Name: Enrichissement de la bibliothèque d’ARNm et de bisulfite-ARNm pour le séquençage de nouvelle génération (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Découvrez le séquençage bisulfite-ARN pour étudier la méthylation 5-méthylcytosine dans le cancer du pancréas. Cette méthode identifie les ARN différentiellement méthylés impliqués dans la progression tumorale et la différenciation cellulaire.

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Création de banques d’ARNm de bisulfite robustes pour la cartographie à l’échelle du transcriptome

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<li>Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+methylation+in+plants%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">RNA methylation in plants: An overview.</a> Frontiers in Plant Science. 14, 1132959(2023).</li>
<li>Courtney, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitranscriptomic+addition+of+m5C+to+HIV-1+transcripts+regulates+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression.</a> Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).</li>
<li>Jonkhout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+modification+landscape+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The RNA modification landscape in human disease.</a> RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).</li>
<li>Legrand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistically+robust+methylation+calling+for+whole-transcriptome+bisulfite+sequencing+reveals+distinct+methylation+patterns+for+mouse+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs.</a> Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).</li>
<li>Schaefer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+5-methylcytosine+analysis+by+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing.</a> Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).</li>
<li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly%28A%29+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1(2017).</li>
<li>Schumann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+links+between+5-methylcytosine+content+of+mRNA+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation.</a> BMC Biology. 18 (1), 40(2020).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Methylcytosine+promotes+mRNA+export+-+NSUN2+as+the+methyltransferase+and+ALYREF+as+an+m5C+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">5-Methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader.</a> Cell Research. 27, 606(2017).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Methylcytosine+promotes+pathogenesis+of+bladder+cancer+through+stabilizing+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+activity-associated+alteration+of+mRNA+m%285%29+C+methylation+in+CD4%28%2B%29+T+cells+of+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430(2020).</li>
<li>Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+roles+of+RNA+m5C+modification+and+its+implications+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy.</a> Biomarker Research. 10 (1), 15(2022).</li>
<li>Xue, C., Zhao, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+RNA+cytosine-5+methylation%3A+detection%2C+regulatory+mechanisms%2C+biological+functions+and+links+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer.</a> Biomarker Research. 8 (1), 43(2020).</li>
<li>Helm, M., Motorin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+RNA+modifications+in+the+epitranscriptome%3A+predict+and+validate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+mRNA+5-methylcytosine+modifications%3A+Detection%2C+effectors%2C+biological+functions%2C+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).</li>
<li>Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+RNA+Immunoprecipitation+Assay+to+Study+m5C+Modification+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231(2020).</li>
<li>Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+protocols+for+the+illumina+genome+analyzer+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system.</a> Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 18, Unit 18.12 (2009).</li>
<li>Chen, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+bisulfite+sequencing+reveals+NSUN2-mediated+suppression+of+epithelial+differentiation+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer.</a> Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).</li>
<li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+non-coding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+5-hydroxylmethylcytosine+and+RNA+5-methycytosine+reprogramming+during+early+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%2C+Proteomics+%26+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development.</a> Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).</li>
<li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNAs+as+targets+for+cytosine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+biology%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation.</a> RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+NSUN2+deficiency+on+the+mRNA+5-methylcytosine+modification+and+gene+expression+profile+in+HEK293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenomics%22%5BJournal%5D)">Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells.</a> Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).</li>
<li>Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+mRNA+5-methylcytosine+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).</li>
<li>Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((meRanTK%3A+methylated+RNA+analysis+ToolKit%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit.</a> Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).</li>
<li>Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+oligo-based+depletion+of+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12281(2019).</li>
<li>Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+of+5-methylcytidine+RNA+modifications+in+bacteria%2C+archaea%2C+and+yeast+reveals+m%285%29C+within+archaeal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs.</a> PLoS Genetics. 9 (5), e1003602(2013).</li>
<li>Furlan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+RNA+modification+detection+from+nanopore+direct+RNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data.</a> RNA Biology. 18, 31-40 (2021).</li>
<li>Leger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+modifications+detection+by+comparative+Nanopore+direct+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing.</a> Nature Communications. 12 (1), 7198(2021).</li>
<li>Mateos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+m6A+and+m5C+RNA+modifications+at+single-molecule+resolution+from+Nanopore+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+parameters+in+RNA+bisulfite+sequencing+data+generation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22NAR+Genomics+and+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis.</a> NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045(2022).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+calibration+of+epitranscriptomic+maps+using+a+synthetic+modification-free+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library.</a> Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).</li>
<li>Chao, H. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Dans ce protocole, un pipeline détaillé d’enrichissement en poly(A), de conversion de bisulfite et de préparation de la bibliothèque a été réalisé en utilisant des composants standardisés. D’autres analyses de séquençage ont permis d’identifier l’ARNm 5-méthylcytosine dans des échantillons d’intérêt.
L’étape critique est la qualité du matériau de départ - l’ARN total - car la dégradation de l’ARN aurait un impact sur le taux de récupération de la purification de l’ARN poly(A). L’échantillon do...

Parmi plus de 150 types de modifications post-transcriptionnelles1, la modification de la 5-méthylcytosine (m5C) a été identifiée dans divers types d’ARN, y compris l’ARN ribosomique, l’ARN de transfert, l’ARN messager, le micro-ARN, l’ARN long non codant, l’ARN voûté, l’ARN enhancer et les ARN spécifiques du corps du petit cajal2. L’ARN m 5 C est associé à divers mécanismes biologiques et pathologiques tels que la régulation du développement racinaire des plantes 3, l’expressiondes gènes viraux4 et la progression du cancer5. L’objectif de ce protocole est de fournir des pipelines rationalisés pour caractériser le profil de modification de l’ARNm m5C à l’échelle du transcriptome d’échantillons biologiques à différents stades de développement ou dans le contexte de la maladie. Le séquençage au bisulfite à l’échelle du transcriptome a été développé pour caractériser les positions et les niveaux quantitatifs de méthylation de la cytosine dans l’ARN converti au bisulfite à la résolution de la paire de bases 6,7,8,9. Ceci est particulièrement utile lors de l’étude de l’association de m5C avec l’expression des gènes et le destin de l’ARN qui est impliqué dans les mécanismes de régulation biologique dans les cellules. Dans la cellule de mammifère, il existe deux lecteurs connus de m 5 C : ALYREF peut reconnaître m 5 C au niveau du noyau et sert de transporteur noyau d’ARNm vers cytosol10, tandis que YBX1 peut reconnaître m5C dans le cytoplasme et augmenter la stabilisation de l’ARNm11. Des ARNm m5C aberrants liés aux voies immunitaires ont été rapportés dans les lymphocytes T CD4+ du lupus érythémateux disséminé12. Des études ont révélé une association entre la modification de l’ARNm m5C et la modulation de l’immunité cancéreuse et la progression du cancer13,14. Par conséquent, la cartographie du profil de modification m5C sur l’ARNm peut fournir des informations cruciales pour élucider la machinerie réglementaire potentielle.
Pour étudier les rôles fonctionnels de lamodification de l’ARN m 5 C dans certaines conditions biologiques, les approches basées sur la conversion au bisulfite (bsRNA-seq) et l’enrichissement par affinité des anticorps telles que m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq et 5-Aza-seq peuvent être combinées avec la plate-forme de séquençage à haut débit pour fournir une détection efficace des régions et des séquences ciblées avec les modifications m5C à l’échelle du transcriptome15, Débloquer le niveau 16. L’avantage de ce protocole est d’obtenir le paysage complet de l’ARN m 5 C à une résolution à base unique, car l’approche basée sur l’enrichissement par affinité des anticorps repose sur la disponibilité d’anticorps de hautequalité et pourrait atteindre la résolution d’un seul fragment du paysage de méthylation m5C17.
Tous les échantillons d’ARN seront traités avec deux cycles d’enrichissement de l’ARNm à l’aide de billes d’oligo(dT), trois cycles de réaction au bisulfite et la préparation de la banque de séquençage. Pour surveiller la qualité de l’ARN, chaque échantillon d’ARN sera examiné par électrophorèse sur gel capillaire avant et après les procédures de purification de l’ARNm et de réaction au bisulfite afin d’évaluer la distribution des fragments. Les banques purifiées seront examinées en fonction de leurs qualités d’amplicon par PCR, de la distribution granulométrique des fragments d’ADN par électrophorèse sur gel capillaire et de leurs quantités globales examinées par des tests quantitatifs basés sur des colorants de fluorescence avant séquençage. Le système peut également être utilisé pour analyser un large éventail d’échantillons biologiques tels que des produits agricoles, des virions isolés, des lignées cellulaires, des organismes modèles et des échantillons pathologiques.

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 Système de bioanalyseur d’électrophorèse</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td></td><td>Détection de la qualité de l’ARN</td></tr><tr><td>AMpure XP billes</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>purifier l’ADN</td></tr><tr><td>Bioanalyseur d’ADN kit haute sensibilité</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td>5067-4626</td><td>Détection de la qualité de l’ADN</td></tr><tr><td>Bioanalyseur ARN 6000 Kit Pico</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td>5067-1513</td><td>ARN détection de la qualité</td></tr><tr><td>DiaMag02 - rack magnétique</td><td>Diagenode, Denville, NJ</td><td>B04000001</td><td>aider à la préparation de la bibliothèque</td></tr><tr><td>DiaMag1.5 - rack magnétique</td><td>Diagenode, Denville, NJ</td><td>B04000003</td><td>assist poly(A) RNA purificaion</td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA DIRECT kit de purification</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>61011</td><td>poly(A) RNA purificaion ; Tampon de lavage 1 et tampon de lavage 2</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>J.T.Baker</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit de méthylation de l’ARN EZ</td><td>Zymo, Irvine, CA</td><td>R5002</td><td>traitement au bisulfite</td></tr><tr><td>Luciférase Firefly ARNm</td><td>Promega, Madison, WI, États-Unis</td><td>L4561</td><td>pic de contrôle seqeunce&amp;nbsp ;</td></tr><tr><td>KAPA Library Quantification Kits</td><td>Roche, Switzerland</td><td>KK4824</td><td>Quantification de la bibliothèque</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td>Détection de la quantité totale d’ARN</td></tr><tr><td>NEBNext multiplex Oligos pour illumina (index Primer set1)</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>E7335S</td><td>préparation de la bibliothèque</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra <img alt="Équation 1 » src=" style="margin : auto ; "> Kit de préparation de banque d’ARN directionnel pour Illumina</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>E7760S</td><td>Préparation</td></tr><tr><td>de bibliothèque sans nucléase Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>P2 pipetman</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>4641010</td><td></td></tr><tr><td>fluorimètre Qubit 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td>Détection de la quantité d’ARN</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de dosage</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Q32854</td><td>Détection de la quantité d’ADN</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Kit de dosage</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Q32852</td><td>Détection de la quantité d’ARN</td></tr></tbody></table>

enrichissement de la bibliothèque d’arnm et de bisulfite-arnm pour le séquençage de nouvelle génération

Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing

Les modifications post-transcriptionnelles de l’ARN dans divers types de transcrits d’ARN sont associées à une régulation diversifiée de l’ARN dans les cellules eucaryotes. Il a été démontré que les modifications aberrantes de l’ARN 5-méthylcytosine et l’expression dérégulée des ARN méthyltransférases sont associées à diverses maladies, y compris les cancers. Le séquençage au bisulfite à l’échelle du transcriptome a été développé pour caractériser les positions et les niveaux quantitatifs de méthylation de la cytosine dans l’ARN converti au bisulfite à la résolution de la paire de bases. Dans ce document, ce protocole présente en détail les procédures de deux cycles de purification de l’ARN poly(A), de trois cycles de réaction au bisulfite et de la préparation de la bibliothèque pour permettre la cartographie à l’échelle du transcriptome des sites de modification de l’ARNm 5-méthylcytosine. L’évaluation de la quantité et de la qualité de l’ARN après la réaction principale est essentielle pour surveiller l’intégrité de l’ARN et constitue une étape critique pour garantir des banques de séquençage de haute qualité. Idéalement, les procédures peuvent être terminées en trois jours. Avec ce protocole, l’utilisation d’ARN total de haute qualité comme entrée peut pratiquement constituer des banques robustes d’ARNm bisulfite pour le séquençage de nouvelle génération à partir de l’échantillon d’intérêt.

Une série de banques de séquençage de l’ARNb à partir de lignéescellulaires 19 a été générée en suivant les procédures décrites dans ce rapport (Figure 1). Après une purification totale de l’ARN accompagnée d’un traitement à la DNase effectué sur des échantillons de lignées cellulaires et la vérification de la qualité par électrophorèse sur gel et spectrophotométrie UV-Vis (A260/A280), l’échantillon d’ARN peut procéder à l’enrichissement en ARN poly(A...

Ce protocole fournit un flux de travail facile à suivre pour effectuer la purification de l’ARN poly(A), la conversion du bisulfite et la préparation de la bibliothèque à l’aide d’un équipement normalisé pour un échantillon biologique d’intérêt.

Enrichissement de la bibliothèque d’ARNm et de bisulfite-ARNm pour le séquençage de nouvelle génération

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA ...

Cette recherche vise à étudier le rôle de la méthylation de l’ARN, en particulier de la modification de la 5-méthylcytosine, dans le cancer du pancréas. Les questions auxquelles nous voulons répondre sont de savoir comment la régulation à la hausse ou à la baisse de certaines ARN méthyltransférases affecte les phénotypes des cellules cancéreuses et aussi, à travers quels substrats d’ARN. Cette étude fournit le paysage complet de l’ARN m5C à une résolution de base unique avec un équipement standardisé.À partir de cette étude utilisant le séquençage de l’ARN au bisulfite, les résultats relient l’association de la modification de l’ARN m5C à une mauvaise différenciation des cellules cancéreuses. Cela devrait ouvrir la voie à de futures études visant à discerner les effets des passagers par rapport aux effets des conducteurs de maladies de m5C spécifique dans les transcrits d’ARN. Avec cette technique, nous pouvons identifier l’ensemble des ARN différentiellement méthylés qui peuvent participer à la progression tumorale.De plus, les expériences sur une seule molécule peuvent fournir un rôle régulateur plus détaillé de l’ARN m5C spécifique.

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Nous décrivons ici une méthode pour la préparation des deux simples de lecture et jumelé fin Illumina ARNm-Seq bibliothèques de séquençage de l'analyse d'expression génique basée sur l'ARN T7 linéaires d'amplification. Ce protocole ne nécessite que 10 nanogrammes d'ARN total de départ et génère des bibliothèques très cohérente représentant transcriptions ensemble.

Simple Lire et jumelés bibliothèques Fin Illumina ARNm-Seq de 10 nanogrammes d&#39;ARN total

Un flux de travail simplifié pour étudier méthylation de l'ADN et des modifications d'expression des gènes lors de début de la vie de stress est montré. A partir de la séparation maternelle des souriceaux nouveau-nés et l'isolement des tissus cérébraux distincts, nous représentons un protocole à la fois isoler l'ADN et l'ARN à partir de poinçons de tissus cérébraux pour le séquençage du bisulfite de suite et analyse RT-PCR.

Analyse de la méthylation de l&#39;ADN Optimisé et d&#39;expression de gènes à partir de petites zones définies anatomique du cerveau

Les microARN (miARN) sont une classe de molécules régulatrices largement conservée. Nous décrivons ici une méthode de clonage de miARN qui repose sur deux étapes de ligature puissantes suivies d’un séquençage à haut débit. Notre méthode permet une quantification précise des miARN à l’échelle du génome.

La ligature très efficace de petites molécules d&#39;ARN pour microARN quantification par séquençage à haut débit

Le séquençage au bisulfite amélioré est une méthode de préparation de banques de séquençage pour l’analyse de la méthylation de l’ADN basée sur la digestion enzymatique de restriction combinée à la conversion de la cytosine au bisulfite. Ce protocole nécessite 50 ng de matériel de départ et fournit des données de résolution de paires de bases dans des régions génomiques riches en GC.

Enhanced réduit Représentation bisulfite séquençage pour l&#39;évaluation de méthylation de l&#39;ADN à la résolution de paires de base

Le séquençage d’amplicon au bisulfite (BSAS) est une méthode de quantification de la méthylation de la cytosine dans les régions génomiques ciblées d’intérêt. Cette méthode utilise la conversion au bisulfite associée à l’amplification par PCR des régions cibles avant le séquençage de nouvelle génération pour produire une quantification absolue de la méthylation de l’ADN à un niveau spécifique à la base.

Ciblé méthylation de l&#39;ADN Analyse par séquençage de nouvelle génération

Ce protocole décrit une méthode de cartographie pré-ARNm ' extrémité 3 sites de traitement.

Extrémité 3' séquençage bibliothèque préparation avec A-seq2

Nous décrivons ici le protocole et la mise en œuvre du méthyl-Seq, une plate-forme épigénomique, utilisant un modèle de rat pour identifier les changements épigénétiques liés à l’exposition de stress chronique. Les résultats démontrent que la plate-forme de méthyl-Seq de rat est capable de détecter des différences de méthylation que résultent d’une exposition de stress chez les rats.

Une plate-forme de méthyl-Seq de Rat pour identifier les changements épigénétiques liés à l’exposition de Stress

Nous présentons un protocole détaillé de réparation de petite bibliothèque d'ARN avec moins de biais que les méthodes standard et une sensibilité accrue pour les ARN 2'-O-méthyle. Ce protocole peut être suivi à l'aide de réactifs faits maison pour économiser des coûts ou en utilisant des kits pour plus de commodité.

Améliorer l'ARN-seq : moins de biais et une meilleure détection des ARN 2'-O-Methyl

Nous décrivons ici les étapes de la collecte d’échantillons et de la préparation pour RIBO-seq chez les bactéries. Le séquençage des bibliothèques préparées conformément à ces lignes directrices donne suffisamment de données pour une analyse bioinformatique complète. Le protocole que nous présentons est simple, utilise un équipement de laboratoire standard et prend sept jours de la lyse à l’obtention des bibliothèques.

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Nous présentons ici un protocole pour la sélection in vitro de répresseurs transcriptionnels modifiés (ETR) avec une efficacité de silençage élevée, à long terme, stable et sur cible et une faible activité hors cible à l’échelle du génome. Ce flux de travail permet de réduire un répertoire initial et complexe de RTE candidats à une liste restreinte, adaptée à une évaluation plus approfondie dans des contextes thérapeutiquement pertinents.

In vitro Sélection de répresseurs transcriptionnels modifiés pour le silençage épigénétique ciblé

Découvrez le séquençage bisulfite-ARN pour étudier la méthylation 5-méthylcytosine dans le cancer du pancréas. Cette méthode identifie les ARN différentiellement méthylés impliqués dans la progression tumorale et la différenciation cellulaire.

Enrichissement de la bibliothèque d’ARNm et de bisulfite-ARNm pour le séquençage de nouvelle génération

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