Name: Purification de la chromatine du locus génique en copie unique chez Saccharomyces cerevisiae (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Apprenez à purifier la chromatine d'un locus génique en copie unique chez Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode permet l'étude des interactions protéine-ADN dans leur contexte natif sans réticulation.

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Les travaux du laboratoire S.H. ont été soutenus par la DFG par le biais de SFB1064 (ID de projet 213249687), le Conseil européen de la recherche (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) et la Helmholtz Gesellschaft.

Isolement de la chromatine spécifique du locus à partir de cellules de levure

<ol><li>Kornberg, R. D., Lorch, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-five+years+of+the+nucleosome%2C+fundamental+particle+of+the+eukaryote+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome.</a> Cell. 98 (3), 285-294 (1999).</li>
<li>Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+enrichment+of+specific+chromatin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and enrichment of specific chromatin loci.</a> Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).</li>
<li>Korthout, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+chromatin+proteome+of+a+single+genomic+locus+by+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing.</a> PLoS Biology. 16 (7), e2005542(2018).</li>
<li>Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+landscape+at+Drosophila+melanogaster+telomere-associated+sequence+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats.</a> Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).</li>
<li>Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins associated with specific genomic loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li>
<li>Ide, S., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-targeting+proteomics+of+isolated+chromatin+segments+of+a+mammalian+ribosomal+RNA+gene+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter.</a> Nature Communications. 6, 6674(2015).</li>
<li>Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+histone+acetylation+regulate+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26amp%3B+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (4), 430(2010).</li>
<li>Buxton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+protein-DNA+interactions+in+human+alphoid+chromatin+via+hybridization+capture+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).</li>
<li>Kennedy-Darling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+chromatin-associated+proteins+via+sequence-specific+capture+and+mass+spectrometric+protein+identification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).</li>
<li>Liu, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi-based+genome-scale+identification+of+functional+long+noncoding+RNA+loci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells.</a> Science. 355, 7111(2017).</li>
<li>Hamperl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+chromatin+domains+from+single-copy+gene+loci+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Analysis+of+DNA+and+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae.</a> Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).</li>
<li>Hamperl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+and+structural+analysis+of+selected+chromosomal+domains+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 2(2014).</li>
<li>Weiβ, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+locus+proteomics+of+early-+and+late-firing+DNA+replication+origins+identifies+a+role+of+Ask1%2FDASH+complex+in+replication+timing+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control.</a> Cell Reports. 42 (2), 112045(2023).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol">https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol</a> (2023).</li>
<li>Vermeulen, M., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-specific+chromatin+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Locus-specific chromatin isolation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

L’identification des facteurs et du paysage chromatin d’une région génomique cible spécifique continue de poser un défi majeur dans la recherche sur la chromatine18. Ce protocole décrit un système efficace pour exciser et purifier spécifiquement les domaines distincts de la chromatine des chromosomes de levure. À notre connaissance, la pureté et le rendement de cette purification en une seule étape permettent de surmonter de nombreuses limitations des méthodes de purification de la chromatine spéc...

L’organisation dynamique des génomes eucaryotes en chromatine compacte l’ADN pour qu’il s’adapte aux limites du noyau tout en assurant une dynamique suffisante pour l’expression des gènes et l’accessibilité pour les facteurs régulateurs. En partie, cette polyvalence est médiée par le nucléosome, l’unité de base de la chromatine, qui comprend une particule centrale avec 147 pb d’ADN enroulé ~ 1,7 fois autour de l’octamère de l’histone1. Le nucléosome est une structure très dynamique en ce qui concerne sa composition, avec de nombreuses variantes d’histones et des modifications post-traductionnelles (PTM) sur les queues d’histones N- et C-terminales. De plus, la chromatine eucaryote interagit avec une multitude d’autres composants essentiels, tels que les facteurs de transcription, les mécanismes de traitement de l’ADN et de l’ARN, les protéines architecturales, les enzymes impliquées dans le remodelage et la modification de la chromatine et les molécules d’ARN associées à la chromatine. Ces mécanismes cruciaux impliqués dans la transcription, la réplication et la réparation nécessitent tous un accès à la chromatine, qui sert de substrat naturel à ces processus. Par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à ces transactions d’ADN nécessite une définition précise des altérations collectives de la structure de la chromatine dans les régions génomiques spécifiques où ces mécanismes convergent et facilitent les réactions biologiques.
Malgré l’identification de nombreux facteurs de la chromatine par le biais d’études génétiques et d’études d’interaction protéine-protéine, la réalisation d’analyses directes, impartiales et complètes des interactions de la chromatine sur des sites génomiques particuliers est restée un obstacle important 2,3. Dans un premier temps, seules des régions très abondantes du génome (c’est-à-dire des loci répétitifs) ou des plasmides multi-copies ont pu être isolés en quantités et en pureté suffisantes pour permettre l’identification par spectrométrie de masse des protéines associées 4,5,6,7. Une série de nouvelles approches basées sur l’hybridation directe de sondes de capture à l’ADN chromatinisé, la biotinylation de proximité à l’aide du système CRISPR-dCas9 ou la liaison de protéines adaptatrices spécifiques à la séquence au locus d’intérêt ont commencé à démêler le protéome des loci à copie unique à partir de génomes de levures et de mammifères 8,9,10. Cependant, toutes ces méthodes nécessitent la réticulation du formaldéhyde pour stabiliser les interactions protéine-ADN et la sonication pour solubiliser la chromatine en vue d’une purification ultérieure. Ensemble, les deux manipulations excluent la possibilité d’études structurelles et fonctionnelles ultérieures de la chromatine purifiée.
Pour surmonter ces limitations, nous avons précédemment conçu une méthodologie qui utilise la recombinaison spécifique au site pour extraire les domaines chromosomiques ciblés de la levure11,12. Essentiellement, la région génomique d’intérêt est entourée de sites de reconnaissance (RS) pour la R-recombinase spécifique du site de Zygosaccharomyces rouxi tout en incorporant simultanément un groupe de trois sites de liaison à l’ADN pour la protéine répressive transcriptionnelle procaryote LexA (LexA) dans la même région. Les cellules de levure contiennent une cassette d’expression pour l’expression simultanée de la R-recombinase et une protéine LexA fusionnée à un marqueur de purification par affinité en tandem (TAP). Après l’induction de la R-recombinase, l’enzyme excise efficacement la région ciblée du chromosome sous la forme d’un domaine de chromatine circulaire. Ce domaine peut être purifié via la protéine adaptatrice LexA-TAP, qui se lie aux sites de liaison à l’ADN LexA, ainsi qu’à un support d’affinité. Cette méthode a été récemment utilisée pour isoler des domaines distincts de la chromatine contenant des origines de réplication sélectionnées du chromosome III13 de la levure.
L’un des avantages majeurs de cette approche ex vivo est qu’elle permet des analyses fonctionnelles du matériau isolé. Par exemple, les domaines d’origine de réplication purifiés avec cette méthode peuvent être soumis à des tests de réplication in vitro pour évaluer l’efficacité de la cuisson d’origine dans un tube à essai à partir de matrices de chromatine assemblées in vivo natives. À terme, la caractérisation biochimique et fonctionnelle du matériel isolé pourrait permettre la reconstitution des processus nucléaires à l’aide de protéines purifiées et de la matrice de chromatine native. En résumé, cette méthodologie ouvre une voie passionnante dans la recherche sur la chromatine, car il sera possible de suivre les changements collectifs de composition et de structure de la chromatine d’une région génomique spécifique subissant une certaine transaction chromosomique.

<table><tbody><tr><td><forte>Souches de levures</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fortes>Contrôler la souche :</forte> MATa ; ura3&Delta ; 0; leu2 et Delta ; 0; his3&Delta ; 1; met15 et Delta ; 0; bar1 ::kanMX4 ; Chr I 212kb ::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR</td><td></td><td></td><td>Section 1, voir références 13 et 14</td></tr><tr><td>Recombination Souche : MATa ; ura3&Delta ; 0; leu2 et Delta ; 0; his3&Delta ; 1; met15 et Delta ; 0; bar1 ::kanMX4 ; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS ; Chr I 212kb ::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR</td><td></td><td></td><td>Section 1, voir référence 13 et 14</td></tr><tr><td>Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K238 plasmide</td><td></td><td></td><td>Section 1, voir référence 13 Stockage : Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>K071 Spike-in plasmidique ADN</td><td></td><td></td><td>Section 7.1, voir référence 13 Stockage : Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Carl Roth</td><td>5025.1</td><td>Section 2 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Acétate d’ammonium (NH4Ac)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7262</td><td>Section 6 et 7.1 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Solution d’ammonium (NH4OH) 25 %</td><td>Merck Millipore</td><td>533003</td><td>Section 6 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Sulfate d’ammonium</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-29085</td><td>Section 2 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD (VWR)</td><td>90000-760</td><td>Section 3 Stockage : Stocker à température ambiante</td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD (VWR)</td><td>211820</td><td>Section 3 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>07604</td><td>Section 7.2 Stockage : Stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Kit de substrat chimiluminescent</td><td>ThermoFisher</td><td>34580</td><td>Section 7.2 Stockage : Stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Di-Sodium Hydrogénophosphate dodécahydraté</td><td>Merck</td><td>1.06579.1000</td><td>Section 2 et 7.1 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher</td><td>15508013</td><td>Section 4 Stockage : Stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Section 7.1 Stockage : Stocker à température ambiante</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED</td><td>Section 7.1 Stockage : Stocker à température ambiante</td></tr><tr><td>Galactose (stock à 20 % (p/v)</td><td>)Sigma Aldrich</td><td>G0625-1KG&nbsp ; /&nbsp ; 5KG</td><td>Section 3 Stockage : Stocker à température ambiante</td></tr><tr><td>Gel colorant de chargement (6x)</td><td>BioLabs</td><td>B7024A</td><td>Section 7.1 Stockage : Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Glusose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Section Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth.0079.4</td><td></td> <td>Section 2 Conservation : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Glycogène (5 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td>Section 7.1 Stockage : Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (HCl)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182109.1211</td><td>Section 2, 4 et 7.1 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Acétate de magnésium (MgAc)</td><td>Bernd Kraft</td><td>15274.2600/C035</td><td>Section 4 Stockage : Stocker à température ambiante</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>Section 6 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Tampon d’échantillon Nu PAGE LDS (4x)</td><td>Invitrogen</td><td>2399549</td><td>Section 7.2 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Phénol/Chloroforme/Alcool isoamylique (25:24:1 v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>Section 7.1 Stockage : Stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Section 4 Stockage : Stocker à température ambiante</td></tr><tr><td>Marqué radioactivement &alpha ;-32P dATP (3 000 Ci/mmol, 10 mCi/mL)</td><td>Hartmann Analytic</td><td>SRP-203</td><td>Section 7.1 Stockage : Stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Système d’étiquetage RadPrime</td><td>ThermoFisher</td><td>18428-011</td><td>Section 7.1 Stockage : Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Raffinose (20 % (p/v))</td><td>SERVA</td><td>34140.03</td><td>Section 3 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Merck</td><td>K53710504142</td><td>Section 7.1 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Citrate de sodium (Na3C6H5O7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71402</td><td>Section 7.1 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Section 7.1 Stockage : Stocker à température ambiante</td></tr><tr><td>N-dodécylsulfate de sodium (FDS) (5 % de stock (p/v))</td> <td>Alfa Aesar</td><td>A11183</td><td>Section 7.1 Stockage : Stocker à température ambiante</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71496</td><td>Section 2 et 7.1 Stockage : Stocker à température ambiante</td></tr><tr><td>Sodium&nbsp ; azide</td><td>Santa Cruz&nbsp ; Biotechnologie</td><td>sc-208393</td><td>Section 2 Stockage : Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>&nbsp ; Triéthylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90340</td><td>Section 2 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Tris base Chem</td><td>Cruz</td><td>SC-3715B</td><td>Section 2 et 4 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Section 2 et 4 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bernd Kraft</td><td>18014332</td><td>Section 4 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>BD (VWR)</td><td>212720</td><td>Section 3 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Facteur d’accouplement de levure alpha (1 &micro ; g/mL de stock )</td><td>&nbsp ; Biomol</td><td>Y2016.5</td><td>Section 3 Stockage : Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Levure Synthétique Drop-out medium Suppléments sans LEUCINE</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1376</td><td>Section 1, voir référence 14</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>R0105S</td><td>Section 7.1 Stockage : Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78446</td><td>Section 4 Stockage : Stocker à4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Protéinase K (10 mg/mL)</td><td>SERVA</td><td>33756</td><td>Section 7.1 Stockage : Conserver à -20 °C C</td></tr><tr><td>RNase A (10 mg/mL)</td><td>&nbsp ; ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td>Section 7.1 Stockage : Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>TEV protéase (10000 U/&micro ; L)</td><td>NEB</td><td>P8112S</td><td>Section 5 Stockage : Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BcMag Perles magnétiques activées par l’époxy</td><td>Bioclone Inc.</td><td>FC-102</td><td>Section 2 Stockage : Stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Glace</td><td></td><td></td> carbonique <td>Section 4</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger à faible liaison 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td>Section 4</td></tr><tr><td>Microspin&nbsp ; G-25 Colonnes</td><td>Cytiva</td><td>27-5325-01</td><td>Section 7.1 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td>Merck P7793</td><td>Section 4</td></tr><tr><td>Membrane positive en nylon</td><td>Biozol</td><td>11MEMP0001</td><td>Section 7.1 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Membrane de transfert PVDF</td><td>Immobilon-Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Section 7.2 Stockage : Conserver dans la chambre température</td></tr><tr><td>SDS-PAGE gel 4-12 % bis-tris (15 puits, 1,5 mm)</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp ; NP0336BOX</td><td>Section 7.2 Stockage : Stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Seringue (25 mL) avec raccord Luer</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4200-000V0</td><td>Section 3 Papier</td></tr><tr><td>Whatman (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet)</td><td>Cytiva</td><td>3030-917</td><td>Section 7.1 Stockage : Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td><anticorps forts></forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-LexA, IgG polyclonales de lapin, anticorps de la région de liaison à l’ADN</td><td>Merck Millipore</td><td>06-719</td><td>Section 7.2 Stockage : Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>IgG anti-lapin de chèvre (H+L), conjugué de peroxydase de raifort</td><td>Invitrogen</td><td>G21234</td><td>Section 7.2 Stockage : Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Peroxydase Anticorps anti-peroxydase (PAP) produit chez le lapin pour la détection des protéines marquées TAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1291-500UL</td><td>Section 7.2 Stockage : Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Anticorps IgG de lapin</td><td>Sigma</td><td>I5006-100MG</td><td>Section 2 Stockage : Stocker à 4 &deg ; </td></tr><tr><td>Apprêts C (10 & micro ; M)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARS316 : fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT</td><td></td><td></td><td>Section 7.1</td></tr><tr><td>K071 Spike-in plasmid DNA : fwd : 5'-TTTTCGCTGCTTGTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT</td><td></td><td></td><td>Section 7.1</td></tr><tr><td>Fragment < fort>PCR de l’ADN génomique de levure comme matrice pour l’amplification ARS316 (pour le transfert sud) : FWD 5'- AAATTCTGCCCTTGATTCGT&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; rev 5'- TTTGTTTATCTCATCACTAAT</td><td></td><td></td><td>Section 7.1</td></tr><tr><td>PDC1 : fwd 5'- CATGATCAGATGGGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT</td><td></td><td></td><td>Section 7.1</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moulin à café</td><td>Gastroback</td><td>42601</td><td>Section 4</td></tr><tr><td>Fiole de Dewar</td><td>NAL GENE</td><td>4150-2000</td><td>Section 3</td></tr><tr><td>DynaMag TM-2 Grille magnétique</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Section 4, 5 et 6</td></tr><tr><td>Four d’hybridation</td><td>Hybaid Mini10</td><td>Ri418</td><td>Section 2</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>Section 4 et 7.1</td></tr><tr><td>Réticulant UV</td><td>Analytikjena</td><td>95-0174-02</td><td>Section 7.1</td></tr></tbody></table>

purification de la chromatine du locus génique en copie unique chez saccharomyces cerevisiae

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

L’unité organisationnelle de base de la chromatine eucaryote est la particule centrale du nucléosome (NCP), qui comprend l’ADN enroulé ~ 1,7 fois autour d’un octamère d’histone. La chromatine est définie comme l’entité des NCP et de nombreux autres complexes protéiques, y compris les facteurs de transcription, le remodelage de la chromatine et les enzymes modificatrices. On ne sait toujours pas comment ces interactions protéine-ADN sont orchestrées au niveau de loci génomiques spécifiques au cours des différentes étapes du cycle cellulaire. Cela est principalement dû aux limitations techniques actuelles, qui rendent difficile l’obtention de mesures précises de telles interactions dynamiques. Nous décrivons ici une méthode améliorée combinant une recombinaison spécifique au site avec un protocole efficace de purification par affinité en une seule étape pour isoler un locus de gène d’intérêt en une seule copie dans son état natif de chromatine. La méthode permet l’enrichissement robuste du locus cible sur la chromatine génomique, ce qui fait de cette technique une stratégie efficace pour identifier et quantifier les interactions protéiques de manière non biaisée et systématique, par exemple par spectrométrie de masse. À la suite de ces analyses de composition, la chromatine native purifiée par cette méthode reflète probablement la situation in vivo concernant le positionnement des nucléosomes et les modifications des histones et se prête donc à d’autres analyses structurales et biochimiques de la chromatine dérivée de pratiquement n’importe quel locus génomique chez la levure.

La purification du domaine chromatin ARS316 de ~1,4 kb a été médiée par la protéine adaptatrice LexA-TAP exprimée de manière constitutive. Pour servir de contrôle négatif, nous avons effectué des purifications à l’aide d’une souche isogénique qui exprime LexA-TAP mais ne contient pas de sites intégrés de liaison RS et LexA. La figure 3 illustre le résultat de l’analyse de l’ADN d’une expérience de purification standard réalisée à la fois sur la souche témoin et sur une souche compétente en r...

Ce protocole présente une méthode d’isolement de la chromatine spécifique au locus basée sur la recombinaison spécifique au site pour purifier un locus de gène d’intérêt en une seule copie dans son contexte chromatin natif à partir d’une levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae.

Purification de la chromatine du locus génique en copie unique chez Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

Un noyau eucaryote est très encombré avec de nombreux processus biologiques se produisant simultanément. L’objectif de nos recherches est de comprendre comment tous ces processus sont coordonnés sur nos génomes sans accidents majeurs qui conduiraient autrement à l’instabilité génomique et aux maladies humaines. Ce protocole nous permet de purifier un locus spécifique du génome à l’état natif, permettant à la fois la caractérisation compositionnelle et fonctionnelle du matériel isolé, comme la mesure des interactions protéine-ADN.Ce protocole permet un énorme niveau d’enrichissement d’un locus ciblé, ce qui permet de surmonter de nombreuses limitations actuelles de l’isolement de la chromatine spécifique au locus. Le matériau n’a pas été réticulé. Cela permet également de nombreuses analyses fonctionnelles en aval, telles que la transcription in vitro ou la réplication in vitro.Ce protocole nous a permis d’exciser et de purifier des origines de réplication distinctes à partir de chromosomes de levure, ce qui nous a permis d’effectuer une analyse protéomique et d’identifier de nouveaux facteurs de chromatine interagissant avec l’origine, et donc de faire progresser le domaine de recherche de la réplication de l’ADN. Ce protocole permet des études de réplication in vitro utilisant le matériau d’origine purifié pour examiner les états de la chromatine, les modifications des histones et effectuer une analyse structurelle sur les matrices nucléosomales natives des chromosomes endogènes, faisant ainsi progresser la recherche sur la chromatine.

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JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Cet article présente une méthode sensible appelée Circle-Seq pour purifier l’ADN circulaire extrachromosomique (eccDNA). La méthode comprend la purification en colonne, l’élimination de l’ADN chromosomique linéaire restant, l’amplification en cercle roulant et le séquençage à haut débit. Circle-Seq est applicable au criblage à l’échelle du génome de l’ADNcc eucaryote et à l’étude de l’instabilité du génome et de la variation du nombre de copies.

Purification de l&#39;ensemble du génome de l&#39;ADN extrachromosomique circulaire à partir de cellules eucaryotes

Nous décrivons le clivage endogène de la chromatine couplé au séquençage à haut débit (ChEC-seq), une méthode orthogonale à l'immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) pour cartographier les sites de liaison des protéines à l'échelle du génome avec des protéines de fusion à la nucléase micrococcie (MNase).

Cartographie génomique des interactions protéine-ADN avec ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Nous décrivons ici un protocole pour l’immunoprécipitation de la chromatine des histones modifiées de la levure Saccharomyces cerevisiae. ADN immunoprécipitée est ensuite utilisé pour la PCR quantitative pour interroger l’abondance et la localisation des modifications post-traductionnelles des histones dans tout le génome.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des Modifications d’Histone de Saccharomyces cerevisiae

Le système CRISPR/Cas12a, combiné à un seul réseau de crRNA, permet une édition multiplexe efficace du génome de S. cerevisiae à plusieurs loci simultanément. Ceci est démontré par la construction de caroténoïdes produisant des souches de levure qui sont ensuite utilisés pour créer de l'art pixel levure.

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art CRISPR

Voici un protocole pour identifier les interactions génétiques grâce à un écran suppresseur de nombre de copie accru dans Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode permet aux chercheurs d’identifier, cloner et tester les suppresseurs chez les mutants de levure de courte durée. Nous testons l’effet de l’augmentation du nombre de copie de SIR2 sur la durée de vie dans un mutant null autophagie.

Un écran suppresseur pour la caractérisation des liens génétiques régulant la durée de vie chronologique dans Saccharomyces cerevisiae

Ce travail décrit un protocole pour un dépistage génétique suppresseur multicopie chez Schizosaccharomyces pombe. Ce criblage utilise une bibliothèque plasmidique pangénomique pour identifier le(s) clone(s) suppresseur(s) d’un phénotype de perte de fonction associé à une souche mutante de requête. De nouveaux suppresseurs génétiques du mutant nul ell1 ont été identifiés à l’aide de ce criblage.

Dépistage génétique pour l’identification des suppresseurs multicopies chez Schizosaccharomyces pombe

Ce manuscrit décrit comment dépister les thermostabilizing mutations, purifier le transporteur de la sérotonine humaine, générer des anticorps de haute affinité, et cristalliser le complexe transporteur-anticorps sérotonine lié à l'antidépresseur drogue S -citalopram. Ce protocole peut être adapté à l'étude d'autres transporteurs membranaires complexes, des récepteurs et des canaux.

Thermostabilisation, Expression, purification et cristallisation du Serotonin Human Transporter Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

Ici, nous présentons une méthode pour exprimer et purifier S100A12 (calgranuline C). Nous décrivons un protocole pour mesurer son activité antimicrobienne contre le pathogène humain H. pylori .

Expression, purification et activité antimicrobienne de S100A12

Un nouveau protocole pour la préparation de la chromatine du muscle squelettique de souris adultes adapté à l’étude de la régulation génique dans les fibres musculaires par immunoprécipitation de la chromatine est présenté.

Protocole amélioré pour l’immunoprécipitation de la chromatine du Muscle squelettique de souris

Nous présentons ici une nouvelle méthode permettant de déterminer les affinités de liaison à l’équilibre et en solution avec la sensibilité élevée sur une grande échelle. Cela permet d’améliorer l’analyse quantitative de liaison ADN-facteur de transcription. La méthode repose sur des mesures d’anisotropie fluorescence automatisé dans un système de livraison contrôlé.

Haute sensibilité mesure des affinités de liaison de l’ADN-facteur de Transcription par titrage concurrentiel à l’aide de la microscopie en Fluorescence

Apprenez à purifier la chromatine d'un locus génique en copie unique chez Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode permet l'étude des interactions protéine-ADN dans leur contexte natif sans réticulation.

Purification de la chromatine du locus génique en copie unique chez Saccharomyces cerevisiae

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