules refroidi
REMARQUE : Toutes les procédures doivent être effectuées dans un environnement de salle propre, et le personnel doit respecter les procédures relatives aux vêtements de salle propre.
<ol>
	<li>Achat du matériel
	<ol>
		<li>Acheter un couvercle de rechange en plexiglas. Acheter le système de refroidissement, comprenant un refroidisseur avec un contrôleur de température de flux gazeux réfrigéré mécaniquement, un sécheur d'air, un régulateur de pression et de débit, ainsi que la garantie (facultative). Voir le Tableau des matériaux pour les références. 
		NOTE : Le coût total est de 16 133 $, hors frais d'expédition ou de douane.</li>
		<li>Commander de l'air médical sec, un gaz médical comprimé conforme à la norme standard (référence de la pharmacopée européenne 1238), auprès du fournisseur local de gaz médicaux. Acheter 2 bouteilles de 6,8 m3 (47 L : 23 cm x 153 cm ; diamètre x longueur).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mise en place du matériel (Figure 1 et Figure 2)
	<ol>
		<li>Introduire le matériel dans la salle propre GMP (désinfecter avant d'entrer dans la salle propre conformément aux procédures GMP).</li>
		<li>Pour l'air comprimé de qualité médicale, installer une ligne de gaz au lieu de placer directement la bouteille de gaz dans la salle propre.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Modification du cell processor pour le refroidissement
	<ol>
		<li>Retirer d'abord le couvercle en plexiglas. Conserver le couvercle d'origine au cas où un problème surviendrait avec la garantie. Percer un trou dans le couvercle de rechange du cell processor, dont le diamètre correspond au diamètre extérieur de l'embout du dispositif de refroidissement, afin d'éviter que le couvercle de la centrifugeuse ne se fende (un diamètre de 13,3 mm est recommandé).</li>
		<li>Fixer des supports ensemble avec une pièce circulaire en mousse. Cette étape permet d'éviter la casse et/ou les rayures du couvercle, de maintenir l'embout du refroidisseur en place au-dessus du cell processor, de protéger le couvercle contre une flexion excessive due à la pression élevée de l'air injecté, de supporter le poids de l'embout, et enfin d'assurer la sécurité maximale de l'opérateur en lui permettant un accès libre et sécurisé à toutes les fonctions nécessaires du cell processor pendant la procédure expérimentale.</li>
		<li>Relier le système de refroidissement au cell processor en fixant l'embout de refroidissement dans le trou du plexiglas. Le fixer à l'aide de supports et de tampons en mousse.</li>
		<li>Placer le boîtier du système de réfrigération à une distance maximale de 8 pieds (2,44 m) de l'embout. Placer le contrôleur de température dans un coffret séparé, à moins de 6 pieds (1,83 m) du boîtier de réfrigération.</li>
		<li>Régler le point de consigne du refroidisseur à -40 °C pour refroidir le flux d'air dans le refroidisseur. La température de sortie de l'air est indiquée en continu sur l'afficheur numérique avec une résolution de 0,1 °C. Régler la température de sortie numériquement à 0,1 °C à l'aide du contrôleur de température.</li>
		<li>Régler la pression et le débit de l'alimentation en air sur le module régulateur de pression et de débit (Figure 2) avant l'entrée dans le refroidisseur. Les régler respectivement à 55 psi et à un débit de 4 SCFM afin d'obtenir des conditions optimales pour un flux d'air refroidi à -30 °C ± 2 °C.</li>
		<li>Vérifier que l'alimentation en gaz médical est réglée à une pression de sortie de 5 bar et qu'elle peut durer au moins 90 minutes, car cela est nécessaire pour que l'air comprimé atteigne -30 °C. 
		&#8203;NOTE : L'air médical sec est un gaz médical comprimé, et l'air sec entièrement pressurisé est conforme à la norme standard.</li>
		<li>Délivrer 5 bar depuis un embout de refroidisseur relié au couvercle du cell processor à travers un trou percé dans le couvercle de la centrifugeuse. Injecter l'air médical refroidi à l'intérieur du bol de centrifugation du cell processor (Figure 2). Choisir la position d'injection de l'air de manière à ce que l'air refroidi soit dirigé perpendiculairement au rebord en aluminium du rotor de la centrifugeuse.</li>
		<li>Lors de la préparation du cell processor, s'assurer que le rotor est à température ambiante (18 °C). Régler le thermostat automatique du système de refroidissement à -30 °C et diriger les injections d'air froid vers le rotor. 
		NOTE : Différentes conditions expérimentales ont été testées afin d'obtenir un gradient de température optimal de +4 °C, nécessaire pour surmonter la résistance thermique du système de séparation cellulaire du cell processor et le chauffage du rotor pendant la centrifugation. Le thermostat programmé maintiendra la température cible optimale à l'intérieur de l'appareil de traitement cellulaire pendant la procédure, en particulier pendant la centrifugation, à une température de salle propre de +18 °C.
		<ol>
			<li>Configurer le cell processor avec une première phase de pré-refroidissement pour refroidir l'appareil (sans le kit du cell processor) à +3 °C pendant 30 à 45 minutes, puis une deuxième phase de pré-refroidissement consistant à faire fonctionner le cell processor avec le kit prérefroidi à +4 °C à 134 x g, pendant 5 minutes.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Comptage des particules en suspension dans l'air
<ol>
	<li>Évaluer la conformité du dispositif de refroidissement avec l'environnement de salle propre conforme aux BPF selon la norme ISO 14644-1 afin d'analyser l'impact des équipements thermiques pendant la phase de fonctionnement.</li>
	<li>Utiliser la surveillance du comptage des particules pour fournir une preuve que le niveau requis de propreté est atteint aux points critiques de contrôle au repos et en fonctionnement.
	<ol>
		<li>Le nombre minimal de points d'échantillonnage dépend de la surface mesurée. Calculer ce nombre à l'aide de l'équation 
		<img alt="Équation 1" src="/files/ftp_upload/65321/65321eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 
		&#8203;où A est la surface de la salle propre ou de l'espace contrôlé à air propre en m2, et NL est le nombre de points d'échantillonnage arrondi à l'entier supérieur.</li>
		<li>Le volume d'échantillonnage aéroporté correspond au volume minimal prélevé à chaque emplacement. S'assurer que le volume d'air est suffisamment grand pour compter 20 particules de la taille maximale spécifiée. Calculer le volume d'échantillonnage aéroporté à l'aide de l'équation 
		V = 20/C × 1000 
		où V est le volume minimal d'échantillonnage unique par emplacement, exprimé en L, et C est la limite de classe (nombre de particules/m3).</li>
		<li>Pour chaque emplacement, selon la surface, prélever un ou plusieurs échantillons. S'assurer que le volume minimal prélevé à chaque emplacement est de 2 L et que la durée minimale d'échantillonnage est d'au moins 1 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Avant l'échantillonnage, purger le compteur de particules à l'aide d'un filtre de purge. Retirer le filtre et le placer avec la sonde isocinétique pour l'échantillonnage.</li>
	<li>Placer l'appareil compteur de particules à l'emplacement d'échantillonnage identifié. Démarrer la collecte d'échantillons depuis l'écran principal du dispositif compteur de particules.</li>
	<li>Lorsque l'échantillonnage est terminé, déplacer le compteur de particules vers l'emplacement suivant. Une fois tous les emplacements d'échantillonnage terminés, examiner les données et imprimer un rapport.</li>
	<li>Lorsque la concentration moyenne de particules pour tous les points d'échantillonnage dans la zone est inférieure à la limite de classe indiquée dans Tableau 1, considérer que la pièce satisfait aux exigences en matière de concentration admissible de particules.</li>
</ol>
3. Préparation du gradient et traitement de la séparation cellulaire
<ol>
	<li>Avant l'expérimentation, prérefroidir toute la nuit à +4 °C les gradients de densité légère et lourde ainsi que les kits de traitement des cellules.4 &#176;C dans un réfrigérateur.</li>
	<li>Prérefroidir le processeur de cellules pendant 45 min au repos (c'est-à-dire mettre le processeur de cellules sous tension avant utilisation). Maintenir la température entre +2 &#176;C et +5 &#176;C. Insérer le kit de traitement des cellules prérefroidi à +4 &#176;C.</li>
	<li>Pour le mélangeur de gradient standard à double enveloppe refroidi à l'éthanol (facultatif ; Figure 3) relier les 2 chambres en verre et les placer sur un agitateur magnétique. Pincer le tube entre les 2 chambres. Refroidir le générateur de gradient à l'aide d'un système de refroidissement par circulation d'éthanol équipé d'un refroidisseur thermostaté à circulation d'éthanol à 0 &#176;C.</li>
	<li>Tout d'abord, préparez le chargement de la couche dense au fond du sac en remplissant la chambre avec 130 mL de gradient de densité élevé (HD ; 1,087 g/mL). Chargez à une vitesse de pompe de 150 mL/min.</li>
	<li>Une fois le gradient lourd dans le sac, ajouter 130 mL de gradient à haute densité (HD) dans le bécher avant et 140 mL de gradient à basse densité (BD ; 1,063 g/mL) dans le bécher arrière (pince fermée).</li>
	<li>Déserrer l'hémostat/le clamp entre les deux chambres et établir un gradient continu à une vitesse de pompe de 50 mL/min.</li>
	<li>Préparer à l'avance des cellules mononucléées à partir de culots blancs humains à purifier à partir de plusieurs culots blancs anonymes regroupés, provenant de déchets de sang total (40 mL à 60 mL de sang total ont été ajoutés à 10 poches de culot blanc), selon la disponibilité fournie par la banque de sang.
	<ol>
		<li>Séparation des MNC
		<ol>
			<li>Utilisez la centrifugation en gradient de densité pour l'isolement des cellules mononucléées humaines à faible densité. Pour ce faire, suivez les étapes décrites ci-dessous.</li>
			<li>Pour la préparation des cellules, calculez le volume de sang (sang total anticoagulé ou culot blanc en suspension). Diluez le sang avec une solution tampon 2 à 4 fois son volume en effectuant des inversions douces pour homogénéiser. Plus la dilution du sang est importante, meilleure est la pureté des cellules mononucléées.</li>
			<li>Préparer le tampon en mélangeant du tampon phosphate avec un anticoagulant. Calculer le nombre de tubes nécessaires en divisant le volume de sang par 35 mL et verser 15 mL de solution de gradient de densité 1,073 dans chaque tube.</li>
			<li>Superposer graduellement 35 mL de la suspension sanguine diluée sur le gradient de densité en la faisant couler délicatement à la surface du gradient à l’aide d’une seringue de 60 mL munie d’une aiguille ; pour les petits volumes, utiliser une pipette. Veiller à ne pas perturber l’interface, car cela entraînerait une mauvaise formation de la couche mononucléaire.</li>
			<li>Centrifuger à 400 x g pendant 20 min à 20 &#176;C sans aucune interruption (accélération&#160;0, décélération&#160;0). Après centrifugation, récupérez délicatement la couche d'interface des cellules mononucléées à l'aide d'une pipette de transfert stérile. Transférez les cellules dans un autre tube conique neuf de 50 mL.</li>
			<li>Laver les cellules 2 fois avec du tampon (PBS contenant un anticoagulant ajouté). Pour le premier lavage, remplir le tube contenant les cellules avec du tampon jusqu'à 50 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 20 &#176;C pour former un culot cellulaire (accélération&#160;9, décélération&#160;0). Retirer délicatement tout le surnageant avec précaution.</li>
			<li>Effectuer le deuxième lavage pour éliminer les plaquettes. Resuspendre le culot dans un volume de 50 mL de tampon. Centrifuger à 200-300 x g pendant 10 min à 20 &#176;C (accélération&#160;9, décélération&#160;0).</li>
			<li>Réconstituez les cellules à un volume final de 5 mL ; ces cellules doivent avoir une densité spécifique comparable à celle des MNC de faible densité. &#60;1.073. Mesurer la densité spécifique du gradient à l'aide d'un densimètre.</li>
			<li>Resuspendre le culot dans un volume final de 100 mL avec 95 mL de milieu de gradient de haute densité (1,083 g/mL) dans un sac de transfert. Utiliser ce produit pour la purification à l’aide d’un séparateur de cellules. Le volume final de 100 mL contient les cellules et le milieu de gradient de haute densité 1,083. 
			REMARQUE : Le culot blanc peut être conservé au réfrigérateur pendant la nuit dans du PBS contenant 0,5 % de BSA ou du plasma autologue. Le culot blanc peut également être lavé.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Déposer délicatement sur les gradients préformés un maximum de 30 mL de cellules mononucléées (MNC) isolées du buffy coat, suspendues dans 100 mL de milieu de conservation concentré, à l’aide d’une pompe péristaltique à un débit de 25 mL/min. Maintenir le gradient à +4 &#176;C.</li>
	<li>Mesurer en continu la température à l'intérieur du processeur de cellules à l'aide d'une sonde thermométrique préétalonnée. À l’aide d’un thermocouple numérique relié à une sonde thermométrique stérile, surveiller la température des gradients et des cellules pendant le processus.</li>
</ol>
4. Optimisation des différentes étapes du chargement par gradient
<ol>
	<li>Insérez le kit du processeur cellulaire pré-refroidi à +4 °C. Chargez le gradient dense (130 mL) à +4,5 °C. À la fin du chargement du gradient, réglez la centrifugeuse à une vitesse relativement faible (537 x g) afin de minimiser la chaleur générée par le rotor.</li>
	<li>Éteignez le processeur cellulaire pour permettre au système hydraulique de revenir à son niveau préalable au fonctionnement et de libérer l’air.</li>
	<li>Redémarrez le processeur cellulaire à 537 x g et ajoutez les gradients de densité élevée (130 mL) et faible (140 mL) afin de créer un gradient de densité continu à +4,3 °C et à un débit de 50 mL/min.</li>
	<li>Chargez la couche blanche (30 mL) avec 100 mL de milieu de conservation froid à +6 °C et à un débit de 25 mL/min. Ajoutez 50 mL (25 mL x 2) de solution de lavage.</li>
	<li>Après 5 min à +5 °C, récupérez le gradient centrifugé dans 12 flacons à un débit de 100 mL/min.</li>
	<li>Remplissez les tubes avec le milieu de lavage (M199 + 20 % d'albumine humaine + 10 % de pénicilline-streptomycine). Remplissez le tube 1 avec 100 mL de milieu de lavage et 150 mL de cellules, et les tubes 2 à 12 avec 225 mL de milieu de lavage et 25 mL de cellules.</li>
</ol>

Advancements in Cooling Cell Processors for Enhanced Viability in Cell Therapy

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+centrifugal+blood+cell+processor+for+washing+platelet+concentrates%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates.</a> Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).</li>
<li>Lake, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+purification+of+human+islets+utilizing+discontinuous+albumin+gradient+on+IBM+2991+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator.</a> Diabetes. 38, 143-145 (1989).</li>
<li>Ricordi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+and+allotransplantation+in+22+consecutive+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases.</a> Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).</li>
<li>Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+separation+utilizing+a+closed+automated+purification+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet separation utilizing a closed automated purification system.</a> Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).</li>
<li>Bampton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Australian+experience+with+total+pancreatectomy+with+islet+autotransplantation+to+treat+chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22ANZ+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis.</a> ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).</li>
<li>Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRISM%3A+A+Novel+Human+Islet+Isolation+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique.</a> Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).</li>
<li>Shimoda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+purification+method+using+large+bottles+effectively+achieves+high+islet+yield+from+pig+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas.</a> Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).</li>
<li>Noguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Islet+Purification+from+Large+Mammals+and+Humans+Using+a+COBE+2991+Cell+Processor+versus+Large+Plastic+Bottles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+trial+of+the+Edmonton+protocol+for+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation.</a> The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Institutes+of+Health-Sponsored+Clinical+Islet+Transplantation+Consortium+Phase+3+Trial%3A+Manufacture+of+a+Complex+Cellular+Product+at+Eight+Processing+Facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities.</a> Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).</li>
<li>Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cooling+systems+during+islet+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of cooling systems during islet purification.</a> Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).</li>
<li>Rilo, H. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+islet+number+and+viability+obtained+during+purification+on+Euro-Collins-Ficoll+gradients+processed+on+a+refrigerated+or+nonrefrigerated+COBE+2991+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator.</a> Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).</li>
<li>Chadwick, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+purification+using+bovine+serum+albumin%3A+The+importance+of+density+gradient+temperature+and+osmolality%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality.</a> Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+pancreatic+islet+isolation+around+Europe%3A+results+of+a+survey+study%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study.</a> Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).</li>
<li>Chadwick, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+of+pancreatic+digest+before+islet+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Storage of pancreatic digest before islet purification.</a> Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).</li>
<li>Amrani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detrimental+effects+of+temperature+on+the+efficacy+of+the+University+of+Wisconsin+solution+when+used+for+cardioplegia+at+moderate+hypothermia.+Comparison+with+the+St.+Thomas+Hospital+solution+at+4+degrees+C+and+20+degrees+C%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C.</a> Circulation. 86, 280-288 (1992).</li>
<li>Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+hypothermic+cardiac+storage+with+University+of+Wisconsin+solution.+An+assessment+with+human+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).</li>
<li>Adewola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+cooling+systems+for+the+COBE+2991+cell+separator+used+in+the+purification+of+human+pancreatic+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans.</a> Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).</li>
<li>Keymeulen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+standardized+beta-cell+grafts+in+a+liver+segment+of+IDDM+patients%3A+graft+and+recipients+characteristics+in+two+cases+of+insulin-independence+under+maintenance+immunosuppression+for+prior+kidney+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft.</a> Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).</li>
<li>de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in type 1 diabetes.</a> BMJ. 342, (2011).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lemarie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+single-platform+method+for+the+enumeration+of+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells.</a> Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Les installations d’isolement des îlots pancréatiques du monde entier adoptent depuis des décennies la purification des îlots humains dans un processeur de cellules réutilisé. Bien que certaines installations de production d’îlots continuent de traiter les îlots dans un processeur de cellules non réfrigéré, la plupart des centres utilisent une version réfrigérée du processeur de cellules 10,11,15. Les centres placent soit le pro...

La transplantation d’îlots de Langerhans pour le diabète de type 1 sévère peut restaurer la sécrétion endogène d’insuline et est devenue la norme de soins dans un certain nombre de pays1. L’isolement des îlots est une procédure en plusieurs étapes qui comprend une digestion enzymatique et mécanique chaude du pancréas, suivie de phases refroidies pour la récupération des tissus digérés et la purification des îlots avec des gradients de densité continus ou discontinus sur un processeur de cellules. Le refroidissement rapide ralentit la phase de digestion enzymatique et protège les îlots des enzymes digestives libérées par la contamination des cellules acineuses. Le processeur de cellules a été conçu à l’origine pour séparer les composants sanguins cellulaires à température ambiante2. Il a été réutilisé pour purifier les îlots pancréatiques humains de Langerhans en 19893. Depuis trois décennies, les îlots humains ont été purifiés pour des essais cliniques et, plus récemment, pour des soins standard, soit dans un processeur de cellules avec des gradients discontinus4, soit avec des gradients de densité continus1 fabriqués avec un gradient maker1 ou un mélangeur informatisé équivalent5,6,7. D’autres groupes ont signalé la purification d’îlots de Langerhans à partir de grands mammifères et d’humains à l’aide de grandes bouteilles cylindriques en plastique 8,7,9, ce qui a considérablement amélioré l’efficacité de la purification et la qualité des îlots.
En effet, compte tenu de l’étalon-or pour purifier les îlots humains pour la transplantation clinique10,11, le processeur de cellules fabriqué était sans réfrigération. Conséquence directe du manque de réfrigération, les îlots ont été exposés à des températures plus élevées pendant l’étape de purification. Lors de la centrifugation, une augmentation incontrôlée de la température se produit en raison du frottement mécanique du rotor12,13. Les processeurs de cellules ont été adaptés avec un système de refroidissement dans les centres d’isolement des îlots pancréatiques qui a statistiquement augmenté la sécrétion d’insuline induite par le glucose et la viabilité cellulaire, confirmant l’avantage de maintenir les îlots pancréatiques à basse température pendant la procédure de purification14,15.
Il convient de noter qu’à la fin des années 1980, 10 prototypes réfrigérés ont été construits pour réduire les dommages aux îlots lors de la purification du gradient de densité, mais n’ont pas reçu plus d’attention. Les prototypes de processeurs à cellules étaient basés sur le refroidissement de la broche et du bol avec du polyéthylène glycol réfrigéré. En particulier, les solutions de purification des îlots de Langerhans, y compris les solutions de préservation des organes et les gradients de densité des polysaccharides, peuvent être délétères pour la viabilité des îlots lorsqu’elles sont utilisées à température ambiante ou au-dessus16,17,18. Une comparaison des différentes stratégies de refroidissement du processeur de cellules pour la purification des cellules d’îlots par rapport au processeur de cellules non réfrigérées d’origine a été évaluée pour lutter contre l’augmentation incontrôlée de la température qui se produit en raison de la friction du rotor. Plusieurs tentatives ont été faites pour refroidir le processeur cellulaire lors de la purification des îlots de Langerhans humains. Le processeur de cellules peut être logé temporairement ou définitivement dans une chambre froide spécialement conçue pour maintenir une température de 0 à 8 °C19 pendant la centrifugation en gradient qui est actuellement utilisée dans les centres d’isolement des îlots de Langerhans de l’Université de l’Illinois à Chicago19, de l’Université de Miami14, des installations de l’Université d’Oxford15et l’Université de San Francisco (l’unité de refroidissement personnalisée enveloppe le processeur de cellules). Une autre modification comprend le refroidissement du cœur de l’axe du processeur de cellule avec un système de refroidissement utilisant un refroidissement à l’azote liquide contrôlé électroniquement à Genève, en Suède et en République tchèque15,19. Une autre alternative au milieu de l’année 2000 a été le refroidissement du cœur du processeur de cellules avec une unité de climatisation 12 ou par refroidissement liquide de l’arbre à l’Université de Lille.
Les modifications de refroidissement du processeur de cellule ne sont pas facilement disponibles et comportent des risques (humidité, accumulation de condensation) dans les environnements de salle blanche GMP, y compris la perte de garantie et le refus du constructeur d’entretenir la machine. Par conséquent, certains centres d’îlots, notamment Milan, en Italie, Oslo, en Norvège, et Édimbourg, en Écosse, n’utilisent pas de système de refroidissement pour les processeurs de cellules pendant le processus de purification des îlots15.
La présente étude a été conçue pour tester l’efficacité d’un refroidisseur facilement disponible nouvellement développé en conjonction avec un système de processeur de cellules minimalement modifié. En bref, le refroidisseur à air décrit ici est un échangeur de chaleur réfrigéré mécaniquement contrôlant la température de 1 pied cube standard par minute (SCFM) de gaz sec entre -40 °C et -100 °C. Ce système de refroidissement nécessite une alimentation en air médical sec. L’air circulera à travers la conduite et l’échangeur de chaleur et sortira par la buse (7,9 mm). Un élément chauffant situé à l’intérieur de la buse fournit de la chaleur pour contrôler la température du flux d’air. Un couvercle de centrifugeuse en plastique solide de rechange a été acheté et des modifications minimales ont été apportées. Un trou de 13,3 mm de diamètre a été percé dans le couvercle, et l’air refroidi a été acheminé de la buse de refroidissement au processeur de cellules via le trou dans le couvercle de la centrifugeuse. L’air médical refroidi a été injecté à l’intérieur du bol de centrifugation du processeur de cellule avec un contrôle constant de la température des liquides ou des gradients de densité.
Nous avons évalué les performances techniques du processeur de cellules refroidies et l’impact de l’élément de refroidissement sur l’environnement de la salle blanche GMP. L’objectif principal était d’atteindre une température très basse (<10 °C) lors de la purification des îlots de Langerhans afin de préserver la viabilité. En utilisant une séparation de densité de couche leucocytaire comme indicateur de l’isolement des îlots de Langerhans, nous avons déterminé l’efficacité de ce protocole de refroidissement sur la viabilité cellulaire.

<table><tbody><tr><td><fort>Équipement</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compteur de particules d’air</td><td>Lasair III&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AirJet XR40° ;</td><td>SP Scientific</td><td>Système FTS XR40</td><td></td></tr><tr><td>Armoire de biosécurité</td><td>Thermo Scientific</td><td>EQ-1301</td><td></td></tr><tr><td>Refroidisseur à circulation</td><td>Julabo</td><td>CF30</td><td></td></tr><tr><td>COBE 2991&nbsp ;</td><td>Terumo BCT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plateau de refroidissement conique</td><td>Biorep</td><td>CCT-01</td><td></td></tr><tr><td>Fabricant de dégradé à double enveloppe&nbsp ;</td><td>personnalisé en interne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KJT-Thermocouple Thermomètre</td><td>Hanna Instruments HI93551N</td><td></td><td>Pour mesurer la température des liquides</td></tr><tr><td>Agitateur magnétique&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880014</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique&nbsp ;</td>Thermomètre <td>MasterFlex</td><td>MK-77921-79</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Extech Instruments</td><td>RMS 430</td><td>Pour Bain</td></tr> de <tr><td>Perles Sans Eau</td><td>de température COBE Cole-Parmer</td><td>10122-00</td><td></td></tr><tr><td>Matériaux et réactifs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Kit de dénombrement de cellules souches</td><td>BD Biosciences&nbsp ;</td><td></td><td></td>344563</tr><tr><td>COBE 2911 kit de tubulure</td><td>Terumo BCT</td><td>90819</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques 250ml</td><td>Corning</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>Gradient densité 1.1</td><td>Biochrom&nbsp ;</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>Bouteilles jetables graduées</td><td>Thermo fisher</td><td>382019-1000</td><td></td></tr><tr><td>Albumine humaine 20 %&nbsp ;</td><td>Kedrion Biopharma</td><td>8091600</td><td></td></tr><tr><td>M199 solution de lavage&nbsp ;</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>99-784-CM&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Masterflex</td><td></td><td>Masterflex 96400-6</td><td></td></tr><tr><td>Medical Dry Air</td><td>Linde Healthcare</td><td>Medi On 22</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin-streptomycin&nbsp ;</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Thermosonde</td><td>Biorep</td><td>TC-02</td><td>Thermocapteur</td></tr><tr><td>Trypan bleu&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Université du Wisconsin Belzer (UW)&nbsp ;</td><td>Pont de la Vie&nbsp ;</td><td>RM/N 4055</td><td>Milieu de conservation</td></tr></tbody></table>

Évaluation de l’impact d’un nouveau système de processeur de cellules de refroidissement sur l’installation d’isolement des cellules d’îlots

Evaluation of the Impact of a New Cooling Cell Processor System on Islet Cell Isolation Facility

L’équipement de thérapie cellulaire standard, y compris le processeur de cellules de référence pour purifier les îlots humains en vue d’une transplantation clinique, est rarement réfrigéré, ce qui peut exposer les cellules à des températures élevées pendant l’étape de centrifugation. Les systèmes de refroidissement personnalisés ont un avantage direct sur la viabilité et le fonctionnement des îlots de Langerhans. La présente étude a été conçue pour tester l’efficacité d’un nouveau système de processeur de cellules réfrigérées facilement disponible nécessitant des modifications minimales et pour évaluer son impact sur la viabilité des cellules humaines et l’environnement de la salle blanche GMP. Le système de refroidissement, un échangeur de chaleur réfrigéré mécaniquement réglé à -30 °C, a été utilisé pour fournir de l’air sec refroidi de qualité médicale au bol du processeur de cellules par un trou percé dans le couvercle de la centrifugeuse. En raison de la disponibilité limitée de donneurs de pancréas au Qatar, la validation du système a été effectuée avec une purification continue par gradient de densité de la moelle osseuse humaine en pool. La stérilité, la turbulence et le nombre de particules ont été mesurés dans des environnements de salle blanche de classe C et de classe B. Aucune turbulence ne s’est développée autour du processeur de cellule refroidie, et aucune particule en suspension dans l’air de 0,5 μm et 5 μm n’a été générée conformément aux normes GMP des salles blanches. Au début et à la fin des étapes de collecte, la température est passée respectivement à 21,50 °C ± 0,34 °C et 21,93 °C ± 0,20 °C dans le processeur à cellules non refroidies et à seulement 10,9 °C ± 0,17 °C et 11,16 °C ± 0,35 °C dans le processeur à cellules refroidies (p <0,05). Le processeur de cellules refroidies a permis d’améliorer à la fois la récupération (98 %) de la fraction de cellules mononucléées et la viabilité (100 % ± 2 %) du post-traitement. Le nouveau système de refroidissement réduit efficacement la chaleur produite par le processeur de cellules tout en n’ayant aucun impact particulaire sur l’environnement de la salle blanche GMP. Le processeur de cellule refroidi décrit ici est une méthode peu coûteuse (16 000 $ sans compter les taxes, le dédouanement et le transport) et peu invasive pour fournir un refroidissement robuste. À l’heure actuelle, cette technologie dans l’installation de thérapie cellulaire GMP est appliquée à l’isolement et à la transplantation de cellules d’îlots pancréatiques humains dans le cadre du programme clinique.

L'impact du processeur de cellules refroidi sur le laboratoire propre GMP a d'abord été quantifié. Des méthodes normalisées ont utilisé un compteur de particules mesurant la contamination particulaire aérienne dans un environnement de laboratoire propre conforme aux classes GMP C et B, en des points critiques situés à proximité du processeur de cellules et du système de refroidissement par air sous pression. Les résultats ont démontré qu'aucune turbulence ne s'est développée autour de l'équipement. Les données enregistré...

Le protocole décrit ici un système de processeur de cellule de refroidissement personnalisé compatible avec une salle blanche conforme aux bonnes pratiques de fabrication (BPF) pour améliorer la viabilité des cellules après le post-traitement.

Standard cell therapy equipment, including the gold standard cell processor to purify human islets for clinical transplantation, is rarely refrigerated, ...

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Évaluation de l’impact d’un nouveau système de processeur de cellules de refroidissement sur l’installation d’isolement des cellules d’îlots (Vidéo) | JoVE Journal

Évaluation de l’impact d’un nouveau système de processeur de cellules de refroidissement sur l’installation d’isolement des cellules d’îlots

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