Name: Génération de podocytes dérivés de patients à partir de biopsies cutanées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Découvrez la reprogrammation épisomale de fibroblastes dermiques en cellules souches pluripotentes induites pour générer des podocytes spécifiques au patient. Cette méthode permet d'étudier les maladies rénales de manière personnalisée.

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Ce travail a été financé par le Centre interdisciplinaire de recherche clinique (IZKF) de l’Université Friedrich-Alexander d’Erlangen-Nürnberg avec le numéro de subvention M4-IZKF-F009 attribué à Janina Müller-Deile, et par le Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) sous le nom de projet STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, numéro de subvention 01GM2202D attribué à Janina Müller-Deile. Nous remercions Annalena Kraus pour son soutien dans la prise d’images SEM.

Utilisation de biopsies cutanées pour générer des podocytes dérivés de patients

<ol><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li>
<li>Grgic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+podocyte+foot+processes+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).</li>
<li>Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+podocyte+slit+diaphragm-from+a+thin+grey+line+to+a+complex+signalling+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub.</a> Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).</li>
<li>Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+glomerular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of glomerular permeability.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).</li>
<li>Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+complexity+of+the+podocyte+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).</li>
<li>Muller-Deile, J., Schiffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+directed+therapy+of+nephrotic+syndrome-can+we+bring+the+inside+out%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out.</a> Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).</li>
<li>Boehlke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hantavirus+infection+with+severe+proteinuria+and+podocyte+foot-process+effacement%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Kidney+Diseases%22%5BJournal%5D)">Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement.</a> American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).</li>
<li>Schiffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+actin-dependent+dynamin+oligomerization+ameliorates+chronic+kidney+disease+in+diverse+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models.</a> Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).</li>
<li>Kopp, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Podocytopathies.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68(2020).</li>
<li>Wiggins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+podocytopathies%3A+a+unifying+view+of+glomerular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases.</a> Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).</li>
<li>Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+differentiation+in+cultured+rat+and+human+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).</li>
<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li>
<li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+line+demonstrating+nephrin+and+podocin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).</li>
<li>Eto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+protection+by+darbepoetin%3A+preservation+of+the+cytoskeleton+and+nephrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression.</a> Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).</li>
<li>Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+methods+of+glomerular+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+%26+Blood+Pressure+Research%22%5BJournal%5D)">Culture methods of glomerular podocytes.</a> Kidney & Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).</li>
<li>Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+expression%2C+behaviors%2C+and+responses+vary+in+different+lines+of+conditionally+immortalized+cultured+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).</li>
<li>Shih, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD2AP+localizes+to+the+slit+diaphragm+and+binds+to+nephrin+via+a+novel+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain.</a> The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).</li>
<li>Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+is+critical+for+the+plasma+membrane+localization+of+nephrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).</li>
<li>Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipping+your+feet+in+the+water%3A+podocytes+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Dipping your feet in the water: podocytes in urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).</li>
<li>Camici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+detection+of+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Urinary detection of podocyte injury.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).</li>
<li>Muller-Deile, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+preeclampsia+induced+microRNA-26a-5p+leads+to+proteinuria+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3621(2018).</li>
<li>Schenk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+focal+segmental+glomerulosclerosis+%28FSGS%29+factor+suPAR+using+CytoSorb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Apheresis%22%5BJournal%5D)">Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb.</a> Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).</li>
<li>Petermann, A., Floege, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+damage+resulting+in+podocyturia%3A+a+potential+diagnostic+marker+to+assess+glomerular+disease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron.+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity.</a> Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).</li>
<li>Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+excretion+of+viable+podocytes+in+health+and+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).</li>
<li>Petermann, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes+that+detach+in+experimental+membranous+nephropathy+are+viable%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable.</a> Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).</li>
<li>Sakairi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+lines+established+from+urine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).</li>
<li>Rauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+iPSCs+into+functional+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human iPSCs into functional podocytes.</a> PLoS One. 13 (9), e0203869(2018).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+human+somatic+reprogramming+to+iPS+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell.</a> Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).</li>
<li>Bang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+episomal+reprogramming+for+generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts.</a> Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).</li>
<li>Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+differentiation+of+mature+kidney+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+under+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e3779(2013).</li>
<li>Hoffding, M. K., Hyttel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+visualization+of+the+Mesenchymal-to-Epithelial+Transition+during+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>Bharathan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+markers+used+for+the+identification+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells.</a> Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+from+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+more+than+a+proliferation+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li>
<li>Vaz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+after+induced+pluripotent+stem+cells+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming.</a> Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147(2021).</li>
<li>Reiser, J., Altintas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Podocytes.</a> F1000Research. 5, 114(2016).</li>
<li>Ohmori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+NEPHRIN+localization+in+kidney+organoids+derived+from+nephrotic+patient+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 3982(2021).</li>
<li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole basé sur la culture cellulaire combine la reprogrammation épisomique des fibroblastes dermiques humains en hiPSCs spécifiques au patient et la différenciation ultérieure en podrocytes dérivés des CSPhi. Cela nous permet d’étudier les altérations liées à la mutation des podocytes chez des patients atteints d’une maladie glomérulaire génétique concernant les lésions podocytaires. Le protocole de reprogrammation des fibroblastes dermiques avec une méthode sans intégration par électroporation est adapté des travaux publiés de Bang et al.32 et Okita et al.33. Le protocole de différenciation des podocytes des CSPhi est adapté du protocole publié de Musah et al.28,34,35. Il existe déjà des publications décrivant la génération de podocytes à partir de hiPSCs 27,34,35. Cependant, le protocole fourni ici est optimisé et moins coûteux en ce qui concerne la différenciation des CSPh en podocytes. Par rapport au protocole publié par Musah et al., nous avons testé ce protocole sur différents réactifs de revêtement, comme la vitronectine, la laminine soie-511 et la matrice membranaire basale solubilisée. Les concentrations de vitronectine et de laminine soie-511 pourraient être réduites à 2,5 μg/mL au lieu de 5 μg/mL 28,34,35. De plus, il a été possible de diminuer de 50 % les concentrations de BMP7 et d’activine A, deux facteurs de croissance très coûteux, de 100 ng/mL à 50 ng/mL.
Cela permet une différenciation moins coûteuse. Les cellules progénitrices de néphron du jour 7 proliféraient encore, et la possibilité de congélation avait déjà été démontrée. Nous avons étendu ces cellules après décongélation et avant différenciation finale dans un milieu de base contenant le milieu Eagle modifié (DMEM) et B27 de Dulbecco pendant plusieurs jours, réduisant encore les coûts. En plus des étapes de différenciation, ce protocole décrit la croissance des fibroblastes à partir de biopsies cutanées avec la génération ultérieure de CSPh spécifiques au patient via la reprogrammation épisomique. La combinaison de ces deux méthodes permet la génération de podocytes spécifiques au patient. Par conséquent, un protocole complet étape par étape pour générer des podocytes dérivés de l’hiPSC spécifiques au patient est fourni ici qui n’a pas été décrit auparavant de manière aussi détaillée.
Comme le protocole global comprend plusieurs types de cellules différents, il est crucial de caractériser les types de cellules générées à différentes étapes. Les cellules sont en culture pendant une période prolongée, de sorte que le contrôle de la qualité doit être effectué à différents passages. Lorsque vous travaillez avec des CSPh, une alimentation quotidienne ainsi qu’une surveillance du comportement cellulaire et de la morphologie sont nécessaires. La stérilité du milieu de différenciation doit être assurée par stérilisation du filtre à travers un filtre de 0,2 μm. L’ensemble du protocole, de la biopsie cutanée aux podrocytes dérivés de l’hiPSC, prend plusieurs mois, mais il est possible de congeler les cellules à différentes étapes du processus. Les fibroblastes, les clones de hiPSC sélectionnés et les cellules progénitrices prolifératives du néphron après 7 jours dans le milieu de différenciation des progéniteurs du néphron peuvent être congelés et une banque de cellules fonctionnelles peut être générée.
Même si les podrocytes sains dérivés de l’hiPSC développent un réseau distinct de processus primaires et secondaires du pied (Figure 5A, B) et expriment un marqueur typique spécifique du podocyte (Figure 6A-C), les diaphragmes à fente caractéristiques, comme on le voit in vivo, sont difficiles à imiter dans les modèles classiques de culture cellulaire bidimensionnelle. De plus, la communication intercellulaire avec d’autres types de cellules glomérulaires n’est pas possible dans ce cadre de monoculture.
En raison de leur état différencié terminal et de leur manque de capacité de prolifération, il est difficile d’étudier les podocytes ex vivo. À l’aide de l’immortalisation conditionnelle des podocytes primaires, il est possible de surmonter cette limitation par l’insertion d’un interrupteur thermosensible, ce qui donne un modèle de culture cellulaire où les cellules prolifèrent à 33 °C et se différencient à 37 °C13,14. Bien que ces ciPodocytes aient un fort potentiel pour la recherche sur les podocytaires, il existe des limites, telles que le manque d’expression des marqueurs, la morphologie dédifférenciée et l’incapacité à former des processus du pied15,16.
La différenciation des podocytes des cellules somatiques dérivées du patient permet la génération et la comparaison de podocytes malades avec des cellules témoins saines ex vivo. Cela nous permet d’étudier les dommages causés aux podocytes par des mutations dans les gènes spécifiques des podocytes. De plus, travailler avec des CSPhi a le potentiel de créer des modèles tridimensionnels de culture cellulaire pathologique, ou plutôt des organoïdes43,44. La co-culture de podocytes dérivés de l’hiPSC avec d’autres cellules glomérulaires, comme les cellules endothéliales glomérulaires ou les cellules mésangiales, pourrait conduire à de nouvelles connaissances sur la communication intercellulaire dans la santé et les maladies glomérulaires.
De plus, la caractérisation et le traitement des podocytes spécifiques au patient peuvent être effectués ex vivo dans le cadre d’une analyse à haut débit. L’approche individualisée ouvre la possibilité d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques pour des mutations spécifiques et de pratiquer une médecine individualisée à l’avenir.

Les podocytes sont des cellules épithéliales rénales post-mitotiques spécialisées qui forment la barrière de filtration glomérulaire du rein avec la membrane basale glomérulaire (GBM), les cellules endothéliales glomérulaires et le glycocalyx. Phénotypiquement, les podocytes sont constitués d’un corps cellulaire et d’extensions membranaires primaires entraînées par microtubules, ainsi que d’extensions secondaires appelées processus du pied 1,2. La barrière de filtration glomérulaire qui filtre l’urine du sang est construite en endothélium fenêtré, GBM, et un type spécialisé de jonction intercellulaire qui relie les processus voisins du pied podocytaire, appelé diaphragme à fente de podoctyes3. Dans des conditions saines, les protéines plus grosses que l’albumine sont retenues de la barrière de filtration en raison de leur taille et de leur charge4.
Les mutations dans les gènes spécifiques du cytosquelette ou du podocyte, ainsi que les facteurs circulants affectant les voies de signalisation des podocytes, sont connus pour induire l’effacement, le détachement ou l’apoptose des podocytes, entraînant une protéinurie et une sclérose glomérulaire. En particulier, le réarrangement cytosquelettique, les changements de polarité des podocytaires ou les dommages aux processus du pied avec une perte associée des jonctions fendues sont essentiels5. En raison de leur statut différencié en phase terminale, les podocytes peuvent difficilement être remplacés après le détachement du GBM. Cependant, si les podocytes sont attachés au GBM, ils peuvent encore se remettre de l’effacement et de la réforme des processus interdigitaux du pied 6,7,8. Une meilleure compréhension des événements qui conduisent à des dommages aux podocytaires dans divers troubles glomérulaires peut fournir de nouvelles cibles thérapeutiques qui aideront à développer des traitements pour ces maladies. Les lésions podocytaires sont caractéristiques de différentes maladies glomérulaires, notamment la glomérulosclérose segmentaire focale (FSGS), la néphropathie diabétique, la maladie à changement minimal et la glomérulonéphropathie membraneuse, nécessitant des modèles ex vivo fiables de podocytes pour étudier les mécanismes pathologiques et les approches de traitement potentielles de ces maladies 9,10. Les podocytes peuvent être étudiés ex vivo par culture cellulaire primaire classique basée sur l’isolement des glomérules par tamisage différentiel11. Cependant, en raison de l’état de différenciation terminale avec une capacité de prolifération limitée, la plupart des chercheurs utilisent des lignées cellulaires ciPodocytes de souris ou humaines qui expriment des variantes sensibles à la température du grand antigène T SV40. Alternativement, les ciPodocytes sont isolés à partir de souris transgéniques hébergeant le gène immortalisant SV40 Tag 1,12.
Les CiPodocytes prolifèrent à 33 °C, mais entrent en arrêt de croissance et commencent à se différencier à 37 °C13,14. Il faut garder à l’esprit que les données expérimentales obtenues avec ces cellules doivent être interprétées avec une certaine prudence, car les cellules sont générées à l’aide d’une insertion de gène non naturelle15. Comme ces cellules hébergent un gène immortalisant, la physiologie cellulaire est altérée en raison de la prolifération en cours12. Les lignées cellulaires de podocytes générées par cette approche ont récemment été remises en question, car les ciPodocytes de souris, d’humains et de rats expriment moins de 5% de synaptopodine et de néphrine au niveau des protéines, ainsi que NPHS1 et NPHS2 au niveau de l’ARNm par rapport à l’expression glomérulaire16. De plus, la plupart des lignées cellulaires de podocytes n’expriment pas la néphrine17,18. Chittiprol et al. ont également décrit une différence significative dans la motilité cellulaire et les réponses à la puromycine et à la doxorubicine dans les ciPodocytes16. Les podocytes peuvent être trouvés dans l’urine après détachement du GBM dans différentes maladies glomérulaires 19,20,21,22. Les podocytes urinaires viables peuvent être cultivés ex vivo jusqu’à 2-3 semaines, mais la plupart des cellules subissent une apoptose23,24. Fait intéressant, les podocytes ne se trouvent pas seulement dans l’urine des patients atteints de maladie glomérulaire, mais aussi dans l’urine de sujets sains, très probablement lorsqu’ils sont sénescents à nouveau avec un potentiel limité de réplication en culture24. De plus, le nombre de podocytes d’origine urinaire est limité et les cellules se dédifférencient en culture, montrent moins de processus du pied, changent de morphologie et, surtout, ont une capacité de prolifération limitée. L’expression des gènes spécifiques aux podocytes est absente, disparaît en quelques semaines ou varie entre ces clones cellulaires. Certaines cellules positives pour le marqueur spécifique du podocyte ont co-exprimé le marqueur de cellules épithéliales tubulaires ou de myofibroblastes et de cellules mésangiales, ce qui suggère une dédifférenciation et/ou une transdifférenciation des podocytes urinaires en culture24,25.
Récemment, la génération de lignées cellulaires ciPodocyte dérivées de l’urine de patients et de volontaires sains par transduction avec un antigène T SV40 de grande taille thermosensible et hTERT a été décrite26. L’expression de l’ARNm pour la synaptopodine, la nestine et la protéine associée à CD2 a été détectée, mais l’ARNm de podocine était absent dans tous les clones. En plus des problèmes avec les podocytes urinaires, ces cellules contiennent également le gène immortalisant inséré, ce qui entraîne les inconvénients discutés ci-dessus.
En revanche, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPhi) ont une énorme capacité à s’auto-renouveler et à se différencier en plusieurs types de cellules dans des conditions appropriées. Il a déjà été démontré que les CSPhi peuvent servir de source presque illimitée de podocytes27,28.
Ici, un protocole en deux étapes pour générer des podocytes spécifiques au patient à partir de fibroblastes dermiques de biopsies cutanées avec reprogrammation épisomique ultérieure en CSPhi et une différenciation finale en podocytes dérivés des CSPhi est décrit (Figure 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig01.jpg"> Figure 1 : Protocole de génération de podocytes dérivés de l’hiPSC spécifiques au patient. Vue d’ensemble graphique du protocole de génération de podrocytes spécifiques au patient à partir de fibroblastes dermiques d’une biopsie cutanée par reprogrammation en CSPhi et différenciation en podocytes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Dans un premier temps, les fibroblastes dermiques somatiques ont été dépassés par une biopsie cutanée et reprogrammés en CSPhi en utilisant une méthode sans intégration par électroporation avec des plasmides exprimant les facteurs de transcription OCT3/4, KLF4, SOX2 et c-MYC 29,30,31. Les colonies de CSP émergentes ont ensuite été sélectionnées et élargies. La différenciation a commencé par l’induction de la lignée mésodermique par l’activation de la voie de signalisation WNT, suivie de la génération de cellules progénitrices de néphron qui étaient encore capables de proliférer. Enfin, les cellules ont été différenciées en podocytes. Dans cette procédure, nous avons modifié et combiné des protocoles précédemment publiés pour la reprogrammation épisomique pour la génération de CSPhi par Bang et al.32 et Okita et al.33, ainsi qu’un protocole pour la différenciation des CSPhi en podocytes par Musah et al.28,34,35.
En effet, les podocytes générés par notre protocole avaient un phénotype plus proche des podocytes in vivo, concernant le développement d’un réseau distinct de processus primaires et secondaires du pied et l’expression de marqueurs spécifiques aux podocytes, comme la synaptopodine, la podocine et la néphrine. Avec l’utilisation de podocytes dérivés de l’hiPSC, le bagage génétique du patient est maintenu pendant la reprogrammation et la différenciation. Cela permet la modélisation de la maladie des podocytes spécifique au patient et la découverte de substances thérapeutiques potentielles ex vivo dans un nombre presque illimité de cellules. De plus, ce protocole est peu invasif, rentable, acceptable sur le plan éthique et peut faciliter de nouvelles voies pour le développement de médicaments.

<table><tbody><tr><td>0,2 et micro ; m filtre stérile</td><td>Rotilab</td><td>P668.1</td><td>pour la stérilisation du milieu de différenciation</td></tr><tr><td>Acide rétinoïque tout trans Stem</td><td>Cell Technologies</td><td>72262</td><td>complément pour la différenciation</td></tr><tr><td>Supplément B27 (50 x), sans sérum</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>complément pour milieu de différenciation sans sérum</td></tr><tr><td>BG iMatrix-511 Biogemmes de soie</td><td></td><td>RL511S</td><td>option supplémentaire de réactif de matrice extracellulaire utilisé dans une solution d’enrobage pour enrober des plastiques de culture cellulaire adaptés à la culture hiPSC</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)&nbsp ;</td><td>Roth</td><td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Bouchon filtrant Fioles de culture cellulaire, T75, 250 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-856</td><td>plastiques de culture cellulaire adaptés à la culture de fibroblastes</td></tr><tr><td>CHIR99021 (5 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252917-06-9&nbsp ;</td><td>Supplément pour la différenciation</td></tr><tr><td>Matrice qualifiée Corning Matrigel hESC&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>option supplémentaire de réactif de matrice extracellulaire utilisé dans la solution de revêtement pour enrober les plastiques de culture cellulaire adaptés à la culture hiPSC (matrice à membrane basale solubilisée)</td></tr><tr><td>countess Lames de chambre de comptage de cellules</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>pour compter</td></tr><tr><td>les cellules countess II FL&nbsp ; Compteur de cellules automatisé</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>pour le comptage des cellules</td></tr><tr><td>Tubes cryoPure, 2 ml, bouchon à vis QuickSeal,</td> cryoflacons <td>Sarstedt</td><td>72380</td> blancs <td>pour la congélation de cellules</td></tr><tr><td>de diméthylsulfoxyde (DMSO)&nbsp ;</td><td>Roth</td><td>A994.1</td><td>pour milieu de congélation de fibroblastes</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1 x)</td><td>Gibco</td><td>11320074</td><td>milieu de base pour la différenciation</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>milieu de base pour milieu de fibroblastes</td></tr><tr><td>Système d’imagerie EVOS M5000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td>microscope à contraste de phase</td></tr><tr><td>sérum fœtal bovin premium, inactivé (FCS)</td><td>PAN Biotech</td><td>P301902</td><td>sérum pour milieu de fibroblastes, milieu de congélation de fibroblastes et milieu de maintien des podocytes</td></tr><tr><td>fisherbrand Cuvettes d’électroporation Plus, espace de 4 mm, 800 & micro ; Cuvette Fisherbrand</td><td></td><td>FB104</td> stérile <td>d’une capacité L utilisée pour l’électroporation/reprogrammation épisomale de fibroblastes (espace de 4 mm)</td></tr><tr><td>Milieu de montage fluoromount-G, avec support de montage DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td> contenant une aiguille <td>de jauge dapi</td></tr><tr><td>(0,6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance3</td><td>300700</td><td>pour la séparation des colonies de cellules hiPSC en petits morceaux</td></tr><tr><td>Protéine d’activine A recombinante humaine</td><td>78001.1</td><td>Complément de technologies de cellules souches</td><td>pour la différenciation</td></tr><tr><td>de la protéine morphogénétique osseuse recombinante humaine 7 (BMP7)</td><td>Peprotech</td><td>120-03P</td><td>supplément pour la différenciation</td></tr><tr><td>humaine VEGF-165 Protéine recombinante</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHC9394</td><td>supplément pour la différenciation</td></tr><tr><td>insuline-transfertrine-sélénium (ITS -G) (100 x)</td><td>Supplément</td><td>de 41400045</td><td>Gibco pour podocytes maintenance medium</td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Roth</td><td>X964.1</td><td>pour le test de stérilité de la culture hiPSC</td></tr><tr><td>lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MP0035-1KT</td><td>commercial mycoplasme detection slides</td></tr><tr><td></td><td>Diagonal GmbH & Co.KG</td><td>21,102</td><td></td></tr><tr><td>microtube 1,5 mL&nbsp ;</td><td>Sarstedt</td><td>72706400</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 Kit complet</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85850</td><td>milieu de base pour milieu de culture hiPSC sans sérum</td></tr><tr><td>récipient de congélation nalgene M.Frosty</td><td>Roth</td><td>AC96.1&nbsp ;</td><td>pour assurer des conditions de congélation optimales</td></tr><tr><td>sérum de chèvre normal</td><td>ABCAM</td><td>AB 7481</td><td>pour solution de préincubation et diluant d’anticorps</td></tr><tr><td>nunc 24 plaques à 24 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>142485</td><td>plastiques de culture cellulaire adaptés à la culture hiPSC</td></tr><tr><td>nunc plaques à 48 puits&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>152640</td><td>plastiques de culture cellulaire adaptés à la culture hiPSC</td></tr><tr><td>nunc plaques à 6 puits&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>140685</td><td>plastiques de culture cellulaire adaptés à la culture hiPSC</td></tr><tr><td>nunc EasYDish Boîtes 100 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150466</td><td>plastiques de culture cellulaire adaptés à la culture hiPSC</td></tr><tr><td>nunc MicroWell 96 puits, Nunclon traité Delta, microplaque à fond plat</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>plastiques de culture cellulaire adaptés à la culture hiPSC</td></tr><tr><td>nutriFreez D10 Milieu de cryoconservation</td><td>Sartorius</td><td>05-713-1F&nbsp ;</td><td>Milieu de cryoconservation sans sérum pour la cryoconservation de cellules progénitrices hiPSC et néphrons</td></tr><tr>Milieu <td>d’électroporation 11058021</td> <td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plasmide pCXLE-hMLN</td><td>Addgene</td><td>#27079</td><td>pour la reprogrammation épisomale</td></tr><tr><td>Plasmide pCXLE-hOCT3/4 Plasmide</td><td>Addgene</td><td>#27077</td><td>pour la reprogrammation épisomale</td></tr><tr><td>Plasmide pCXLE-hSK Plasmide</td><td>Addgene</td><td>#27078</td><td>pour la reprogrammation épisomale</td></tr><tr><td>pénicilline-streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td>pour éviter la contamination bactérienne</td></tr> plastique <tr><td> lamelles</td><td>de recouvrement Sarstedt</td><td>&nbsp ; 83.1840.002</td><td>pour la coloration immunofluorescente des hiPSC et des podocytes dérivés des hiPSC</td></tr><tr><td>ROTI Histofix</td><td>Roth</td><td>P087.3</td><td>paraformaldéhyde commercial (4 %) pour la fixation des cellules</td></tr><tr><td>RPMI 1640 + L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>21875034</td><td>milieu de base pour le milieu d’entretien des podocytes</td></tr><tr><td>chambre de coloration StainTray Couvercle noir</td><td>Roth</td><td>HA51.1</td><td></td></tr><tr><td>stemPro Accutase Réactif de dissociation cellulaire</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>solution enzymatique de détachement cellulaire utilisée pour la dissociation des hiPSC</td></tr><tr><td>solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) (1 x)</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>utilisé pour le lavage et l’enrobage</td></tr><tr><td>de l’eau stérile</td><td>Seringue Roth</td><td>T1432</td><td></td></tr><tr><td>sans aiguille 20 mL</td><td>BD Plastipak</td><td>300629</td><td>pour filtrer stériliser milieu de différenciation</td></tr><tr><td>Boîte TC 100 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,902</td><td>Plastiques stériles de culture cellulaire utilisés pour l’incision de la biopsie cutanée et la culture de fibroblastes</td></tr><tr><td>Boîte TC 35 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,900</td><td>Plastiques stériles de culture cellulaire utilisés pour l’extraction des fibroblastes de la biopsie cutanée</td></tr><tr><td>triton X 100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td>pour la solution de préincubation&nbsp ;</td></tr><tr><td>trypan Blue Stain (0,4 %) à utiliser avec le compteur de cellules automatisé Countess</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>pour compter les cellules</td></tr><tr><td>trypsine-EDTA (10 x)&nbsp ;</td>Réactif de dissociation <td>Biowest</td><td>X0930-100</td><td>utilisé pour les fibroblastes et les cellules progénitrices du néphron</td></tr><tr><td>tube 15 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271-N</td><td></td></tr><tr><td>tube 50 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>vitronectine ACF</td><td>Sartorius</td><td>05-754-0002</td><td>réactif de matrice extracellulaire utilisé dans une solution d’enrobage pour enrober des plastiques de culture cellulaire adaptés à la culture</td></tr> <tr><td>hiPSCChlorhydrate d’Y-27632 (10 mg)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>pour éviter l’apoptose des hiPSC lors de la division</td></tr><tr><td><forts>Anticorps primaires</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4&nbsp ;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60093.1</td><td>marqueur de pluripotence, dilution 1:200</td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60062FI.1</td><td>marqueur de pluripotence, dilution 1:100</td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>marqueur de prolifération, dilution 1:300</td></tr><tr><td>synaptopodine</td><td>Proteintech</td><td>21064-1-AP</td><td>marqueur spécifique des podocytes, dilution 1:200</td></tr><tr><td>néphrine</td><td>Progen</td>Marqueur spécifique du podocyte <td>GP-N2</td><td>, dilution 1:25</td></tr><tr><td>podocin</td><td>proteintech</td><td>20384-1-AP</td><td>Marqueur spécifique du podocyte, dilution 1:100</td></tr><tr><td><fort>Anticorps secondaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>goat anti-GigG (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée élevée, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21435</td><td>secondaire et son corps, dilution 1:1000</td></tr><tr><td>alexa Fluor 647 Kit SFX anti-lapin de chèvre,</td><td>Invitrogen</td><td>A31634</td> secondaire hautement adsorbé de manière croisée<td>, dilution 1:1000</td></tr><tr><td>IgG anti-lapin d’âne (H+L) Anticorps secondaire hautement adsorbé de manière croisée, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>secondaire et corps, dilution 1:1000</td></tr><tr><td>IgG anti-souris de chèvre (H+L) Anticorps secondaire adsorbé croisé, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>secondaire et son corps, dilution 1:1000</td></tr><tr><td>chèvre anti-IgG de souris (H+L) anticorps secondaire adsorbé croisé, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>secondaire etitbody, dilution 1:1000</td></tr></tbody></table>

génération de podocytes dérivés de patients à partir de biopsies cutanées

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

Les podocytes sont des cellules épithéliales situées sur le site urinaire de la barrière de filtration glomérulaire qui contribuent à la fonction filtrante sélective du glomérule. Les mutations dans les gènes spécifiques des podocytes peuvent provoquer une glomérulosclérose segmentaire focale (FSGS), et les podocytes sont également affectés dans de nombreuses autres néphropathies primaires et secondaires. En raison de leur nature différenciée, les modèles de culture cellulaire primaire sont limités pour les podocytes. Par conséquent, des cellules immortalisées conditionnellement sont couramment utilisées. Cependant, ces podocytes immortalisés conditionnellement (ciPodocytes) ont plusieurs limites: les cellules peuvent se dédifférencier en culture, en particulier lorsqu’elles atteignent la confluence, et plusieurs marqueurs spécifiques aux podocytes ne sont que légèrement ou pas exprimés du tout. Cela remet en question l’utilisation des ciPodocytes et leur applicabilité pour la portée physiologique, physiopathologique et clinique. Ici, nous décrivons un protocole pour la génération de podrocytes humains - y compris des podrocytes spécifiques au patient - à partir d’une biopsie cutanée à l’emporte-pièce par reprogrammation épisomale des fibroblastes dermiques en hiPSCs et différenciation ultérieure en podocytes. Ces podocytes ressemblent beaucoup mieux aux podocytes in vivo en termes de caractéristiques morphologiques, comme le développement des processus du pied et l’expression du marqueur spécifique du podocyte. Enfin, et c’est important, ces cellules maintiennent les mutations des patients, ce qui permet d’améliorer le modèle ex vivo pour étudier les maladies des podocytaires et les substances thérapeutiques potentielles dans une approche individualisée.

Avec ce protocole étape par étape qui combine la reprogrammation épisomique et la différenciation, il est possible de générer des podocytes porteurs de la mutation d’un patient dans un gène pertinent pour les podocytaires. Cela permet d’analyser ex vivo les altérations des podocytes spécifiques à la maladie. Le bagage génétique du patient est préservé pendant le protocole pendant toutes les différentes étapes cellulaires. En outre, la limitation du nombre insuffisant de cellules de podocytes non proliférants différenciés en phase terminale peut être surmontée en utilisant des podocytes dérivés de l’hiPSC. Bien qu’il faille plusieurs mois avant que les hiPSC-podocytes soient générés à partir de fibroblastes dermiques dépassés par reprogrammation en hiPSCs et différenciation ultérieure en podocytes, il est possible de congeler les cellules à trois étapes différentes du protocole (Figure 2). La congélation est possible pour les fibroblastes, les CSPhi et les cellules progénitrices du néphron après différenciation dans le milieu de différenciation des progéniteurs du néphron pendant 7 jours. Par conséquent, la génération de banques de cellules fonctionnelles et d’expériences à grande échelle est possible.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig02.jpg"> Figure 2 : Étapes individuelles du protocole à travers un microscope à contraste de phase. (A) Fibroblastes dermiques dépassés. (B) formation de colonies de hiPSC après reprogrammation. (C) Sélection de la culture hiPSC. (D) Cellules mésodermiques après 2 jours de différenciation. (E) Cellules progénitrices du néphron après 14 jours de différenciation dans le milieu de différenciation des progéniteurs du néphron. (F) Podrocytes dérivés de hiPSC différenciés en phase terminale. Les barres d’échelle représentent 300 μm (A, B, D-F) et 150 μm (C). Le flocon de neige met en évidence les étapes de gel possibles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Comme les podocytes générés dérivés de l’hiPSC traversent un long protocole avec des changements drastiques concernant le type cellulaire et la morphologie, la caractérisation cellulaire est obligatoire. La morphologie cellulaire, comme la taille et la forme cellulaire, ainsi que le comportement de croissance, peuvent être surveillés à l’aide d’un microscope à contraste de phase. Les fibroblastes présentent un long phénotype en forme de fuseau d’une taille de 150 μm à 300 μm (Figure 2A). Après reprogrammation, des colonies avec des hiPSC de 50 μm se produisent. Ces colonies présentent des frontières et des CSPhi distinctes qui se distinguent par un rapport noyaux/corps élevé et un taux de prolifération accru (figure 2C). Étant donné que les podocytes sont des cellules différenciées en phase terminale, le taux de prolifération diminue avec la différenciation progressive, et la morphologie cellulaire passe à des podocytes en forme d’étoile de 300 μm avec des processus proéminents du pied (Figure 2F).
La confluence est un point critique de la culture hiPSC, et une différenciation spontanée peut apparaître lorsque les colonies deviennent trop denses (Figure 3). Ces colonies doivent être enlevées avant le passage en grattant les parties touchées de la boîte de culture.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig04.jpg"> Figure 3 : Exemples de CSPh de qualité différente. Images de contraste de phase de (A) colonies de CSPh reprogrammées et (B) de CSPh sélectionnées, ainsi que (C) différenciation spontanée, (D, E) colonies non-CSPhi, et (F) culture de CSPhi trop dense. Les barres d’échelle représentent 300 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Les différents types de cellules de ce protocole doivent être validés en ce qui concerne l’expression d’un marqueur spécifique. Après reprogrammation, les hiPSCs retrouvent leur capacité de pluripotence et expriment des marqueurs de prolifération et de pluripotence tels que SSEA4, OCT3/4 et Ki67 (Figure 4)38,39,40. On sait que la reprogrammation, ainsi que la longue culture des hiPSC et la différenciation, peuvent conduire à un caryotype anormal, ou plutôt induire des mutations41. Par conséquent, le fond génétique des cellules cultivées doit être surveillé au fil du temps et à différents passages par le g-banding et le séquençage de l’exome entier.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig03.jpg"> Figure 4 : Caractérisation des CSPh générées par coloration par immunofluorescence. Caractérisation des hiPSCs générées par coloration pour (A) le marqueur prolifératif Ki67, ainsi que les marqueurs de pluripotence (B) OCT3/4 et (C) SSEA4. Les barres d’échelle représentent 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Morphologiquement, les podocytes dérivés de l’hiPSC apparaissent en forme d’étoile et expriment un réseau distinct de longs processus primaires et secondaires du pied par rapport aux ciPodocytes (Figure 5). Les podocytes dérivés de l’HiPSC expriment des protéines marqueurs spécifiques aux podocytes comme la synaptopodine, la néphrine et la podocine (Figure 6A-C)42.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig05.jpg"> Figure 5 : Morphologie des podocytes dérivés de l’hiPSC par rapport aux ciPodocytes. Comparaison des podocytes dérivés de l’hiPSC (A,B) d’un donneur sain aux ciPodocytes (C,D) en ce qui concerne la morphologie cellulaire et les filopodies à l’aide d’un microscope à contraste de phase (A,C) et d’un microscope électronique à balayage (B,D). Les barres d’échelle représentent 150 μm (A,C) et 20 μm (B,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Par conséquent, la comparaison des podocytes dérivés de l’hiPSC non seulement de donneurs sains, mais aussi de patients présentant des mutations dans des gènes spécifiques aux podocytes, permet une caractérisation individualisée de la mutation du patient ex vivo.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig06.jpg"> Figure 6 : Caractérisation d’un marqueur spécifique aux podocytes dans les podocytes et les ciPodocytes dérivés de l’hiPSC. Comparaison des podocytes dérivés de l’hiPSC (A-C) d’un donneur sain aux ciPodocytes (D-F) en ce qui concerne les protéines marqueurs spécifiques des podocytes, la synaptopodine (A, D), la néphrine (B, E) et la podocine (C, F). Les barres d’échelle représentent 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1. Composition de tous les milieux de culture cellulaire et solutions utilisées dans l’étude. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/Table%201_REv2.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Ce manuscrit décrit un protocole en deux étapes pour générer des podocytes spécifiques au patient à partir de fibroblastes dermiques via une reprogrammation épisomique en cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPhi) et une différenciation ultérieure en podocytes.

Génération de podocytes dérivés de patients à partir de biopsies cutanées

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the ...

Nous décrivons un protocole de génération de podocytes humains par reprogrammation épisomique des fibroblastes dermiques en cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Ces cellules ressemblent beaucoup mieux aux podocytes in vivo qu’aux podocytes immortalisés en termes de processus alimentaires des podocytes et d’expression du marqueur spécifique des podocytes. Les podocytes sont des cellules différenciées en phase terminale.Par conséquent, ces cellules ne prolifèrent plus et l’analyse primaire des podocytes en culture cellulaire est limitée. Même si le problème du nombre limité de cellules a été surmonté par l’utilisation de podocytes immortalisés conditionnellement, ces podocytes présentent un phénotype et un comportement dédifférenciés, ce qui remet en question leur utilisation en recherche fondamentale. Avec l’aide de cellules souches pluripotentes induites, les podocytes peuvent être générés in vitro dans un nombre cellulaire presque illimité avec une morphologie typique des podocytaires comprenant des processus alimentaires distincts et l’expression du marqueur spécifique du podocyte.Lors de l’utilisation des cellules souches spécifiques au patient pour se différencier en podocytes, il est possible d’étudier les altérations spécifiques de la maladie de la cellule ex vivo. Dans le cas, la biopsie cutanée initiale a été prise sur un patient atteint d’une maladie génétique des podocytaires. Les podocytes générés avec notre protocole sont des cellules malades personnalisées porteuses de la mutation du patient.Ainsi, ces cellules représentent un modèle ex vivo amélioré pour étudier les maladies podocytaires et les substances thérapeutiques potentielles dans une approche individualisée.

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Dans cette vidéo, nous décrivons le protocole permettant de dériver des podocytes de reins humains à partir de cellules souches pluripotentes induites par différenciation cellulaire dans des conditions chimiques définies. Les podocytes générés peuvent être utilisés pour les tests de néphrotoxicité et la modélisation de la maladie.

Dérivation de podocytes rénaux humains à partir de cellules souches pluripotentes induites : une procédure de différenciation dirigée de podocytes rénaux matures à partir de cellules souches

L’objectif de cet article est de fournir un protocole complet et détaillé sur la façon de générer de la peau organotypique humaine génétiquement modifiée à partir de kératinocytes épidermiques et de derme humain dévitalisé.

Génération des cultures organotypiques de peau génétiquement modifiées en utilisant Dévitalisées derme humain

Nous vous proposons un protocole qui montre comment différencier des fibroblastes et des kératinocytes de dérivés de cellules souches pluripotentes induites et générer un organoïde peau 3D, à l’aide de ces kératinocytes et des fibroblastes. Ce protocole comporte une étape supplémentaire de la génération d’un modèle de souris humanisées. La technique présentée ici permettra d’améliorer la recherche dermatologique.

Génération de peau 3D Organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes

Présenté ici est un protocole chimiquement défini pour la dérivation des podocytes rénaux humains à partir de cellules souches pluripotentes induites avec une efficacité élevée (&gt;90%) et indépendant des manipulations génétiques ou de la sélection de sous-populations. Ce protocole produit le type de cellule souhaité dans les 26 jours et pourrait être utile pour les tests de néphrotoxicité et la modélisation de la maladie.

Différenciation guidée des podocytes rénaux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans des conditions chimiquement définies

Un protocole visant à concevoir un système personnalisé d’organe sur puce qui récapitule la structure et la fonction de la barrière de filtration glomérulaire rénal en intégrant des cellules endothéliales épithéliales et vasculaires génétiquement appariées différenciées des cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Ce système de bio-ingénierie peut faire progresser la médecine de précision rénale et les applications connexes.

Puce de glomérule rénal isogénique conçue à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Dissocier les cellules de différents types de tissus spécifiques requiert des paramètres spécifiques pour aggitation tissus pour obtenir un volume élevé de viabilité, de cellules cultivables. Le Miltenyi gentleMACS dissociateur optimise cette tâche avec un simple, protocole pratique. Dans cette publication, l'utilisation de cet appareil sur le tissu nerual est expliqué.

Génération d&#39;une seule cellule suspensions de tissus de souris de neurones

Une façon rapide, robuste d'isoler des cellules adultes viables souches épithéliales de la peau humaine est décrite. La méthode utilise la digestion enzymatique de la matrice collagène de la peau, suivie par la plumaison des follicules pileux et à l'isolement des suspensions de cellules uniques ou fragments de tissus pour la culture cellulaire.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales adultes de la peau humaine

Génération induites pluripotentes (cellules souches iPSC) lignes produit des lignes de différentes potentiel de développement, même quand ils passent des tests standard pour la pluripotence. Nous décrivons ici un protocole de produire des souris provenant entièrement de iPSCs, qui définit les lignes iPSC comme possédant la pluripotence...

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

Les protéines peuvent soit adopter une structure native, soit se replier en amyloïde insoluble. Les conditions qui favorisent la voie de mauvais repliement conduisent à la formation de différents types de fibrilles amyloïdes. Les méthodes décrites ici permettent une conversion rapide des protéines natives en amyloïde in vitro.

Génération rapide d’amyloïde à partir de protéines natives in vitro

Ici, nous décrivons un protocole basé sur la reprogrammation épigénétique des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) vers la génération d'une population homogène de progéniteurs musculo-squelettiques, dans des conditions de culture permissive former des amas tridimensionnels de myofibrilles contractiles (les myospheres), qui récapitulent les caractéristiques biologiques de l'homme les muscles squelettiques.

Génération de Myospheres De CSEh par Reprogrammation épigénétique

Découvrez la reprogrammation épisomale de fibroblastes dermiques en cellules souches pluripotentes induites pour générer des podocytes spécifiques au patient. Cette méthode permet d'étudier les maladies rénales de manière personnalisée.

Génération de podocytes dérivés de patients à partir de biopsies cutanées

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