Name: Injections intracérébrales intra-ventriculaires à main levée chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Découvrez une technique rapide d'injections intracérébrales intra-ventriculaires à main levée chez la souris sans stéréotaxie. Cette méthode simple permet d'étudier le contrôle neuroendocrinien de la reproduction et la régulation hormonale sous stress.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier la Dre Kellie Breen Church, M. Michael Kreisman et Mme Jessica Jang pour leur contribution à la collecte des données présentées dans les résultats représentatifs. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.).

Toutes les procédures ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État du Colorado (#3960) et de l’Université de Californie à San Diego, où les données représentatives ont été recueillies (S13235, PI Kellie Breen Church). Les données de cinq souris femelles adultes et de deux souris mâles adultes C57/BL6 (âgées de 9 à 16 semaines) sont présentées dans la section des données représentatives. Les souris femelles ont été ovariectomisées 3 à 4 semaines avant l’injection d’ICV et le prélèvement sanguin comme décrit précédemment7. Avant l’expérimentation, ces souris étaient logées avec un cycle de lumière de 12 h et de lumière sombre de 12 heures et avaient libre accès à de la nourriture et de l’eau conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.
1. Réalisation d’une craniotomie
REMARQUE : La craniotomie peut être effectuée un ou plusieurs jours avant l’injection proprement dite, ce qui rend le processus d’injection plus rapide le jour de l’expérience.
<ol><li>Préparez le matériel pour la craniotomie comme décrit ci-dessous.<ol><li>Placez un tampon d’établi propre ou un matériau de drapé sur la surface de travail. Collez le cône de nez d’un vaporisateur d’isoflurane sur la surface de travail (près de l’expérimentateur, mais face à lui ; voir Figure 1A).</li>
		<li>Placez le tube silastic à l’extrémité d’une aiguille pointue stérile de 18 G de manière à ce que ~1 mm de la pointe de l’aiguille dépasse. Placez la tubulure silastic à l’extrémité d’une aiguille émoussée stérile de manière à ce que ~1 mm de la pointe de l’aiguille dépasse. REMARQUE : Des aiguilles préemballées séparées et stériles (pointues et émoussées) doivent être utilisées pour chaque souris.</li>
		<li>Rassemblez un rasoir électrique, un gommage à l’iode, une gaze stérile et des tampons imbibés d’alcool pour préparer le site d’injection.</li>
	</ol></li>
	<li>Entraînez-vous à déplacer une aiguille de 2 mm latéralement et de 1 mm caudale comme décrit ci-dessous.<ol><li>À l’aide d’une règle et d’un stylo, marquez une feuille de papier avec un point de départ (il s’agira d’un bregma), une marque de 2 mm à gauche ou à droite et une autre marque de 1 mm au-dessus de la dernière (il s’agira du site d’injection ; voir la figure 1B).</li>
		<li>Entraînez-vous à déplacer l’aiguille du point de départ au point de repère 1 au point de repère 2 (du bregma au site d’injection) jusqu’à ce que vous soyez sûr que le mouvement est répétable sans guides. REMARQUE : Les coordonnées décrites ici sont efficaces chez les souris adultes C57/BL6, mais d’autres souches ou groupes d’âge peuvent nécessiter un ajustement.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez la souris à la craniotomie comme décrit ci-dessous.<ol><li>Placez la souris dans une chambre d’induction et anesthésiez-la avec 3 à 4 % d’isoflurane dans de l’oxygène de qualité médicale. Avec de la pratique et une familiarité avec la procédure, réduisez la durée totale de l’exposition à l’isoflurane à moins de 10 minutes pour la procédure de craniotomie. ATTENTION : L’exposition à l’isoflurane est dangereuse pour la santé humaine ; Utilisez un vaporisateur d’isoflurane approuvé et inspecté dans un endroit bien ventilé avec des moyens de piéger les gaz résiduaires.</li>
		<li>Une fois le réflexe des orteils absent, rasez la tête de l’animal. Appliquez un lubrifiant pour les yeux.</li>
		<li>Placez la souris sur le plan de travail avec la tête dans le cône de nez pour maintenir l’anesthésie.</li>
		<li>Administrer un agent analgésique, tel que la buprénorphine (0,6 à 0,8 mg/kg de poids corporel de souris, par voie sous-cutanée), selon les directives du fournisseur.</li>
		<li>Nettoyez le site d’injection en essuyant la tête avec de la gaze stérile trempée dans une solution d’iode (effectuez trois gommages), puis essuyez avec un tampon de gommage à l’alcool (effectuez trois fois). REMARQUE : Retirez la fourrure et nettoyez la peau autour du site d’injection et utilisez des instruments et des aiguilles stériles, comme recommandé par l’American Veterinary Medical Association pour prévenir les infections.</li>
	</ol></li>
	<li>Tenez fermement la tête de la souris avec la main non dominante. Positionnez la tête aussi à plat que possible sur le plan de travail.</li>
	<li>Localisez le site de l’injection.<ol><li>Utilisez l’aiguille pointue de 18 G préparée pour identifier d’abord le bregma ; Pour cela, faites glisser l’aiguille sur la peau de la tête le long de la ligne médiane, en vous déplaçant dans le plan rostral-caudal. Imaginez un triangle équilatéral dans lequel les deux sommets sont les yeux et le troisième sommet est l’emplacement approximatif du bregma (voir Figure 1C).</li>
		<li>À partir de bregma, déplacez l’aiguille latérale de 2 mm et caudale de 1 mm jusqu’au site d’injection.</li>
	</ol></li>
	<li>Tout en tenant l’aiguille verticalement, poussez fermement l’aiguille à travers la peau et l’os jusqu’à ce que le tube affleure la peau.</li>
	<li>Rétractez l’aiguille, faites tourner l’aiguille et appuyez à nouveau sur la peau et l’os. Répétez le processus jusqu’à ce qu’un petit trou soit créé dans l’os.</li>
	<li>Utilisez l’aiguille émoussée pour vérifier qu’un trou suffisant a été produit dans l’os. Essayez de faire une ouverture dans l’os suffisamment grande pour que l’aiguille émoussée puisse passer à travers.</li>
	<li>Retirez la souris du cône nasal, nettoyez tout sang du site d’injection avec de la gaze stérile et placez la souris dans une cage sur un chauffe-cage jusqu’à ce qu’elle soit réveillée. Étant donné que l’ouverture faite par la craniotomie est petite (aiguille de 18 G), le site n’a pas besoin d’être fermé avec une suture ou des clips de plaie. REMARQUE : L’ouverture produite ici est petite (18 G), de sorte que de nombreux établissements considèrent cette procédure comme une injection par opposition à une chirurgie. De plus, bien qu’une ouverture à travers la peau et les os vers le cerveau soit faite, le maintien de la peau tendue entraîne l’alignement des trous, ce qui aide probablement à empêcher la flore cutanée ou la litière de la cage d’entrer en contact avec le cerveau.</li>
</ol>2. Faire l’injection
<ol><li>Préparez les matériaux pour l’injection comme décrit ci-dessous.<ol><li>Placez un tampon d’établi propre ou un matériau de drapé sur la surface de travail. Collez le cône de nez d’un vaporisateur d’isoflurane sur la surface de travail (près de l’expérimentateur, mais face à lui ; voir Figure 1A).</li>
		<li>Fixez une aiguille de 27 G de 10 mm de long avec un biseau de 45° sur une seringue en verre de 5 μL. Placez le tube silastic sur l’aiguille de manière à ce que 3,5 mm de la pointe de l’aiguille dépassent ; utilisez du ruban adhésif de laboratoire pour maintenir la tubulure sur le corps de la seringue (voir Figure 1D).</li>
		<li>Préparez le milieu d’injection (médicament, virus ou autre liquide pour injection) dans un tube. Pour obtenir les résultats représentatifs de cette étude, une solution saline isotonique stérile a été injectée. REMARQUE : Choisissez un tube qui permet l’accès par la seringue en verre et l’aiguille, comme un tube de microcentrifugation de 2 ml.</li>
		<li>Prélever 3 μL de milieu d’injection dans la seringue en verre. Tout d’abord, prélevez plus que le volume souhaité et éjectez jusqu’à ce qu’il reste 3 μL dans la seringue.</li>
		<li>Rassemblez un gommage à l’iode, une gaze stérile et des tampons imbibés d’alcool pour préparer le site d’injection.</li>
		<li>Démarrez une minuterie de laboratoire en mode compte à rebours et placez la minuterie de manière à ce qu’elle soit visible par l’expérimentateur pendant les injections.</li>
		<li>Entraînez-vous à déplacer une aiguille de 2 mm latéralement et de 1 mm caudale comme effectué la veille.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez la souris pour l’injection comme décrit ci-dessous.<ol><li>Placez la souris dans la chambre d’induction et anesthésiez-la avec de l’isoflurane. Une fois que le réflexe des orteils est absent, appliquez un lubrifiant pour les yeux et placez la souris sur le plan de travail avec la tête dans le cône du nez.</li>
		<li>Nettoyez le site d’injection avec trois lingettes d’iode et d’alcool. Identifiez le site d’injection à l’aide d’une aiguille de 18 G (ou d’une aiguille émoussée) comme décrit à l’étape 1.8. Le trou créé lors de la craniotomie doit être détectable. REMARQUE : Si la craniotomie n’a pas été effectuée à l’avance, ou si le trou dans le crâne n’est pas détectable, la craniotomie peut être effectuée ici.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuez l’injection à l’aide d’une seringue en verre comme décrit ci-dessous.<ol><li>Tenez fermement la tête de la souris avec la main non dominante. Positionnez la tête aussi à plat que possible sur le plan de travail.</li>
		<li>Placez l’aiguille de la seringue en verre dans le trou du crâne jusqu’à ce que le tube placé sur l’aiguille préparée à l’étape 2.1.2 repose sur la peau de la souris.</li>
		<li>Tenez la seringue aussi verticalement que possible, en faisant attention aux plans coronal et sagittal. Injectez lentement le média sur une période de 1 min.</li>
		<li>Maintenez la seringue et l’aiguille en place pendant une minute de plus après la fin de l’injection pour minimiser le reflux. Rétractez lentement l’aiguille de la tête de la souris.</li>
		<li>Retirez la souris du cône nasal, nettoyez tout sang du site d’injection avec de la gaze stérile (s’il y en a) et placez la souris dans une cage sur un chauffe-cage jusqu’à ce qu’elle soit réveillée.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Confirmation de l’emplacement de l’injection
<ol><li>Anesthésier en profondeur et perfuser la souris avec une solution saline et du paraformaldéhyde à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) comme décrit précédemment8. Conservez le cerveau dans 30 % de saccharose dans du PBS à 4 °C jusqu’à ce que le cerveau s’enfonce (généralement 2 jours).</li>
	<li>Couper des coupes coronales de 20 à 50 μm sur un cryostat comme décrit précédemment9. Lors de la section, observez le tractus d’injection dans le bloc tissulaire. Notez si le tractus d’injection coupe clairement le ventricule latéral.</li>
</ol>

Réalisation d’une injection intra-ventriculaire chez la souris à l’aide d’une approche à main levée

<ol><li>Roseweir, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+potent+kisspeptin+antagonists+delineate+physiological+mechanisms+of+gonadotropin+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation.</a> Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).</li>
<li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51863(2014).</li>
<li>Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+intracerebroventricular+injection+of+CD4%28%2B%29+T+cells+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100725(2021).</li>
<li>Russo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+control+of+the+female+reproductive+axis+through+gated+responsiveness+of+the+RFRP-3+system+to+VIP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling.</a> Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).</li>
<li>Laursen, S. E., Belknap, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+injections+in+mice.+Some+methodological+refinements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Methods%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements.</a> Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).</li>
<li>Haley, T. J., McCormick, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+effects+produced+by+intracerebral+injection+of+drugs+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse.</a> British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).</li>
<li>McCosh, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-induced+hypoglycaemia+suppresses+pulsatile+luteinising+hormone+secretion+and+arcuate+Kiss1+cell+activation+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813(2019).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Comba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+glioma+subregions+for+spatial+and+molecular+characterization+of+intratumoral+heterogeneity%2C+oncostreams%2C+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion.</a> Journal of Visual Experiments. (158), e60939(2020).</li>
<li>Porteous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reformulation+of+PULSAR+for+analysis+of+pulsatile+LH+secretion+and+a+revised+model+of+estrogen-negative+feedback+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice.</a> Endocrinology. 162 (11), (2021).</li>
<li>Hohmann, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+melanocortins+in+mediating+leptin%27s+central+effects+on+feeding+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrative%2C+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).</li>
<li>Gottsch, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+kisspeptins+in+the+regulation+of+gonadotropin+secretion+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse.</a> Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).</li>
<li>Krasnow, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+galanin-like+peptide+in+the+integration+of+feeding%2C+body+weight+regulation%2C+and+reproduction+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse.</a> Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici un moyen simple et efficace de faire des injections d’ICV chez la souris. Étant donné que cette technique ne nécessite pas de cadre stéréotaxique, cette approche pour l’administration centralisée de médicaments et d’agents expérimentaux est accessible à un plus grand nombre de chercheurs. De plus, cette approche est relativement rapide puisque la procédure de préparation et d’injection peut être effectuée rapidement.
Étant donné que cette procédure nécessite la manipulation d’aiguilles et d’une seringue en verre à la main en utilisant des distances approximatives, il est conseillé au nouveau praticien de consacrer un peu de temps à la pratique des mouvements avant de travailler avec des animaux vivants. De plus, les cadavres de souris peuvent être utiles pour s’entraîner à identifier le bregma avec l’aiguille. Une fois qu’une certaine confiance dans le mouvement est acquise, l’expérience avec des animaux d’entraînement vivants dévoués est utile. Lors des séances d’entraînement, l’injection de 3 μL d’encre de Chine facilite l’évaluation visuelle de la mise en place de l’injection. Des injections correctement placées entraîneront une coloration noire dans le ventricule latéral ipsilatéral et souvent dans le troisième ventricule et le ventricule latéral controlatéral. L’injection d’encre est une procédure terminale et les souris ne doivent pas être autorisées à se remettre de l’anesthésie après l’injection d’encre. Même les praticiens expérimentés peuvent bénéficier de la répétition du mouvement latéral de 2 mm et du mouvement caudal de 1 mm plusieurs fois avant de faire une injection. De plus, il est important de tenir la seringue en verre verticalement lorsqu’elle est placée dans le cerveau. Avec de la pratique, on peut s’attendre à ce que >75 % des injections soient correctement placées. Maintenir l’aiguille en place pendant ~ 1 min après l’injection du volume complet peut aider à empêcher le reflux du liquide hors du cerveau. Pendant ce temps, il est essentiel de tenir l’aiguille dans la bonne position sans mouvement. La réussite de cette procédure nécessite de l’expérience dans la manipulation et la tenue fiables de l’aiguille et de la seringue en verre.
Si certaines injections ne sont pas placées correctement, il existe plusieurs options de dépannage. Tout d’abord, vérifiez que l’aiguille d’injection est droite (non pliée) et que l’aiguille est bien fixée à la seringue en verre. Ensuite, si l’emplacement des injections manquées est variable, une pratique supplémentaire de manipulation et de tenue de la seringue en verre est justifiée. Il peut également être utile d’avoir une personne supplémentaire pour repérer si la seringue est tenue verticalement pendant l’injection. Trouver du bregma sur une peau intacte avec l’aiguille nécessite également de la pratique. Il est fortement recommandé de prendre le temps d’identifier avec certitude ce point de repère avant de procéder à l’injection. Si les injections sont systématiquement placées au mauvais endroit, il sera nécessaire de modifier les coordonnées de l’injection. Les coordonnées décrites ici (±2 mm latérales, 1 mm caudale à bregma) sont efficaces chez les souris adultes C57/BL6, mais ces coordonnées devront peut-être être ajustées pour d’autres souches ou groupes d’âge.
Bien que cette technique puisse être très efficace pour livrer rapidement des agents de manière centralisée, il existe certaines limites. Étant donné que le piston de la seringue est déplacé à la main, le taux d’injection peut être variable. Il est conseillé de l’injecter relativement lentement pour éviter les effets potentiels hors cible de la pression dans le système ventriculaire. Un volume d’injection de 3 μL est recommandé dans ce protocole ; cependant, un volume d’injection plus important (5 μL) a été utilisé dans d’autres laboratoires11. Selon le résultat mesuré, il peut être nécessaire d’ajuster le volume et le débit d’injection. Par exemple, les souris juvéniles peuvent ne tolérer que de plus petits volumes d’injection. C’est pourquoi il est recommandé de procéder à des expériences préliminaires pour tester les effets des véhicules. Une limite supplémentaire est que la confirmation de la mise en place correcte de l’injection se limite à une évaluation quelque peu subjective du tractus d’injection après le prélèvement du tissu. Le tractus injectable est visible dans les tissus fraîchement congelés et perfusés de paraformaldéhyde prélevés plusieurs heures après l’injection d’ICV (voir les images dans les résultats représentatifs). Si plusieurs injections sont effectuées, il se peut que les marques du tractus ne permettent pas de savoir si chaque injection a été effectuée avec succès.
Cette approche à main levée pour faire des injections d’ICV nécessite une anesthésie. Avec de la pratique, les injections peuvent être faites rapidement, ce qui entraîne une brève exposition (3 à 5 min) à l’anesthésique. En rasant la tête de la souris et en effectuant la craniotomie (percer le crâne avec une aiguille pointue) avant le jour de l’expérience, le temps passé sous anesthésie pendant l’expérience peut être réduit. Les souris se remettent généralement complètement de cette brève exposition à l’anesthésie en quelques minutes. La collecte d’échantillons de sang de l’extrémité de la queue immédiatement après l’anesthésie peut être difficile, de sorte que l’échantillonnage peut être suspendu pendant ~ 30 minutes après l’injection pour minimiser le stress chez les souris, bien que cela ne soit pas strictement nécessaire. D’autres laboratoires ont également mesuré avec succès les changements dans la sécrétion de LH (échantillons uniques) 30 min après l’administration d’agents pharmacologiques en utilisant cette technique ICV à main levée 1,12. Des changements dans le comportement locomoteur et ingestif sur une période de 24 h ont également été détectés à la suite d’injections d’ICV13, ce qui permet d’effectuer une surveillance à long terme. Il est recommandé d’effectuer des tests préliminaires pour déterminer la facilité d’échantillonnage et les effets potentiels de l’anesthésie sur les résultats d’intérêt.
En résumé, la technique d’injection d’ICV à main levée décrite ici est une méthode simple mais puissante d’administration d’agents expérimentaux dans le cerveau. Les avantages spécifiques sont que l’approche est rapide et techniquement simple et permet un taux élevé d’injections réussies. De plus, comme cette technique ne nécessite qu’une brève exposition à l’anesthésie, elle peut être combinée avec une variété d’autres techniques telles que des prélèvements sanguins fréquents, la manipulation des circuits neuronaux ou l’enregistrement in vivo pour étudier les processus neuroendocriniens.

L’administration d’agents expérimentaux, tels que les médicaments1, les virus2 ou les cellules3, au cerveau est souvent nécessaire pour la recherche neuroendocrinienne. Si l’agent ne traverse pas facilement la barrière hémato-encéphalique ou si l’objectif expérimental est de tester spécifiquement les effets centraux de l’agent, il est important de disposer d’une méthode fiable pour administrer les injections dans le cerveau. De plus, l’injection dans l’espace intra-cérébroventriculaire (ICV) offre la possibilité de distribuer largement l’agent dans le cerveau et fournit une grande zone cible, augmentant ainsi la probabilité de réussite de l’injection2. 
Une méthode courante pour faire des injections d’ICV implique la mise en place d’une canule à demeure permanente. Dans cette approche, un cadre stéréotaxique est nécessaire pour positionner la canule disponible dans le commerce ou sur mesure, car la canule est collée ou cimentée en place. Souvent, lors de la récupération, une dose supraphysiologique d’angiotensine II est administrée à travers la canule, et si un comportement de consommation d’alcool est immédiatement observé, la canule est considérée comme correctement placée4. Cette approche présente de nombreux avantages, notamment la possibilité d’effectuer une perfusion à long terme et la possibilité d’injecter plusieurs fois le même animal ; De plus, si l’angiotensine II est utilisée, la mise en place correcte peut être confirmée avant l’administration de composés expérimentaux. Cependant, il existe certaines limites à la mise en place d’une canule permanente, notamment l’exigence d’un équipement coûteux (cadre stéréotaxique), la possibilité d’endommager la canule après la mise en place (par exemple, les souris peuvent mâcher la canule d’un compagnon de cage) et la possibilité d’infections autour de la canule permanente. Des injections uniques d’ICV peuvent être réalisées à l’aide d’un cadre stéréotaxique3, qui, bien qu’efficace, nécessite une exposition importante à l’anesthésie et, par conséquent, peut masquer certains effets physiologiques et comportementaux aigus du traitement. De plus, le placement de souris dans un cadre stéréotaxique nécessite un entraînement substantiel pour obtenir un placement stable et éviter la rupture des conduits auditifs.
Ici, une méthode établie pour faire des injections à main levée chez la souris est décrite. Cette méthode est basée sur les rapports précédents 5,6. Les avantages de cette technique sont qu’elle est simple, rapide et ne nécessite pas d’équipement spécialisé tel qu’un cadre stéréotaxique. Comme décrit ci-dessous, cette procédure consiste à manipuler une seringue en verre par rapport à des points de repère sur la tête de la souris pour effectuer les injections, ce qui peut être fait rapidement et, par conséquent, ne nécessite que quelques minutes d’anesthésie gazeuse le jour de l’expérience.

<table><tbody><tr><td>Aiguilles émoussées de calibre 18</td><td>SAI Infusion</td><td>B18-150</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles de calibre 18</td><td>BD Medical</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Tampons d’alcool</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de paillasse</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62AC22</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bétadine</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1696484</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine</td><td>Patterson Vet Supply</td><td>07-892-5235</td><td>Substance contrôlée</td></tr><tr><td>Lubrifiant</td><td>pour œil Fisher Scientific</td><td>50-218-8442</td><td></td></tr><tr><td>Seringue en verre</td><td>Hamilton</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille d’injection</td><td>Hamilton</td><td>7803-01</td><td>Calibre 27, Aiguille RN à petit moyeu, style de pointe : 4, Longueur de l’aiguille : 10cm, Angle : 45</td></tr><tr><td>Isoflurane&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Patterson Vet Supply</td><td>07-893-8441</td><td></td></tr><tr><td>Vaporisateur d’isoflurane</td><td>Vet Equip</td><td>V-10</td><td></td></tr><tr><td>Ruban de laboratoire</td><td>VWR</td><td>89098-128</td><td></td></tr><tr><td>Oxygène de qualité médicale</td><td>Airgas</td><td>OX USPEA</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Millipore-Sigma</td><td>8.18715.1000</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>J67802. K2</td><td></td></tr><tr><td>PulsaR Software</td><td>Open source, Université d’Otago</td><td></td><td>Voir ref 9</td></tr><tr><td>Ruler</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-00-152</td><td></td></tr><tr><td>Tube Silastic (0.040" I.D.)</td><td>DOW</td><td>508-005</td><td></td></tr><tr><td>Tube en silastique (0,078" D.I.)</td><td>DOW</td><td>508-009</td><td></td></tr><tr><td>Saline stérile</td><td>VWR</td><td>101320-574</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr></tbody></table>

injections intracérébrales intra-ventriculaires à main levée chez la souris

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

L’étude des systèmes neuroendocriniens nécessite souvent l’administration de médicaments, de virus ou d’autres agents expérimentaux directement dans le cerveau des souris. Une injection intracérébroventriculaire (ICV) permet l’administration généralisée de l’agent expérimental dans tout le cerveau (en particulier dans les structures proches des ventricules). Ici, les méthodes d’injections d’ICV à main levée chez les souris adultes sont décrites. En utilisant des repères visuels et tactiles sur la tête des souris, les injections dans les ventricules latéraux peuvent être effectuées rapidement et de manière fiable. Les injections sont faites à l’aide d’une seringue en verre tenue dans la main de l’expérimentateur et placée à des distances approximatives des points de repère. Ainsi, cette technique ne nécessite pas de trame stéréotaxique. De plus, cette technique ne nécessite qu’une brève anesthésie à l’isoflurane, ce qui permet d’évaluer ultérieurement le comportement et/ou la physiologie de la souris chez des souris éveillées et au comportement libre. L’injection d’ICV à main levée est un outil puissant pour l’administration efficace d’agents expérimentaux dans le cerveau de souris vivantes et peut être combinée avec d’autres techniques telles que des prélèvements sanguins fréquents, la manipulation des circuits neuronaux ou l’enregistrement in vivo pour étudier les processus neuroendocriniens.

Lorsqu’elle est exécutée avec succès, cette technique permet l’administration rapide d’un agent expérimental dans le système ventriculaire. La figure 2A montre un profil de pouls de l’hormone lutéinisante (LH) d’une souris ovariectomisée qui a reçu une injection ICV de 3 μL de solution saline isotonique stérile, le véhicule de nombreux composés pharmacologiques. Cet exemple démontre qu’une brève exposition à l’anesthésie gazeuse et l’injection de 3 μL de liquide dans le système ventriculaire n’ont pas modifié la sécrétion pulsatile de LH. À 3 h après l’injection d’ICV, l’animal a été euthanasié et du tissu neural fraîchement congelé a été prélevé et coupé sur un cryostat ; Le conduit d’injection a clairement coupé le ventricule latéral. Le tractus d’injection était également visible dans le tissu neural de souris perfusées avec un fixateur (10 mL de solution saline héparinée suivie de 20 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans un tampon phosphaté). Des exemples d’injections correctement placées sont présentés à la figure 2B. Deux exemples d’injections mal placées sont présentés à la figure 2C. Des exemples d’injections d’encre de Chine correctement (à gauche) et mal placées sont présentés à la figure 2D. L’injection d’encre de Chine est utile pour pratiquer cette technique car elle permet de visualiser clairement l’emplacement de l’injection. L’écoulement du colorant dans les ventricules latéraux et le troisième ventricule peut être observé dans des injections correctement placées (Figure 2D, à gauche).
<img alt="Configuration de la souris pour l’anesthésie à l’isoflurane avec schémas du site d’injection et assemblage de la seringue." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65324/65324fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Images illustrant la préparation de l’équipement et les coordonnées d’injection pour les injections d’ICV à main levée. (A) Configuration du poste de travail pour les injections d’ICV à main levée. (B) Schéma de pratique du mouvement nécessaire pour placer l’injection d’ICV chez des souris femelles C57/BL6 âgées de 3 à 4 mois. (C) Emplacement approximatif du bregma chez les souris adultes. (D) Mise en place de la tubulure pour révéler 3,5 mm de la pointe de l’aiguille pour l’injection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65324/65324fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Graphique des niveaux de LH au fil du temps après l’injection de solution saline ICV ; Des images de coupes de cerveau montrent des résultats expérimentaux." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65324/65324fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : Données histologiques et représentatives de l’hormone lutéinisante relatives aux injections d’ICV à main levée. (A) Profil de pouls LH avant et après l’injection d’ICV. Les points de données avec remplissage noir uni représentent les impulsions telles qu’elles sont déterminées à l’aide d’une reformulation de PULSAR10 avec les paramètres suggérés dans cette référence pour une souris OVX et un niveau de détection de 0,32 ng/mL. (B) Photographies d’une coupe coronale du cerveau d’une souris avec une injection d’ICV correctement placée. (C) Photographies d’une coupe coronale du cerveau d’une souris avec une injection d’ICV mal placée : un tractus d’injection latéral au ventricule (à gauche) et un tractus d’injection dorsal au ventricule (à droite). (D) Photographies d’une section coronale du cerveau d’une souris avec une injection ICV d’encre de Chine correctement placée (à gauche) et une injection ICV d’encre de Chine mal placée (à droite). Note : les panneaux B et C représentent des cerveaux perfusés de paraformaldéhyde prélevés 3 h après l’injection de solution saline ; Le panneau D représente des cerveaux frais prélevés sur de la glace carbonique 2 min après l’injection d’encre de Chine. Barre <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65324/65324fig02large.jpg" target="_blank">d’échelle = 1 mm Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ici, une approche simple et rapide pour effectuer des injections intra-ventriculaires chez la souris en utilisant une approche à main levée (c’est-à-dire sans dispositif stéréotaxique) est décrite.

Injections intracérébrales intra-ventriculaires à main levée chez la souris

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. ...

Nous nous intéressons au contrôle neuronal de la fonction reproductive, en particulier à la façon dont le cerveau régule la libération d’hormones qui contrôlent les gonades, à la fois dans des conditions saines et en réponse au stress. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est relativement simple et rapide. L’administration de médicaments dans le ventricule latéral est un excellent moyen de ratisser large en testant une voie de signalisation pour soutenir des expériences de suivi plus détaillées.Il y a encore beaucoup à apprendre sur le contrôle neuroendocrinien de la reproduction, y compris les mécanismes moléculaires de la génération d’impulsions hormonales lutéinisantes, les mécanismes de modulation de la fréquence des impulsions pendant le stress et la génération de la poussée de LH préovulatoire. À l’avenir, nous nous intéresserons particulièrement à l’intégration de résultats disparates dans les modèles.

free-hand-intracerebroventricular-injections-in-mice

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Le modèle d'injection de sang autologue d'hémorragie intracérébrale chez la souris décrites dans ce protocole utilise la technique de double injection pour minimiser le risque de reflux du sang jusqu'à la piste d'aiguille, pas d'anticoagulants dans le système de pompage, et élimine tous les espaces morts et tuyaux extensibles dans le système.

Injection de sang autologue au modèle spontané Hémorragie intracérébrale chez la souris

Cet article illustre deux méthodes très différentes d'injection: 1) dans le cerveau (intracérébroventriculaire) et 2) systémique (intraveineuse) d'introduire des agents thérapeutiques dans le système nerveux central de souris néonatales.

Délivrance d&#39;agents thérapeutiques à travers intracérébroventriculaire (ICV) et intraveineuse (IV) par injection chez la souris

Cette vidéo montre l’injection intra-ventriculaire médiée par l’ommaya dans un modèle murin. La méthode permet l’administration localisée de candidats médicaments potentiels et échappe à la barrière hémato-encéphalique.

Injection intra-ventriculaire chez la souris : une méthode d’administration directe de médicaments médiée par Ommaya pour administrer des médicaments aux ventricules cérébraux du cerveau de souris

Source : Li, D., et al. Injection intrathécale directe de virus adéno-associés recombinants chez des souris adultes. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre la procédure d’injection intrathécale de virus adéno-associés (AAV) dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) d’une souris éveillée, couvrant la préparation de la seringue, l’alignement de la colonne vertébrale et l’insertion précise de l’aiguille. Cette méthode valide l’administration ciblée de gènes, soutenant ainsi son potentiel pour les...

Administration intrathécale de virus dans un modèle murin pour le traitement de maladies du système nerveux central

Ici, nous démontrons une technique de transduction neuronale généralisée par injection intraventriculaire d’un virus adéno-associé dans le cerveau de souris néonatale.  Cette méthode offre un moyen rapide et facile d’obtenir l’expression à vie des transgènes délivrés par le virus.

Injection virale intracérébro du cerveau de souris nouveau-né pour la transduction neuronale persistante et généralisée

Les modèles animaux de la maladie pédiatrique peuvent éprouver précoce et la progression de la maladie agressive. Cliniquement l'administration du traitement pertinent de jeunes modèles de souris peut être techniquement difficile. Ce protocole décrit une méthode d'injection intraveineuse non-invasive pour les souris nouveau-nés dans les deux premiers jours après la naissance de la vie.

Les injections intraveineuses de souriceaux nouveau-nés

Ici, nous décrivons une méthode simple d’injection intraventriculaire et intravasculaire de particules virales ou de microbilles fluorescentes dans le cerveau de souris néonatale. Le modèle de localisation du virus et des nanoparticules a pu être détecté par évaluation microscopique ou par hybridation in situ.

Intracérébroventriculaire et intravasculaire Injection de particules virales et fluorescentes microbilles dans le cerveau néonatal

Nous décrivons ici un protocole pour le microinjection dans le cerveau de rongeur qui utilise des aiguilles quartz. Ces aiguilles ne pas produire des lésions tissulaires décelables et assurer une prestation fiable même dans les régions profondes. En outre, ils peuvent être adaptés aux besoins de la recherche par des designs personnalisés et peuvent être réutilisés.

Aiguilles personnalisées pour Microinjections dans le cerveau des rongeur

Les métabolites microbiens dérivés de l’intestin ont des effets multiformes conduisant à un comportement complexe chez les animaux. Notre objectif est de fournir une méthode étape par étape pour délimiter les effets des métabolites microbiens dérivés de l’intestin dans le cerveau via  une administration intrarébroventriculaire via une canule guide.

Livraison intrarébroventriculaire de métabolites microbiens dérivés de l’intestin chez des souris en mouvement libre

Le présent protocole décrit les instructions étape par étape pour effectuer des injections intrathécales chez les souris néonatales pour l’édition de gènes et l’administration de médicaments.

Injection intrathécale de souris nouveau-née pour l’édition du génome et l’administration de médicaments

Les ataxies spinocérébelleuses à la polyglutamine sont causées par des expansions CAG produisant des protéines sujettes à l’agrégation. Ce protocole décrit la production de vecteurs, la délivrance stéréotaxique et l’analyse des inclusions et de la perte de marqueurs neuronaux, fournissant une plateforme contrôlée pour étudier les mécanismes et évaluer les thérapies ciblées pour les maladies neurodégénératives.

Pathologie striatale induite par les lentiviraux comme modèle préclinique des ataxies spinocérébelleuses polyglutamine

Découvrez une technique rapide d'injections intracérébrales intra-ventriculaires à main levée chez la souris sans stéréotaxie. Cette méthode simple permet d'étudier le contrôle neuroendocrinien de la reproduction et la régulation hormonale sous stress.

Injections intracérébrales intra-ventriculaires à main levée chez la souris

Explorer plus de vidéos