Name: Établissement de cultures de cellules neuronales et gliales mixtes à partir de cerveaux de souris embryonnaires pour étudier l’infection et l’immunité innée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T13:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Apprenez à établir des cultures de cellules neuronales et gliales mixtes à partir de cerveaux de souris embryonnaires pour étudier l'infection virale et les réponses immunitaires innées du système nerveux central.

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Nous tenons à remercier les membres des laboratoires Edgar et Linington, en particulier le professeur Chris Linington, le Dr Diana Arseni et le Dr Katja Muecklisch, pour leurs conseils, leurs commentaires utiles et leur aide pour nourrir les cultures pendant que nous mettons en place ces cultures. Nous remercions tout particulièrement le Dr Muecklisch d’avoir fourni les points de départ des pipelines Cell Profiler. Ce travail a été soutenu par la Société de la SP (subvention 122) et la Fondation Yuri et Lorna Chernajovsky à MP; Financement de l’Université de Glasgow à JC et MP; et Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) et Medical Research Council (MRV0109721) à GJG.

Toutes les expériences sur les animaux étaient conformes aux lois et directives locales pour l’utilisation des animaux et ont été approuvées par le comité d’examen éthique local de l’Université de Glasgow. Les animaux ont été logés dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes conformément à la loi britannique de 1986 sur les procédures scientifiques sur les animaux, sous les auspices d’une licence de projet du ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni. Pour cette étude, des souris adultes C57BL/6J élevées en interne ont été utilisées. L’utilisation de jeunes femmes (8-12 semaines) est recommandée en raison du taux de réussite plus élevé de la grossesse; Les mâles peuvent être réutilisés pour plusieurs cycles de reproduction. La figure 1 représente un aperçu schématique de la méthode décrite pour générer des cultures neuronales et gliales mixtes.
1. Préparation des consommables de culture tissulaire
<ol><li>Préparer les assiettes et/ou les plats contenant des lamelles de microscopie à l’intérieur d’une enceinte de sécurité de classe 2. Stériliser tous les réactifs ou autoclaves pour assurer la stérilité pendant la période de culture.</li>
	<li>Ajouter le volume approprié de BA-PLL (13,2 μg/mL de poly-L-lysinehydrobromure [PLL] dans un tampon d’acide borique [BA] [50 mM d’acide borique, 12,5 mM de tétraborate de sodium, pH 8,5]; voir le tableau des matériaux) à chaque puits (1 000 μL/puits dans une plaque de 6 puits, 100 μL/puits dans une plaque de 96 puits; les volumes sont résumés dans le tableau 1). Pour les lames de couverture de microscopie, ajouter 20 ml de BA-PLL à une boîte de culture tissulaire de 9 cm de diamètre contenant 200 lamelles de couverture stériles et agiter pour répartir uniformément.</li>
	<li>Incuber à 37 °C pendant 1-2 h.</li>
	<li>Retirer la solution BA-PLL de chaque puits ou plat contenant des lames de couverture de microscopie et laver en ajoutant 20 ml d’eau stérile, en faisant tourbillonner les lames de couverture, puis en retirant l’eau. Répétez cette étape de lavage trois fois. Pour un plat contenant des lamelles de couverture, laissez de l’eau stérile dans la boîte de culture tissulaire lors du lavage final pour retirer facilement les lamelles de couverture.</li>
	<li>Retirer autant de liquide que possible avec une pipette stérile et laisser sécher pendant au moins 2 h à toute la nuit.</li>
	<li>Conservez les plaques revêtues à 4 °C jusqu’à 2 mois. REMARQUE: La solution préparée d’acide borique avec poly-l-lysine (BA-PLL) peut être réutilisée jusqu’à trois fois, en ajoutant une nouvelle LPL à chaque fois. Conserver la BA-PLL à 4 °C. Les plats sont traités avec BA-PLL, car la LPL permet aux cellules de coller et de se développer. Sans ce traitement, les cellules se soulèveront après environ 1 semaine de culture et ne pourront plus se différencier.</li>
</ol>2. Dissection de cerveaux embryonnaires E17
<ol><li>Cologer une ou plusieurs souris femelles avec une souris mâle. Vérifiez quotidiennement les femelles pour un bouchon de mucus, indiquant que l’accouplement a eu lieu. REMARQUE: Toute souris femelle « bouchée » doit être séparée du mâle pour assurer la date de début correcte de la gestation. Les souris peuvent être pesées pour confirmer la grossesse ou surveillées visuellement.</li>
	<li>Abattre la souris gravide à E17 en utilisant des méthodes appropriées conformément aux directives et aux lois locales en matière de bien-être animal, par exemple, en augmentant la concentration de dioxyde de carbone (CO2), une surdose anesthésique mortelle ou une luxation du cou. NOTE: La méthode choisie ne doit pas perturber les embryons. Pour cette étude, l’exposition à une concentration croissante de dioxyde de carbone gazeux suivie de la confirmation de la mort par sectionnement de l’artère fémorale a été utilisée pour éliminer les mères gravides.</li>
	<li>Placez la souris gravide abattue sur le dos sur une planche de dissection; Bien qu’il ne soit pas nécessaire de le cerner, cela pourrait faciliter la tâche des chercheurs inexpérimentés. Pincez la ligne médiane de l’abdomen à l’aide d’une pince. À l’aide de ciseaux tranchants, ouvrez l’abdomen à travers la peau et le péritoine sur la ligne médiane allant des organes génitaux à la cage thoracique, en prenant soin de ne pas percer l’utérus.<ol><li>L’utérus de souris a deux cornes, chacune contenant généralement un à cinq embryons. Retirez l’utérus contenant les embryons de la mère et placez-le immédiatement sur de la glace.</li>
	</ol></li>
	<li>Coupez le sac vitellin sur le côté des placentas, en prenant soin de ne pas endommager les embryons, et retirez les embryons de leur sac vitellin.</li>
	<li>Décapitant immédiatement les embryons. Ajouter les têtes décapitées dans un plat avec la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) sans calcium (Ca 2+) et magnésium (Mg2+) (HBSS-/-) sur glace. NOTE: Si le génotypage est nécessaire, on peut enlever la queue à ce stade pour une analyse génétique. Lorsque plusieurs génotypes sont attendus, les têtes de chaque embryon doivent être conservées séparément pour la culture.</li>
	<li>À l’aide de pinces inclinées, placez la tête sur le côté vers la gauche.</li>
	<li>Percez l’œil avec un bord de la pince, en tenant fermement le menton avec l’autre.</li>
	<li>En commençant par la nuque, déchirez doucement la peau du cuir chevelu le long de la ligne médiane vers le bout du museau.</li>
	<li>En entrant par la moelle épinière, visible comme un ovale blanc, utilisez les pinces inclinées pour ouvrir le crâne le long de la ligne médiane, exposant ainsi le cerveau.</li>
	<li>Décollez doucement le crâne sur le côté tourné vers le haut, exposant le cerveau.</li>
	<li>Soulevez le cerveau hors du crâne, en éliminant le crâne une fois que le cerveau a été complètement retiré.</li>
	<li>À l’aide de la pince, retirez les méninges, qui se distinguent par une fine membrane avec des vaisseaux sanguins denses.</li>
	<li>Placer la cervelle dans un bijou (voir le tableau des matières) contenant 2 mL de HBSS-/- sur glace.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.6 à 2.13 avec les cerveaux restants, en ajoutant jusqu’à quatre cerveaux par bijou.</li>
	<li>Ajouter 250 μL de trypsine 10x au bijou et triturer la cervelle en secouant le bijou. Incuber pendant 15 min à 37 °C. REMARQUE: Toutes les étapes à partir de ce moment doivent être effectuées dans une houlette de culture tissulaire stérile.</li>
	<li>Décongeler 2 mL d’inhibiteur de la trypsine (SD) du soja (Leibovitz L-15, 0,52 mg/mL d’inhibiteur de la trypsine du soja, 40 μg/mL de DNase I, 3 mg/mL d’albumine sérique bovine [BSA] fraction V; voir le tableau des matières) à partir de -20 °C en le plaçant à 37 °C.</li>
	<li>Ajouter 2 mL d’inhibiteur du SD à chaque bijou contenant des cerveaux (par bijou contenant jusqu’à quatre cerveaux), en secouant à nouveau le bijou pour le disperser uniformément. REMARQUE: L’inhibiteur SD diminue l’activité de la trypsine pour éviter la digestion inutile des échantillons et préserver la viabilité cellulaire.</li>
	<li>Sans centrifugation, retirer 2 mL du surnageant de chaque bijou et transférer dans un tube à centrifuger de 15 mL, en prenant soin de ne pas transférer d’amas cellulaires.</li>
	<li>Triturer les cellules restantes dans le bijou avec une aiguille de 19 G fixée à une seringue de 5 ml en aspirant la suspension deux fois. Cela créera un mélange épais semblable à du mucus.<ol><li>Répétez deux fois de plus à l’aide d’une aiguille de 21 G. S’il reste des touffes, triturez une fois de plus avec l’aiguille de 21 G.</li>
	</ol></li>
	<li>Transférer les cellules du bijou dans le même tube à centrifuger de 15 ml (à partir de l’étape 2.18) à l’aide d’une aiguille de 23 g.</li>
	<li>Centrifuger à 200 x g à température ambiante (RT) pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer tout le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL et le transférer dans un autre tube à centrifuger de 15 mL, en prenant soin de ne pas déranger la pastille lâche au fond contenant les cellules requises.</li>
	<li>Centrifuger à nouveau le surnageant à 200 x g à TA pendant 5 min. NOTE: Cette étape n’est pas essentielle, mais si l’on a besoin de nombreuses cellules ou a peu d’embryons, on pourrait effectuer cette étape pour récupérer autant de cellules que possible du surnageant.</li>
	<li>À l’aide de 10 mL de média de placage (49 % de milieu aigle modifié de Dulbecco [DMEM], 1 % de pénicilline/streptomycine [Pen/Strep], 25 % de sérum de cheval, 25 % d’HBSS avec Ca 2+ et Mg2 + [HBSS+ /+]; voir le tableau des matières), combiner et remettre en suspension les deux pastilles ensemble pour créer une suspension cellulaire entière.</li>
	<li>Compter les cellules à l’aide de bleu de trypan et d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules numériques, et diluer la suspension cellulaire avec des particules à une concentration de 1,8 x 106 cellules/mL.</li>
</ol>3. Placage des cellules
<ol><li>Ajouter le volume requis de la suspension cellulaire au format requis tel qu’indiqué dans le tableau 1 : 1 000 μL par puits en format 6 puits, 50 μL par puits en format 96 puits ou 100 μL par lamelle de couverture.</li>
	<li>Incuber pendant 2-4 h à 37 °C avec 5%-7% CO2. Vérifiez que les cellules ont adhéré à l’aide d’un microscope inversé.</li>
	<li>Retirez le média et complétez avec un nouveau milieu de différenciation (DM+ : DM- incluant 10 μg/mL d’insuline. DM- : DMEM, 1 % Pen/Strep, hydrocortisone 50 nM, 10 ng/mL de biotine, 2,5 mL de supplément de milieu 100x N1; voir le tableau des matières). Les volumes sont détaillés dans le tableau 1. Appuyez sur les lamelles de couverture flottantes à l’aide d’un embout de pipette stérile.</li>
</ol>4. Maintenir les cultures
REMARQUE: Ces cultures nécessitent une alimentation trois fois par semaine pour soutenir une croissance et une différenciation optimales. Les cultures atteindront une santé et une maturité optimales pour les expériences sur DIV (jours in vitro) 21. Les cellules peuvent être conservées en culture jusqu’à 28 jours, après quoi les cultures dégénèrent rapidement.
<ol><li>Trois fois par semaine jusqu’à DIV12, remplacer une partie du surnageant par du DM+ frais en retirant 500 μL par puits en format 6 puits, 50 μL par puits en format 96 puits, ou 500 μL par antenne contenant trois lamelles de couverture, et en ajoutant 600 μL par puits en format 6 puits, 60 μL par puits en format 96 puits, ou 600 μL par antenne parabolique (tableau 1).</li>
	<li>Trois fois par semaine à partir de DIV13, remplacer une partie du surnageant par du DM- frais en retirant 500 μL par puits dans un format à 6 puits, 50 μL par puits dans un format 96 puits, ou 500 μL par antenne contenant trois lamelles de couverture, et en ajoutant 600 μL par puits dans un format 6 puits, 60 μL par puits dans un format 96 puits, ou 600 μL par antenne parabolique (tableau 1).</li>
</ol>

Cultures de cellules mixtes de cerveau embryonnaire de souris pour étudier l’infection et l’immunité innée

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le SNC est un réseau complexe qui s’étend du cerveau à la moelle épinière et se compose de nombreux types de cellules, principalement des neurones, des oligodendrocytes, des astrocytes et des microglies1. Comme chaque cellule a un rôle important dans le maintien de l’homéostasie et la génération de réponses appropriées aux défis du SNC 9,10,11, un système de culture qui contient tous ces types de cellules est un outil utile et ...

Il est essentiel d’améliorer notre compréhension du système nerveux central (SNC) pour améliorer les options thérapeutiques pour de nombreuses maladies neuroinflammatoires et neurodégénératives. Le SNC, un réseau complexe de cellules interconnectées dans le cerveau, la moelle épinière et les nerfs optiques, comprend des neurones, des oligodendrocytes, des astrocytes et leurs cellules immunitaires innées, la microglie1. Une approche in vitro peut souvent réduire considérablement le nombre de souris nécessaires pour effectuer des recherches significatives; Cependant, la nature complexe du SNC rend impossible la récapitulation de la situation in vivo à l’aide de lignées cellulaires. Les cultures de cellules neurales mixtes constituent un outil de recherche extrêmement précieux pour étudier les questions de neuro(immuno)logie dans un modèle pertinent, conformément aux principes de remplacement, de réduction et de raffinement (3R) 2,3.
Thomson et al. ont décrit une méthode de culture cellulaire utilisant des cellules prénatales de la moelle épinière qui se différencient en tous les principaux types de cellules du SNCsusmentionnés 4. Ce système a également la formation de synapses, les axones myélinisés et les nœuds de Ranvier. La principale limitation de cette méthode de culture est que, étant la moelle épinière, elle ne modélise pas utilement le cerveau, et les rendements cellulaires du jour embryonnaire 13 (E13) de la moelle épinière se contractent. Ainsi, cela limite le nombre de conditions expérimentales qui peuvent être étudiées. Par conséquent, cette étude visait à développer un nouveau système de culture cellulaire qui récapitule les caractéristiques du cerveau avec un rendement cellulaire accru pour réduire les besoins des animaux.
En utilisant Thomson et al. comme point de départ, nous avons développé un modèle de culture cellulaire dérivé uniquement de cerveaux de souris prénatals. Ces cultures ont les mêmes populations cellulaires, l’interconnectivité et les mêmes options de traitement que les cultures de la moelle épinière, sauf qu’il y a moins de myélinisation en comparaison. Cependant, avoir un modèle in vitro du SNC avec un rendement cellulaire environ trois fois plus élevé est plus efficace, nécessitant moins de souris et moins de temps de traitement des embryons. Nous avons optimisé ce système de culture unique pour de multiples applications et échelles en aval, y compris l’utilisation de lamelles de couverture en verre pour l’analyse microscopique et de différentes tailles de plaques de puits en plastique, y compris des plaques de 96 puits pour la recherche à haut débit.

<table><tbody><tr><td>10x Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4549-100ML</td><td>Pour digérer les tissus</td></tr><tr><td>140 mm TC Dish</td><td>Fisher</td><td>11339283</td><td>Mettre 8 plats de 35 mm par 1 plat de 140 mm</td></tr><tr><td>15 mL Falcon</td><td>Sarstedt</td><td>62554502</td><td>Pour collecter les cellules en granulés pour les remettre en suspension dans un milieu de placage</td></tr><tr><td>Aiguille 18 G</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710012040</td><td>Pour la trituration de l’échantillon</td></tr><tr><td>21 G Aiguille</td><td>BD</td><td>304432</td><td>Pour la trituration de l’échantillon</td></tr><tr><td>Aiguille 23 G</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710006030</td><td>Pour la trituration de l’échantillon</td></tr><tr><td>Antenne TC de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>Plaque de sortie 3 lamelles enrobées PLL par 1 boîte de 35 mm</td></tr><tr><td>Seringue de 5 mL</td><td></td><td>Fisher 15869152</td><td>Pour la trituration de l’échantillon</td></tr><tr><td>Plaque à 6 puits</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>Pour plaque de cellules pour RT-qPCR et écoulement cytométrie</td></tr><tr><td>7 mL Bijoux</td><td>Fisher</td><td>DIS080010R</td><td>Pour mettre les cerveaux intp</td></tr><tr><td>96 bien plaque</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Pour placage cellules pour tests à haut débit</td></tr><tr><td>ACSA-2 Anticorps, anti-souris, PE</td><td>Miltenyi</td><td>130-123-284</td><td>Pour la coloration par cytométrie en flux des astrocytes</td></tr><tr><td>Pince coudée</td><td>Dumont</td><td>0108-5/45-PO</td><td>Pour la dissection</td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td>Pour l’acide DM+/-</td></tr><tr><td>Borique</td><td>Sigma</td><td>B6768-500G</td><td>Pour le tampon d’acide borique</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 Anticorps anti-souris CD24, clone M1-69</td><td>Biolegend</td><td>101825</td><td>Pour la coloration par cytométrie en flux des neurones et des astrocytes</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 Anticorps CD45 anti-souris, clone 30-F11</td><td>Biolegend</td><td>103139</td><td>Pour la coloration par cytométrie en flux de la microglie</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 785 anti-souris/humain CD11b Anticorps, clone M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101243</td><td>Pour la coloration par cytométrie en flux de la microglie</td></tr><tr><td>BSA Fraction V</td><td>Sigma</td><td>A3059-10G</td><td>Pour inhibiteur de SD</td></tr><tr><td>CNP</td><td>Abcam</td><td>AB6319</td><td>Oligodendrocytes matures</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>VWR</td><td>631-0149</td><td>Pour placage de cellules pour la microscopie</td></tr><tr><td>Dissection Ciseaux</td><td>Sigma</td><td>S3146-1EA</td><td>Pour la dissection</td></tr><tr><td>DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td>Pour DM+/-, et pour le placage</td></tr><tr><td>de milieux DNase I</td><td>Thermofisher</td><td>18047019</td><td>Pour inhibiteur de SD, peut utiliser cette ou l’autre Dnase de sigma</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D4263</td><td>Pour Inhibiteur de SD, peut utiliser cette ou l’autre Dnase de thermofisher</td></tr><tr><td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780</td><td>Thermofisher</td><td>65-0865-14</td><td>Teinture vivante / morte</td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Dumont</td><td>0102-SS135-PO</td><td>Pour dissection</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Invitrogen</td><td>13-0300</td><td>Astrocytes</td></tr><tr><td>HBSS w Ca Mg</td><td>Sigma</td><td>H9269-500ML</td><td>Pour support de placage</td></tr><tr><td>HBSS w/o Ca Mg</td><td>Sigma</td><td>H9394-500ML</td><td>Pour les cerveaux à ajouter au</td></tr><tr><td>sérum</td> <td>de chevalGibco</td><td>26050-070</td><td>Pour les milieux de placage</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td>Pour DM+/-</td></tr><tr><td>Iba1</td><td>Alpha-Laboratories</td><td>019-1971</td><td>Microglia</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I1882</td><td>Pour DM+</td></tr><tr><td>Leibovitz L-15</td><td>GIbco</td><td>11415-049</td><td>Pour Inhibiteur de SD</td></tr><tr><td>MBP</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA409S</td><td>Myéline</td></tr><tr><td>Souris CCL5/RANTES DuoSet Kit ELISA</td><td>BioTechne</td><td>DY478-05</td><td>Kit ELISA pour la quantification de la concentration de CCL5 dans les surnageants de 96 puits</td></tr><tr><td>plaque N1 média supplément</td><td>Sigma</td><td>N6530-5ML</td><td>Pour DM+/-</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Merck</td><td>MAB353</td><td>Cellules souches/progénitrices neuronales</td></tr><tr><td>NeuN</td><td>Thermofisher</td><td>PA578499</td><td>Corps cellulaire neuronal</td></tr><tr><td>NG2</td><td>Sigma</td><td>AB5320</td><td>Oligodendrocytes immatures</td></tr><tr><td>O4 Anticorps anti-humain/souris/rat, APC</td><td>Miltenyi</td><td>130-119-155</td><td>Pour la coloration par cytométrie en flux des oligodendrocytes</td></tr><tr><td>Pen/</td><td>Strep Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td>Pour DM+/-, et pour les milieux de placage</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysinehydrobromure</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>Pour l’acide borique / solution de poly-L-lysine pour enrober les lamelles</td></tr><tr><td>SMI31</td><td>BioLegend</td><td>801601</td><td>Axons</td></tr><tr><td>Tétraborate de sodium</td><td>Sigma</td><td>221732-100G</td><td>Pour tampon d’acide borique</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermofisher</td><td>15596026</td><td>Pour lyser les cellules pour RT-qPCR</td></tr><tr><td>Inhibiteur de trypsine du soja</td><td>Sigma</td><td>T9003-100MG</td><td>Pour inhibiteur de SD</td></tr></tbody></table>

Établissement de cultures de cellules neuronales et gliales mixtes à partir de cerveaux de souris embryonnaires pour étudier l’infection et l’immunité innée

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

Les modèles du système nerveux central (SNC) doivent récapituler le réseau complexe de cellules interconnectées trouvé in vivo. Le SNC se compose principalement de neurones, d’astrocytes, d’oligodendrocytes et de microglies. En raison des efforts croissants pour remplacer et réduire l’utilisation animale, une variété de systèmes de culture cellulaire in vitro ont été développés pour explorer les propriétés cellulaires innées, ce qui permet le développement de thérapies pour les infections et les pathologies du SNC. Alors que certaines questions de recherche peuvent être abordées par des systèmes de culture cellulaire basés sur l’homme, tels que les cellules souches pluripotentes (induites), travailler avec des cellules humaines a ses propres limites en ce qui concerne la disponibilité, les coûts et l’éthique. Ici, nous décrivons un protocole unique pour isoler et cultiver des cellules à partir de cerveaux de souris embryonnaires. Les cultures de cellules neurales mixtes qui en résultent imitent plusieurs populations cellulaires et interactions trouvées dans le cerveau in vivo. Par rapport aux méthodes équivalentes actuelles, ce protocole imite plus étroitement les caractéristiques du cerveau et recueille également plus de cellules, permettant ainsi d’étudier plus de conditions expérimentales à partir d’une souris gravide. De plus, le protocole est relativement facile et hautement reproductible. Ces cultures ont été optimisées pour une utilisation à différentes échelles, y compris des cribles à haut débit à 96 puits, des analyses de microscopie à 24 puits et des cultures à 6 puits pour la cytométrie en flux et l’analyse de la réaction en chaîne de la polymérase quantitative à transcription inverse (RT-qPCR). Cette méthode de culture est un outil puissant pour étudier l’infection et l’immunité dans le contexte d’une partie de la complexité du SNC avec la commodité des méthodes in vitro .

Microscopie Les cultures cultivées sur des lamelles de verre sont idéales pour être analysées par microscopie. Pour visualiser le développement des cultures, les lamelles de couverture ont été fixées dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4% à plusieurs points temporels de DIV0 (une fois les cellules attachées) à DIV28. Les cultures ont été colorées pour l’imagerie par immunofluorescence comme décrit précédemment5 en utilisant trois combinaisons de coloration différentes: NG2 (oligod...

Ce protocole présente une façon unique de générer des cultures cellulaires du système nerveux central à partir de cerveaux de souris embryonnaires du jour 17 pour la recherche en neuro(immuno)logie. Ce modèle peut être analysé à l’aide de diverses techniques expérimentales, notamment la RT-qPCR, la microscopie, l’ELISA et la cytométrie en flux.

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

La question de recherche ultime de mon projet est de comprendre comment nous pouvons manipuler les réponses immunitaires innées du système nerveux central pour protéger contre les infections virales. Actuellement, nous étudions leur réponse à la protéine profondément antivirale interféron bêta. Un défi expérimental consiste à générer suffisamment de cellules pour permettre une étude détaillée.Chaque résultat doit être validé à l’aide de plusieurs techniques, ce qui peut malheureusement entraîner l’abattage de nombreux animaux. En raison du grand nombre de cellules générées par cette nouvelle technique de culture, de nombreuses conditions expérimentales différentes peuvent être étudiées à partir d’une souris gravide. De plus, l’utilisation d’alternatives in vitro, dans la mesure du possible, diminue également considérablement la souffrance animale.Cette méthode réduit et affine l’utilisation des animaux, en suivant de près les principes des trois R.Cette méthode de culture peut être utilisée pour répondre à de nombreuses questions de recherche différentes en utilisant une variété de méthodes de lecture telles que ELISA, qPCR, microscopie et cytométrie en flux. Cette technique pourrait aider d’autres chercheurs à réduire et à affiner leur utilisation des animaux. Nous espérons améliorer notre compréhension de la réponse antivirale innée, en la modulant pour protéger contre les virus opportunistes tels que le polyomavirus humain 2, ou le virus John Cunningham, comme on l’appelle communément, l’agent principal de la LEMP qui peut être un effet secondaire grave des médicaments immunosuppresseurs utilisés pour traiter la SEP et d’autres maladies.

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JoVE Journal

Neuroscience

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Cet article décrit les méthodes pour estimer la population enrichie des cellules précurseurs des oligodendrocytes murins (OPC) en culture primaire, qui se différencier pour produire des oligodendrocytes matures (MCO). En outre, ce rapport décrit des techniques pour produire murin myélinisantes co-cultures par semis OPC de la souris sur un lit de neurites de souris dorsale neurones ganglion de la racine (DRGNs).

Dérivation des cultures enrichies en oligodendrocytes et Oligodendrocyte / Neuron myélinisantes co-cultures de post-natal tissus murins

Nous fournissons un protocole pour la culture de neurones de l'hippocampe hautement purifiée à partir de cerveaux de souris prénatales sans l'utilisation d'une couche de cellules nourricières gliales.

L&#39;isolement et la culture de neurones de l&#39;hippocampe de souris pendant la grossesse

La vidéo a démontré la méthode d’isolement et de culture de cellules à partir du cerveau d’une souris néonatale. Il impliquait une dissociation enzymatique et mécanique du cerveau, suivie d’une culture dans un milieu de croissance dépourvu de facteur de croissance neuronale pour obtenir une population gliale mixte.

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Cette vidéo présente une technique d’isolement et de culture de cellules gliales primaires mixtes à partir de tissus de moelle épinière de souris adultes. Le protocole implique une digestion enzymatique du tissu, suivie de l’élimination des membranes cellulaires brisées et des débris de myéline pour obtenir une population unicellulaire. Les cellules sont ensuite cultivées dans un milieu optimisé pour la croissance de cellules gliales mixtes.

Etablissement de cultures primaires de cellules gliales mixtes à partir d’une moelle épinière de souris

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Une<em&gt; In-vitro</em&gt; Préparation des neurones entériques isolés et cellules gliales du Plexus myentérique de la souris adulte

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la production simultanée de cultures de cellules de précurseur de neurones, soit comme des monocouches ou des neurosphères adhérentes, à partir de la zone sous-ventriculaire et le gyrus denté de souris individuels adultes.

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Le développement de la douleur neuropathique implique des changements pathologiques des cellules gliales cordon de la colonne vertébrale. Un système de culture gliale fiable provenant d' un tissu de la moelle épinière adulte et conçu pour l' étude de ces cellules in vitro est absente. Par conséquent, nous montrons ici comment établir cultures primaires gliales mixtes de souris adultes tissu de la moelle épinière.

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Mener des expériences in vitro pour refléter les conditions in vivo aussi adéquatement que possible n'est pas une tâche facile. L'utilisation des cultures cellulaires primaires est une étape importante vers la compréhension de la biologie cellulaire dans un organisme entier. Le protocole fourni décrit comment se développer avec succès et cultiver les neurones cérévelaires embryonnaires de souris.

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Ce protocole décrit une co-culture microgliale-neuronale établie à partir de cellules neuronales primaires isolées d’embryons de souris aux jours embryonnaires 15-16 et de microglie primaire générée à partir du cerveau de souris néonatales aux jours postnatals 1er-2.

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