Microscopie à expansion ultrastructurale en trois étapes du cycle de vie in vitro de Trypanosoma cruzi

Ce protocole détaille la méthode de microscopie à expansion d’ultrastructure dans trois stades du cycle de vie in vitro de Trypanosoma cruzi, l’agent pathogène responsable de la maladie de Chagas. Ce protocole offre une alternative aux techniques actuelles d’imagerie à super résolution et de microscopie électronique, avec l’avantage d’être compatible avec les microscopes conventionnels que l’on trouve dans la plupart des laboratoires de biologie et dans les installations centrales des machines. Il utilise des techniques communes à la plupart des laboratoires de recherche pour obtenir des images qui permettent une reconstruction tridimensionnelle.

Le protocole facilite l’étude de structures à l’échelle nanométrique chez les trypanosomatidés, permettant l’inspection d’une population de cellules et l’imagerie de l’ensemble du volume d’une cellule d’intérêt à haute résolution. Il est particulièrement utile pour les types de cellules spécifiques à la science dans les phases transitoires du cycle cellulaire et de la différenciation. Pour obtenir encore plus de résolution, nous utiliserons la combinaison d’ExM avec des techniques microscopiques à super résolution afin d’atteindre des résolutions inférieures à 20 nanomètres.

Commencez par préparer la suspension d’épimastigote de Trypanosoma cruzi à partir d’une culture en phase logarithmique dans un milieu LIT complété par 10 % de FCS. Centrifuger la suspension à 5 000 G pendant 10 minutes à température ambiante. Lavez le granulé deux fois avec du PBS, puis remettez-le en suspension dans 200 microlitres de PBS.

Collez la suspension sur une lamelle ronde de 12 millimètres recouverte de Poly-D-Lysine et incubez-la à température ambiante pendant 15 à 20 minutes avant de prévenir la réticulation. Prélever le surnageant d’une monocouche de cellules Vero infectée par les trypomastigotes quatre jours après l’infection. À l’aide d’une chambre de comptage de cellules de Neubauer, déterminez la concentration des trypomastigotes.

Centrifuger la suspension cellulaire à 7 000 G pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir rincé et remis en suspension les cellules dans du PBS, transférez la suspension cellulaire dans une lamelle enrobée de lysine et incubez la lamelle à température ambiante pendant 10 à 15 minutes avant la prévention de la réticulation. Pour obtenir des amastigotes à partir de cellules Vero infectées, posez une lamelle ronde stérile de 12 millimètres au fond d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits.

Ensuite, préparez une suspension de cellules Vero dans du DMEM complétée par 2 % de FCS, et semez 500 microlitres de la suspension dans chaque puits. Incuber la plaque pendant la nuit pour assurer la fixation de la cellule. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec 500 microlitres de PBS stérile.

Ajoutez les trypomastigotes de T. cruzi dans les cellules et incubez comme précédemment pendant six heures. Commencez par ajouter 0,5 millilitre de solution de prévention de la réticulation dans chaque puits d’une plaque de 24 puits. Ensuite, immergez les lamelles de 12 millimètres recouvertes de poly-D-Lysine avec des parasites adhérents.

Après avoir rempli les puits vides avec de l’eau pour réduire l’évaporation, scellez la plaque avec un film d’étanchéité et incuberez. Pour gélifier les échantillons, assemblez d’abord une chambre humide dans une boîte de Pétri en plaçant un film d’étanchéité sur du papier de soie. Ensuite, mouillez le papier de soie avec de l’eau et incubez à moins 20 degrés Celsius pendant 20 minutes pour le refroidir.

Posez la chambre fraîche et humide sur de la glace. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur de trois millilitres, aspirer la solution de prévention de la réticulation des puits de la plaque à 24 puits. Maintenant, utilisez une pince à épiler pour retirer les lamelles et placez-les sur le papier de soie avec les parasites vers le haut.

Prenez 90 microlitres de solution monomère dans un tube et ajoutez cinq microlitres chacun de TEMED et d’APS décongelés. Agitez le mélange pendant deux à trois secondes. Pipetez 35 microlitres de ce mélange sur le film d’étanchéité pour chaque lamelle, et utilisez immédiatement une pince à épiler pour placer les lamelles sur la goutte avec les parasites vers le bas.

Incuber la chambre humide sur de la glace pendant cinq minutes, puis à 37 degrés Celsius pendant une heure. Commencez par pipeter deux millilitres de solution de dénaturation dans chaque puits d’une plaque à six puits. Transférez les lamelles gélifiées contenant des parasites Trypanosoma cruzi dans la solution de dénaturation et incubez avec une agitation douce.

Pour favoriser le détachement du gel. À l’aide d’une spatule métallique, transférez soigneusement le gel dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant un millilitre de solution de dénaturation. Incuber le tube avec un capuchon fixé sur un bloc chauffant.

À l’aide d’une pipette P1000, aspirez la solution de dénaturation des tubes de microcentrifugation. À l’aide d’une spatule métallique, transférez le gel dans une boîte de Pétri contenant 10 millilitres d’eau ultrapure et laissez-le pendant 30 minutes. À l’aide d’une pipette Pasteur jetable de trois millilitres, remplacez l’eau ultrapure dans le plat, en laissant le gel immergé toute la nuit à température ambiante.

Le lendemain, mesurez le diamètre du gel avec un pied à coulisse pour calculer l’expansion. Les échantillons étaient visibles sous la forme d’un gel planaire et translucide qui s’est dilaté 4 à 4,5 fois dans l’eau. Commencez le marquage fluorescent en lavant les cercles de gel élargis contenant les parasites avec du PBS.

Utilisez une lame de rasoir pour couper les cercles au centre en carrés de 10 x 10 millimètres. Maintenant, transférez chaque carré dans une plaque à 12 puits et incubez-le dans 500 microlitres de l’anticorps primaire dilué dans 2 % de PBS et de BSA, en agitant. Ensuite, incubez les carrés de gel dans une plaque à six puits contenant deux millilitres de PBS avec 0,1 % de polysorbate 20 pendant 10 minutes, en agitant.

Après avoir transféré le gel dans une plaque à 12 puits, ajoutez 500 microlitres d’anticorps secondaires dans du PBS avec DAPI et 10 microgrammes par millilitre d’ester NHS conjugué au fluorophore souhaité. Incuber le gel pendant 2,5 heures à 37 degrés Celsius sous une légère agitation. Après avoir lavé le gel trois fois dans du polysorbate PBS 20 comme précédemment, transférez le gel dans une boîte de Pétri avec de l’eau ultra-pure et incubez pendant 30 minutes.

Placez un carré de 10 x 10 millimètres du morceau de gel expansé sur un plat inférieur de 35 millimètres. Vérifiez l’orientation des parasites à un grossissement de 10 ou 20X. Imagez les échantillons dans un microscope confocal avec un objectif à immersion dans l’huile 63X, avec une ouverture numérique de 1,4.

Acquérez les piles Z, la largeur de chaque pas Z et le temps d’exposition par pixel déterminé empiriquement, puis acquérez l’intensité du signal et l’optimisation des temps d’acquisition à l’aide du zoom de balayage pour un grossissement efficace, si vous le souhaitez. Ouvrez la pile Z à l’aide d’un logiciel de traitement d’image et regroupez les images empilées à l’aide de l’option de projet de groupe Z pour chaque canal. Ensuite, sélectionnez la projection d’intensité maximale.

Fusionnez des images à l’aide de l’outil Fusionner les canaux. Sélectionnez la couleur de chaque canal et ajoutez la barre d’échelle à l’aide de l’outil Barre d’échelle du logiciel de traitement. L’expansion primaire a fourni une résolution effective de 70 nanomètres, tandis que l’expansion secondaire a montré des facteurs d’expansion d’environ 4,5.

La coloration des trois étapes du cycle de vie in vitro de T. cruzi avec des marqueurs cytosquelettiques a montré la localisation du corset microtubulaire et de l’axonème flagellaire de la protéine. La condensation de la chromatine a été clairement distinguée lorsqu’elle a été colorée avec du DAPI. L’immunolocalisation des marqueurs de l’alpha-tubuline chevauchant le marquage pan-protéome chez les épimastigotes a montré que le corps basal coloré à l’anti-alpha-tubuline et au FITC s’était divisé.

Le marquage panprotéomique a permis d’identifier différentes structures parasitaires à tous les stades du cycle de vie.