Name: Mesure de la consommation d’O2 chez Drosophila melanogaster à l’aide de la microrespirométrie coulométrique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Apprenez la microrespirométrie coulométrique pour mesurer la consommation d'oxygène chez Drosophila melanogaster. Cette méthode permet d'étudier les effets des mutations génétiques sur le métabolisme.

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Nous remercions le Dr Linda Restifo de l’Université de l’Arizona d’avoir suggéré de tester la consommation d’O2 des mutants CASK et d’avoir envoyé des mutants CASK et leurs contrôles congéniques. Les frais de publication ont été fournis par le Fonds de réinvestissement départemental du département de biologie de l’Université de College Park. L’espace et certains équipements ont été fournis par les universités de Shady Grove.

1. Élevage et collecte de mouches
<ol><li>Maintenir les mouches à 25 °C dans des flacons étroits contenant de la nourriture standard pour drosophiles . NOTA : La taille de l’échantillon pour chaque génotype doit comprendre au moins neuf répétitions, chacune consistant en une seule chambre respirométrique contenant 15 à 25 mouches, configurée comme décrit ci-dessous.</li>
	<li>Transférez les mouches tous les 2-3 jours.</li>
	<li>Anesthésier les mouches avec du CO2, prélever des groupes de 15 à 25 mâles de chaque génotype et placer chaque groupe dans des flacons d’aliments frais et sans levure. NOTE : Les mâles ont été utilisés pour réduire la variabilité due à l’état reproducteur. La méthode s’applique aux deux sexes.</li>
	<li>Laisser les mouches se rétablir à 25 °C pendant au moins 24 h. REMARQUE : Au moment de l’expérience, les mouches devraient être âgées de 1 à 4 jours. La fréquence des collectes décrite à l’étape 1.3 peut être réglée de manière à réduire la tranche d’âge des mouches.</li>
</ol>2. Installation et assemblage de la chambre du respiromètre
<ol><li>Allumez le bain-marie et réglez-le à la température souhaitée pour l’expérience. NOTE : Les expériences ci-dessous ont été menées à 25 °C en utilisant des tubes de Schlenk de 50 ml comme chambres. Les composants doivent être assemblés comme indiqué dans les figures 1A, 1B et 1C.</li>
	<li>Nettoyez soigneusement les joints en verre dépoli des chambres et des bouchons de capteur en pulvérisant de l’éthanol à 70 % sur une lingette de laboratoire (et non directement sur le joint) et en essuyant la poussière et la vieille graisse du bouchon du capteur (Figure 1A). Essuyez l’éthanol avec une nouvelle lingette de laboratoire.</li>
	<li>Placez un morceau de coton de 1 cm imbibé d’eau purifiée dans le fond de la chambre pour stabiliser l’humidité.<ol><li>Ajoutez suffisamment d’eau (~0,5 ml) pour former une petite piscine au fond du rouleau de coton.</li>
	</ol></li>
	<li>Essuyez l’eau qui s’est renversée sur le joint de la chambre.</li>
	<li>Transférez les mouches dans des tubes en polypropylène étiquetés à l’aide d’un entonnoir.<ol><li>Branchez le tube à l’aide d’un rouleau de coton. REMARQUE : Les tubes sont constitués d’un tube à essai en polypropylène de 5 ml, coupé à 5,5 cm de longueur et perforé avec un couteau chaud pour permettre le libre échange d’air avec la chambre expérimentale. L’anesthésie au CO2 est connue pour provoquer des anomalies métaboliques, de sorte que les mouches sont transférées sans anesthésie, ce qui nécessite plus de soins pour éviter de perdre les mouches.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajoutez un tube ventilé contenant des mouches dans chaque chambre du respiromètre (au-dessus du coton humide).</li>
	<li>Remplissez des cartouches de chaux sodée (4-5 granulés par tube) et placez-les sur le dessus du tube contenant les mouches à l’intérieur de la chambre. REMARQUE : Les cartouches de chaux sodée sont constituées de tubes à centrifuger de 800 μL perforés 4 à 5 fois à l’aide d’une perceuse électrique.</li>
	<li>Remplir les générateurs O2 avec une solution de sulfate de cuivre saturé (CuSO4) sous le niveau des orifices d’aération REMARQUE : Les générateurs O2 sont constitués de tubes à centrifuger à bouchon à vis avec 4 trous percés sous les filetages. Les électrodes en platine (Pt) et en cuivre (Cu) sont soudées à un connecteur à deux broches, insérées dans des trous percés dans le capuchon et fixées avec de l’époxy. L’électrolyse du CuSO4 génère l’O2 consommé par l’organisme expérimental. CuSO4 est toxique pour les invertébrés, évite les déversements ou les fuites et nettoie immédiatement.</li>
	<li>Connectez le générateur O2 rempli au connecteur à deux broches sur la fiche du capteur. REMARQUE : La cathode en cuivre doit se connecter à la sortie négative du contrôleur et à l’anode en platine au fil positif. Les connexions inversées entraîneront l’échec de l’expérience.</li>
	<li>Placez deux petites noisettes de graisse silicone transparente sur les côtés opposés du joint en verre dépoli de la fiche du capteur.</li>
	<li>Insérez le bouchon dans la chambre et faites pivoter le bouchon (ou la chambre) avec une pression modérée pour répandre la graisse dans le joint.<ol><li>Essuyez l’excès de graisse avec une lingette de laboratoire.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixez les pinces Keck en plastique sur les joints pour fixer les bouchons dans les chambres. La chambre assemblée doit ressembler à la figure 1C.</li>
	<li>Répétez les étapes ci-dessus pour le nombre de chambres utilisées pour l’expérience du jour. REMARQUE : Le nombre de chambres pouvant être enregistrées est limité par le nombre de chambres, de contrôleurs et d’entrées USB disponibles pour l’ordinateur. Pour les expériences actuelles, sept chambres ont normalement été exécutées en parallèle. Les mouches expérimentales telles que les mutantes doivent être appariées avec des témoins appropriés. Une chambre installée à l’identique mais sans mouches doit être incluse dans chaque expérience pour contrôler les variations environnementales. Les chambres contenant différents traitements (mutant, wildtype, no-fly) doivent faire l’objet d’une rotation entre les expériences.</li>
	<li>Placer les chambres assemblées dans une grille au bain-marie avec les robinets d’arrêt ouverts (Figure 1E). REMARQUE : Pour éviter les variations circadiennes, les chambres ont été placées dans le bain entre 9h30 et 9h50 pour toutes les expériences décrites ici.</li>
	<li>Laissez les robinets d’arrêt ouverts (gardez la poignée parallèle au robinet d’arrêt). REMARQUE : Veillez à ne pas laisser l’eau pénétrer dans les robinets d’arrêt.</li>
	<li>Laissez les chambres s’équilibrer avec les robinets d’arrêt ouverts pendant environ 30 min. REMARQUE : Pendant que la chambre est en équilibre, connectez l’électronique et configurez l’acquisition de données comme décrit ci-dessous.</li>
</ol>3. Configuration des contrôleurs et de l’ordinateur
<ol><li>Assurez-vous que les interrupteurs fournissant du courant aux générateurs O2 sont en position OFF (loin du connecteur ; Graphique 1D).</li>
	<li>Branchez chaque boîtier de contrôleur sur un port USB (Universal Serial Bus) disponible. NOTE : Construction et programmation des unités de contrôle décrites ailleurs12.</li>
	<li>Connectez les contrôleurs aux chambres du respiromètre à l’aide de câbles à 6 conducteurs.</li>
	<li>Vérifiez que les écrans à diodes électroluminescentes organiques (OLED) des contrôleurs (Figure 1D) affichent les paramètres environnementaux.</li>
	<li>Allumez brièvement les générateurs O2 à l’aide de l’interrupteur du contrôleur (Figure 1D).<ol><li>Si la valeur du courant passe de zéro à entre 35 et 55 mA, le contrôleur et la chambre sont prêts pour les expériences.</li>
	</ol></li>
	<li>Déterminez quels ports COM sont utilisés par les contrôleurs, comme décrit ci-dessous.<ol><li>Cliquez sur l’icône Démarrer dans Microsoft Windows.</li>
		<li>Cliquez sur l’icône Paramètres .</li>
		<li>Cliquez sur Bluetooth et appareils.</li>
		<li>Assurez-vous que les contrôleurs et leurs ports COM apparaissent dans la liste des périphériques.</li>
	</ol></li>
	<li>Ouvrez PuTTY sur le bureau et configurez un fichier journal pour chaque canal du respiromètre comme décrit ci-dessous. REMARQUE : PuTTY est un shell sécurisé gratuit et un client telnet qui est utilisé pour transférer des données à l’ordinateur via des ports COM.<ol><li>Sélectionnez le port COM d’un contrôleur en tapant le numéro du port dans la zone « Ligne série » (Figure 2A).</li>
		<li>Cliquez sur Journalisation.</li>
		<li>Sélectionnez Sortie imprimable dans « Enregistrement de session » (Figure 2B).</li>
		<li>Sous Nom du fichier journal, cliquez sur Parcourir.</li>
		<li>Dans le dossier de votre choix, créez un nom de fichier contenant des informations descriptives (par exemple, la date, l’espèce, le numéro de port COM).</li>
		<li>Cliquez sur Save (Enregistrer).</li>
		<li>Cliquez sur Ouvrir. Une fenêtre s’ouvre et affiche les données délimitées par des virgules en cours d’enregistrement (Figure 2C).</li>
		<li>Répétez l’opération pour tous les autres contrôleurs utilisés dans le cadre de l’expérience. L’entrée de chaque port COM s’affiche sous la forme d’une fenêtre distincte (Figure 2D).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Exécution d’expériences
<ol><li>Une fois que les chambres se sont équilibrées pendant 30 minutes, scellez-les en fermant les robinets d’arrêt.</li>
	<li>Couvrez la baignoire et les chambres avec une boîte en mousse de polystyrène pour maintenir un environnement stable.</li>
	<li>Laisser reposer encore une heure.</li>
	<li>Allumez le courant vers le générateur O2 de chaque chambre à l’aide de l’interrupteur situé sur le boîtier de contrôle.</li>
	<li>Une fois que les générateurs O2 sont activés, assurez-vous que la pression augmente jusqu’à la pression d’arrêt préréglée. NOTE : 1017 hPa, qui est légèrement au-dessus de la pression atmosphérique, a été utilisée comme pression « OFF » dans cette série d’expériences. Le retour à la pression ambiante indiquera une fuite de gaz des chambres. De plus, il permet d’utiliser la même pression d’une expérience à l’autre, quelle que soit la pression barométrique ambiante. La pression « ON » était de 1016 hPa, ce qui signifie qu’il suffisait de baisser de 1 hPa pour que le générateur d’O2 soit activé. Cela a fourni une sensibilité adéquate pour mesurer la consommation d’O2 chez la drosophile. Une fois qu’une chambre est pressurisée au réglage « OFF », le courant devrait tomber à zéro.</li>
	<li>Laissez l’expérience se dérouler pendant 3 h ou plus. REMARQUE : Une VO2 plus élevée à des températures élevées peut permettre des durées d’expérience plus courtes. Surveillez de temps en temps pour vous assurer que l’équipement fonctionne, mais évitez toute activité excessive à proximité des chambres qui pourrait affecter la stabilité de la température.</li>
</ol>5. Expérience de finition
<ol><li>Éteignez les générateurs O2 sur tous les contrôleurs. REMARQUE : Évitez d’abord de faire fonctionner les générateurs O2 lorsque les chambres sont ouvertes.</li>
	<li>Ouvrez les robinets d’arrêt pour desceller les chambres.</li>
	<li>Laissez les fenêtres PuTTY ouvertes pendant encore 5 à 15 minutes pour fournir une base de référence finale.</li>
	<li>Fermez la fenêtre PuTTY pour chaque contrôleur, mettant fin aux enregistrements. REMARQUE : Toutes les expériences se sont terminées entre 16 h 50 et 17 h 10.</li>
	<li>Débranchez les capteurs des câbles.</li>
	<li>Déplacez les chambres sur une grille sèche.</li>
	<li>Retirez les fiches du capteur une par une des chambres.</li>
	<li>Débranchez les générateurs O2 et placez-les dans le rack à tubes.</li>
	<li>Essuyez la graisse de la fiche du capteur et conservez-la dans le rack.</li>
	<li>Nettoyez la graisse des joints de la chambre et retirez les tubes contenant des mouches et de la chaux sodée.</li>
	<li>Anesthésier les mouches dans chaque tube avec du CO2, tapoter sur un bateau de poids et peser sur une microbalance.<ol><li>Enregistrez le poids et le nombre de mouches pour chaque tube.</li>
	</ol></li>
	<li>Jetez les mouches ou mettez-les de côté pour des procédures supplémentaires.</li>
	<li>Videz la chaux sodée des cartouches dans le conteneur à déchets.</li>
	<li>Ouvrez le générateur O2 et jetez la solution CuSO4 dans le conteneur à déchets.<ol><li>Rincez les électrodes et le tube avec de l’eau purifiée.</li>
		<li>Placez les grilles tubulaires pour le séchage.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Analyse des données de transfert de charge
<ol><li>Importez des données sous forme de texte délimité par des virgules dans une feuille de calcul, chaque enregistrement étant constitué d’une feuille de calcul distincte.</li>
	<li>Enregistrez les données actuelles et temporelles pour chaque impulsion du générateurd’O2 . En commençant par la première impulsion après la mise sous pression de la chambre, notez l’heure de début et l’heure de fin (sous forme de numéros de ligne) de chaque impulsion actuelle. Il s’agit du numéro de ligne lorsque le courant passe au-dessus de zéro (généralement à environ 45-50 mA) jusqu’à la dernière ligne qui est au-dessus de zéro.</li>
	<li>Créez un tableau sur la feuille de calcul pour noter les données suivantes :<ol><li>L’amplitude moyenne du courant pendant l’impulsion : = AVERAGE([première ligne d’impulsion] :[dernière ligne d’impulsion]) pour chaque impulsion (à partir de la colonne actuelle).</li>
		<li>Durée de l’impulsion : ([Dernière ligne d’impulsion] - [première ligne d’impulsion[-une ligne]])/1000 pour chaque impulsion (à partir de la colonne temps en millisecondes).</li>
		<li>Durée totale de l’expérience : [temps au début de la dernière impulsion] - [temps à la fin de la première impulsion après la mise sous pression de la chambre] (à partir de la colonne temps en minutes).</li>
	</ol></li>
	<li>Calculez ensuite le transfert de charge (Q) pour chaque impulsion (durée X du courant moyen)</li>
	<li>Additionnez la charge de toutes les impulsions pour calculer la charge totale (Qtot).</li>
</ol>7. Analyse de la consommationd’O2
<ol><li>Configurez une nouvelle feuille de calcul pour toutes les données et saisissez ou calculez les éléments suivants pour chaque chambre :<ol><li>Qtot (charge totale)</li>
		<li>Taupes (= Q ÷ 96485 × 4)</li>
		<li>mL O2 (= moles × 22413 mL/mol)</li>
		<li>Temps total (à partir de l’analyse des données ci-dessus)</li>
		<li>mL min-1 (= ml Ø2 ÷ temps total)</li>
		<li>Poids en grammes (mouches anesthésiées et pesées mesurées après l’expérience)</li>
		<li>mL min-1 g-1 (= mL min-1 ÷ poids en grammes)</li>
		<li>mL/h/g (le × ci-dessus 60)</li>
		<li>mg/mouche (= poids des mouches ÷ nombre de mouches)</li>
		<li>μL fly-1 h-1 (= (mL min-1 × 3600) ÷ nombre de mouches).</li>
	</ol></li>
	<li>Compiler les données pour chaque traitement (génotype, p. ex.)</li>
	<li>Comparez les traitements à l’aide de l’ANOVA, du test t ou du test u de Mann-Whitney 13.</li>
</ol>

Adaptation de la microrespirométrie à la drosophile - Aperçu du métabolisme des mutants CASK

<ol><li>Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rates+in+genetically+based+long+lived+strains+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila.</a> Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).</li>
<li>Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nutrient+balance+shapes+phenotypic+traits+of+Drosophila+melanogaster+in+interaction+with+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+A%3A+Molecular+%26+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 241, 110626(2020).</li>
<li>Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rate+and+hypoxia+tolerance+are+affected+by+group+interactions+and+sex+in+the+fruit+fly+%28Drosophila+melanogaster%29%3A+new+data+and+a+literature+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey.</a> Biology Open. 6, 471-480 (2017).</li>
<li>Lighton, J. R. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLighton%2C+JRB+%22Measuring+Metabolic+Rates%22">Measuring Metabolic Rates</a>. , Oxford University Press. Oxford. (2019).</li>
<li>Fiorino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallelized%2C+real-time%2C+metabolic-rate+measurements+from+individual+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila.</a> Scientific Reports. 8 (1), 14452(2018).</li>
<li>Berrigan, D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+temperature+and+activity+on+the+rate+of+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).</li>
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<li>Botero, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromin+regulates+metabolic+rate+via+neuronal+mechanisms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila.</a> Nature Communications. 12 (1), 4285(2021).</li>
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<li>Ross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-specific+decrease+in+aerobic+efficiency+associated+with+increase+in+oxygen+free+radical+production+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).</li>
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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

La procédure ci-dessus illustre la mesure de la consommation d’O2 chez D. Melanogaster à l’aide d’un microrespiromètre coulométrique électronique. Les données obtenues pour la consommationd’O2 chez le D. melanogaster de type sauvage se situaient dans les fourchettes décrites dans la plupart des publications antérieures utilisant diverses méthodes (tableau 1), bien qu’un peu inférieures à celles rapportéespar d’autres 3,6<sup class...

La capacité de mesurer le taux métabolique est cruciale pour une compréhension complète d’un organisme dans son contexte environnemental. Par exemple, il est nécessaire de mesurer le taux métabolique afin de comprendre son rôle dans la durée de vie1, le rôle de l’alimentation dans le métabolisme2, ou encore le seuil du stress hypoxique3.
Il existe deux approches générales pour mesurer le taux métabolique4. La calorimétrie directe mesure directement la dépense énergétique en mesurant la production de chaleur. La calorimétrie indirecte mesure la production d’énergie par d’autres moyens, souvent par mesure respirométrique de la consommation d’O2 (V,O2), deCO2 ou des deux. Bien que la calorimétrie directe ait été appliquée à de petits ectothermes, y compris Drosophila melanogaster5, la respirométrie est techniquement plus simple et plus couramment utilisée.
Plusieurs formes de respirométrie ont été utilisées avec succès pour mesurer le taux métabolique chez D. melanogaster de type sauvage et mutant et ont fourni un aperçu des effets métaboliques de la température6, de l’environnement social 3, de l’alimentation 3,7 et des troubles neurodéveloppementaux8. Ceux-ci se répartissent en deux classes, dont le coût et la complexité varient considérablement. La manométrie est la plus simple et la moins coûteuse9,10, dans laquelle les mouches sont placées dans une chambre scellée qui contient un absorbant de CO2 et qui est reliée par un mince capillaire à un réservoir de fluide. Au fur et à mesure que l’O 2 est consommé et que le CO2 est absorbé, la pression dans la chambre diminue et le fluide est aspiré dans le capillaire. Le volume rempli de liquide du capillaire est donc proportionnel à VO2. Des versions plus élaborées, qui compensent la force exercée par le fluide dans le capillaire, ont également été utilisées sur D. melanogaster1. La manométrie a l’avantage d’être simple et peu coûteuse, mais, parce qu’elle est sensible à la pression, elle nécessite des conditions environnementales constantes. De plus, comme l’O 2 consommé n’est pas remplacé, la pression partielle d’O2 (PO2) diminue progressivement à l’intérieur des chambres.
La respirométrie utilisant l’analyse des gaz est également régulièrement utilisée pour D. melanogaster. Dans ce cas, les gaz sont échantillonnés à intervalles réguliers dans des chambres scellées contenant des mouches et envoyés à un analyseur infrarouge 2,6,11. Ce type d’appareil présente l’avantage d’être disponible dans le commerce, d’être moins sensible aux conditions environnementales et de rafraîchir les gaz pendant l’échantillonnage afin que le PO2 reste stable. Cependant, l’équipement peut être coûteux et complexe à utiliser.
Un microrespiromètre coulométrique récemment mis au point12 offre une alternative peu coûteuse, sensible et stable aux systèmes existants. En pratique, un organisme est placé dans une chambre hermétique où il consomme de l’O 2 et le CO2 expiré est éliminé par un matériau absorbant, ce qui entraîne une diminution nette de la pression de la chambre. Lorsque la pression interne diminue jusqu’à un seuil prédéfini (seuil ON), le courant passe à travers un générateur électrolytique d’O2, ramenant la pression à un deuxième seuil (seuil OFF) arrêtant l’électrolyse. Le transfert de charge à travers le générateur d’O2 est directement proportionnel à la quantité d’O2 nécessaire pour repressuriser la chambre et peut donc être utilisé pour mesurer l’O2 consommé par l’organisme4. La méthode est très sensible, mesure la V O2 avec précision, et le remplacement régulier de l’O2 peut maintenir la PO2 à un niveau presque constant pendant des heures ou des jours.
Le microrespiromètre coulométrique utilisé dans cette étude utilise un capteur électronique multimodal (pression, température et humidité). Le capteur est actionné par un microcontrôleur qui détecte les petits changements de pression et active la génération d’O2 lorsqu’un seuil de basse pression est atteint12. Cet appareil est assemblé à partir de pièces prêtes à l’emploi, peut être utilisé avec une grande variété de chambres et d’environnements expérimentaux, et a été utilisé avec succès pour examiner les effets de la masse corporelle et de la température sur le coléoptère Tenebrio molitor. Dans la présente étude, le microrespiromètre a été adapté pour mesurer la consommation d’O2 chez D. melanogaster, qui représente environ 1 % de la masse de T. molitor. La sensibilité de l’appareil a été augmentée en abaissant le seuil d’activation de la génération d’O2, et la stabilité de l’environnement a été améliorée en effectuant des expériences dans un bain-marie à température contrôlée et en maintenant l’humidité à l’intérieur des chambres à 100 % ou presque.
La protéine CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), qui fait partie de la famille des guanylate kinases associées à la membrane (MAGUK), est un échafaudage moléculaire dans différents complexes multiprotéiques, et les mutations de CASK sont associées à des troubles neurodéveloppementaux chez l’homme et chez D. melanogaster13,14. Un mutant viable de D. melanogaster, CASKΔ18, perturbe l’activité des neurones dopaminergiques 15 et réduit les niveaux d’activité de plus de 50 % par rapport aux témoins congéniques14,16. En raison des niveaux d’activité réduits des mutants CASK et du rôle des catécholamines dans la régulation du métabolisme, nous avons émis l’hypothèse que leur taux métabolique standard, et donc leur consommation d’O2, seraient considérablement réduits par rapport aux témoins.
La consommationd’O2 a été mesurée dans le fûtΔ18 et leurs congénères de type sauvage, w(ex33). Des groupes de mouches ont été placés dans des chambres de respirométrie, la consommation d’O2 a été mesurée, la consommation d’O2 a été calculée et exprimée à la fois en fonction de la masse et par mouche. L’appareil a enregistré la V O2 chez les mouches de type sauvage, ce qui était cohérent avec les études précédentes, et il a pu faire la différence entre la consommationd’O2 par mouche des mouches mutantes de type sauvage et CASK mutantes.

<table><tbody><tr><td>19/22 Adaptateur de thermomètre</td><td>Wilmad-Labglass</td><td>ML-280-702</td><td>Connecteur de capteur</td></tr><tr><td>2 ml Tubes à bouchon à vis</td><td>Fisher</td><td>3464</td><td>O2</td></tr><tr><td>Connecteur 2 broches</td><td>Zyamy</td><td>40PIN-RFB10</td><td>O2 générateur : coupé à 2 broches</td></tr><tr><td>4 broches Connecteur femelle</td><td>TE Connectivity</td><td>215299-4</td><td>Fiche de capteur</td></tr><tr><td>5 ml Tube en polypropylène</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Coupé à 5,5 cm et perforé</td></tr><tr><td>50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint</td><td>Laboy</td><td>Chambre HMF050804</td><td></td></tr><tr><td>Câble 6 conducteurs</td><td>Zenith</td><td>6 conducteurs 26 ga</td><td>Câble</td></tr><tr><td>6 broches femelle</td> connecteur <td>de cloison Switchcraft</td><td>17982-6SG-300</td><td>Contrôleur</td></tr><tr><td>6 broches Connecteur femelle</td><td>Switchcraft</td><td>18982-6SG-522</td><td></td></tr><tr><td>Connecteur capteur 6 broches</td> mâle <td>Switchcraft</td><td>16982-6PG-522</td><td>Câble</td></tr><tr><td>800 ul tube centrifuge</td><td>Fisher</td><td>05-408-120</td><td>Cartouche de chaux sodocalcique</td></tr><tr><td>ABS Boîtier en plastique Bud</td><td>Industries</td><td>PS-11533-G</td><td>Contrôleur</td></tr><tr><td>Arduino Nano Chaque</td><td>contrôleur ABX00028 Arduino LLC</td><td></td><td>BME</td></tr><tr><td>280 Capteur</td><td>DIYMall</td><td>FZ1639-BME280</td><td>Capteur Fiche</td></tr><tr><td>Carte de circuit imprimé</td><td>Lheng</td><td>5 X 7 cm</td><td>Contrôleur</td></tr><tr><td>Sulfate de Cuivre</td><td>BioPharm</td><td>BC2045</td><td>O2</td></tr><tr><td>Générateur Ordinateur</td><td>Azulle</td><td>Byte4</td><td>Acquisition de données</td></tr><tr><td>Rouleaux de coton</td><td>Kajukajudo</td><td>#2</td><td>Coupé en deux pour boucher les tubes anti-mouches Coupé en quartiers pour l’humidité</td></tr><tr><td>Chambre environnementale</td><td>Percival</td><td>I30 VLC8</td><td>Soin des mouches</td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>JB Weld</td><td>Plastic Bonder Sécurise</td><td>les électrodes dans O2 Générateur</td></tr><tr><td>Fly Food</td><td>Lab Express</td><td>Type R</td><td>Fly Care</td></tr><tr><td>Keck Clamps</td><td>uxcell</td><td>a20092300ux0418</td><td>Sécurise le joint en verre de la chambre pour boucher</td></tr><tr>Epoxy <td>Loctite</td><td>E-30CL</td> Capteur à<td>faible viscosité</td><td>Fiche</td></tr><tr><td>OLED Affichage OLED</td><td>IZOKEE</td><td>IZKE31-IIC-WH-3</td><td>Contrôleur</td></tr><tr><td>Platinum Wire 24 ga</td><td>uGems</td><td>14349</td><td>O2</td></tr><tr><td>générateur Graisse silicone</td><td>Dow-Corning</td><td>Graisse sous vide poussé</td><td>Joints d’étanchéité de la chambre Connexion à prise</td></tr><tr><td>Soda Lime</td><td>Jorvet</td><td>JO553</td><td>CO2</td></tr><tr><td>absorption Interrupteur à bascule</td><td>E-Switch</td><td>100SP1T1B1M1QEH</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur Câble USB Sabrent</td><td></td><td>CB-UM63</td><td>Contrôleur</td></tr><tr><td>Hub USB</td><td>Atolla</td><td>Hub 3.0</td><td>Connecter les contrôleurs à l’ordinateur</td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td>Amersham</td><td>56-1165-33</td><td>Contrôle de la température</td></tr><tr><td>Réservoir de bain-marie Cages</td><td>en verre</td> Bain <td>acrylique sans rebord de 15 litres pour respiromètres</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de la consommation d’o2 chez drosophila melanogaster à l’aide de la microrespirométrie coulométrique

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

La microrespirométrie coulométrique est une méthode simple et peu coûteuse pour mesurer la consommation d’O2 de petits organismes tout en maintenant un environnement stable. Un microrespiromètre coulométrique est constitué d’une chambre hermétique dans laquelle l’O 2 est consommé et le CO2 produit par l’organisme est éliminé par un milieu absorbant. La diminution de pression qui en résulte déclenche la production électrolytique d’O2, et la quantité d’O2 produite est mesurée en enregistrant la quantité de charge utilisée pour la générer. Dans la présente étude, la méthode a été adaptée à Drosophila melanogaster testée en petits groupes, avec la sensibilité de l’appareil et les conditions environnementales optimisées pour une grande stabilité. La quantitéd’O2 consommée par les mouches sauvages dans cet appareil est cohérente avec celle mesurée par des études antérieures. La consommation d’O2 spécifique à la masse par les mutants CASK qui sont plus petits et connus pour être moins actifs, n’était pas différente de celle des témoins congéniques. Cependant, la petite taille des mutants CASK a entraîné une réduction significative de la consommation d’O2 par mouche. Par conséquent, le microrespiromètre est capable de mesurer la consommation d’O2 chez D. melanogaster, de distinguer des différences modestes entre les génotypes et d’ajouter un outil polyvalent pour mesurer les taux métaboliques.

Les sorties de pression et de courant du contrôleur du respiromètre sont illustrées pour une chambre dans une expérience à la figure 3A. La première impulsion de courant long a pressurisé la chambre de la pression ambiante (environ 992 hPa) au seuil d’arrêt prédéfini de 1017 hPa. Au fur et à mesure que les mouches consommaient de l’O 2 et que le CO2 était absorbé, la pression diminuait lentement jusqu’à ce qu’elle atteigne le seuil ON de 1016 hPa, ce qui activait le cou...

La respirométrie coulométrique est idéale pour mesurer le taux métabolique des petits organismes. Lorsqu’elle a été adaptée pour Drosophila melanogaster dans la présente étude, la consommation d’O2 mesurée se situait dans la fourchette rapportée pour le type sauvage D. melanogaster par des études antérieures. La consommation d’O2 par mouche par les mutants CAS, qui sont plus petits et moins actifs, était significativement inférieure à celle du type sauvage.

Mesure de la consommation d’O2 chez Drosophila melanogaster à l’aide de la microrespirométrie coulométrique

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

Nos recherches portent sur l’effet de la température et de l’activité sur le métabolisme des insectes. C’est essentiel pour comprendre comment les espèces ont évolué pour survivre dans leur environnement, et comment elles continueront à s’adapter dans un monde en mutation. Comprendre la physiologie et le comportement des organismes individuels est crucial pour cette entreprise.Le taux métabolique peut être mesuré directement en mesurant la production de chaleur, ou indirectement en mesurant la consommation d’oxygène ou la production de dioxyde de carbone. Bien qu’il soit techniquement possible de mesurer la production de chaleur par un organisme aussi petit qu’une mouche des fruits, les méthodes indirectes sont plus couramment utilisées. Les défis actuels de la mesure du métabolisme à cette échelle comprendront le coût, la stabilité environnementale et la fiabilité.Les systèmes disponibles dans le commerce sont fiables, stables et relativement faciles à acheter, mais ils peuvent être complexes et coûteux. Les manomètres de bricolage sont peu coûteux, mais peuvent introduire des erreurs et nécessiter une fabrication pour chaque expérience. Le respiromètre coulométrique est relativement peu coûteux, facile à utiliser, permet une lecture pratique des paramètres environnementaux et tous les composants sont réutilisables.De plus, le remplacement régulier de l’oxygène maintient un environnement stable pendant des heures, voire des jours. En laboratoire, nous étudierons la variation métabolique entre les souches témoins établies de la drosophile et les effets des mutants hyperactifs et hypoactifs sur la consommation d’oxygène. Sur le terrain, nous commencerons à étudier les taux métaboliques et la tolérance à la température des coléoptères sauvages adaptés au désert.

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Mesure de la consommation d’O₂ chez Drosophila melanogaster à l’aide de la microrespirométrie coulométrique

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