Transplantation transsclérale guidée par voie transpupillaire de greffons sous-rétiniens dans un modèle murin de dégénérescence rétinienne

Ce protocole présente une approche trans-sclérale guidée par la vision transpupillaire pour administrer en toute sécurité et avec précision des greffons cellulaires sous-rétiniens, avec un faible taux de complications chirurgicales, chez des souris receveuses avec ou sans dégénérescence rétinienne.

L’objectif global de cette étude est de développer une plateforme de transplantation trans-sclérale avec guidage transpupillaire direct pour faciliter l’administration sous-rétinienne de cellules chez des souris receveuses. Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément au guide de l’Institut national de la santé. Notre déclaration sur l’utilisation des animaux et approuvée par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Johns Hopkins.

Les souris adoptantes EGFP âgées du 3e au 6e jour postnatal ont été utilisées comme donneuses de suspensions de cellules rétiniennes. Des souris OPN1LW-EGFP/NRL, âgées au jour postnatal 3 ont été adoptées comme donneuses de feuilles rétiniennes. Des souris adultes atteintes de dégénérescence rétinienne Rd1/NS présentant un déficit immunitaire ont été utilisées comme receveurs.

Euthanasier les souris donneuses ayant une surdose de dioxyde de carbone. Pour isoler les globes oculaires des souris, ouvrez soigneusement les paupières des chiots à l’aide d’un micro-ciseaux et exposez le globe oculaire. Enveloppez le nerf optique et retirez le globe oculaire avec une pince lisse.

Une fois les globes oculaires isolés, incisez un trou au centre de la cornée à l’aide d’une aiguille de calibre 25. Coupez la cornée en deux à travers le trou. Et agrandissez l’incision jusqu’à la sclérotique et l’EPR.

Retirez ensuite la sclérotique et l’EPR. Ensuite, utilisez une pince micro-dentée pour retirer délicatement le cristallin et le vitré pour isoler la rétine neurale. Pour recueillir la suspension rétinienne du donneur, incubez la rétine neurale dans une solution de papaïne à 37 degrés centigrades pendant 20 à 30 minutes jusqu’à ce qu’aucun amas cellulaire ne soit détectable.

Collectez les cellules individuelles en suivant les instructions du fabricant du kit Papaïne. Pour préparer la feuille rétinienne, placez la rétine isolée dans une boîte de Pétri avec du PBS. Ensuite, coupez délicatement la rétine neurale en plusieurs feuillets rétiniens avec un micro ciseaux.

Anesthésier les souris receveuses avec une injection intrapéritonéale de kétamine et de xylazine. Assurez-vous que le plan d’anesthésie atteint est le plan chirurgical où l’animal perd des réflexes de clignement des yeux et de douleur, mais la respiration et la respiration restent régulières. Évaluez la profondeur de l’anesthésie par pincement de la queue ou par les réflexes de retrait de la pédale.

Vérifiez à nouveau la profondeur de l’anesthésie pendant la procédure opératoire. Gardez les souris sur la table d’opération préchauffée pour éviter l’hypothermie. Dilater les pupilles du receveur avec des gouttes ophtalmiques de tropicamide cinq minutes avant la chirurgie.

Une pupille bien dilatée peut faciliter la visualisation transpupillaire au microscope opératoire. Mettez une goutte de chlorhydrate de proparacaïne sur l’œil de la souris pour l’analgésie. Désinfectez l’œil de la souris et les tissus oculaires environnants avec de l’iode.

Nettoyez ensuite l’œil avec du PBS stérile. Pénétrer dans le tunnel périphérique dans la chambre interne pour réduire la pression intraoculaire. Ensuite, mettez une goutte d’hyaluronate de sodium et une lamelle de verre sur le dessus de la cornée.

La visualisation transpupillaire du fond d’œil de la souris est maintenant disponible dans le cadre de la chirurgie d’observation. Exposez le locus d’injection en poussant le mur de l’œil vers le centre du visuel transpupillaire à l’aide d’une pince dentée. Ensuite, pénétrez partiellement dans la sclère avec une aiguille de micro-injection, face à 90 degrés par rapport au mur de l’œil.

Les vaisseaux rétiniens superficiels peuvent servir de référence anatomique pour localiser l’aiguille dans l’espace sous-rétinien. Injectez ensuite les greffons rétiniens. Les petites bulles préchargées dans la seringue peuvent faciliter la validation de l’emplacement sous-rétinien des cellules du donneur.

Si la cornée devient trouble, gardez l’aiguille dans l’espace sous-rétinien, jusqu’à ce que la cornée devienne transparente pour normaliser la pression intraoculaire. Saisissez le bord du trou d’injection et retirez rapidement l’aiguille. Le critère de réussite de l’administration de la suspension cellulaire est une tache constante dans l’espace sous-rétinien.

Une livraison réussie de la feuille de rétine, est convaincue par une feuille blanche visible. Gardez les souris transplantées dans une cage de récupération propre et préchauffée et surveillez-les attentivement pour détecter tout signe de détresse. Si cela se produit, mettez une goutte de chlorhydrate de proparacaïne topique sur l’œil chirurgical pendant deux, trois fois.

Ramenez les souris dans la cage de la maison une fois qu’elles sont complètement alertes et mobiles. Placez un petit nombre de granulés de nourriture dans le gobelet à gel sur le sol de la cage. Si les souris ont du mal à atteindre la trémie alimentaire.

Deux mois après la transplantation, une ophtalmoscopie confocale multimodale au laser à balayage a été réalisée pour vérifier l’état des greffons rétiniens observés vivo. La tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral a montré que les greffons rétiniens survivaient dans l’espace sous-rétinien et reconstituaient la couche nucléaire externe de toutes les souris receveuses. L’imagerie infrarouge n’a détecté aucune cataracte évidente chez toutes les souris transplantées.

D’autres complications chirurgicales, y compris l’hémorragie, ont été mal détectées chez les souris transplantées par imagerie par réflectance multicolore. La coloration histologique a montré une abondance de photorécepteurs coniques exprimant OPN1LW :EGFP et S-opsine dans les feuillets rétiniens transplantés. De même, la transplantation de suspensions de cellules rétiniennes a montré une grande proportion de photorécepteurs positifs récupérés in vivo, y compris de nombreux bâtonnets positifs EGFP matures.

Les souris non transplantées ont montré une dégénérescence sévère de la couche nucléaire externe avec des photorécepteurs à cône résiduel clairsemés exprimant la récupération. Cependant, aucun signal EGP n’a été détecté chez les souris non transplantées. Cette étude fournit une plate-forme chirurgicale trans-sclérale avec un guidage direct de la vision transpupillaire pour la transplantation sous-rétinienne chez des receveurs murins.

Cette plate-forme permet d’administrer avec précision des doses connues de cellules. Il est relativement facile d’apprendre et de faciliter l’administration sous-rétinienne en plus des injections intra-rétiniennes ou intravitréennes pour différents types d’agents thérapeutiques, y compris la thérapie génique.