Méthodes d’électroporation et de confirmation de transformation chez Limosilactobacillus reuteri DSM20016
23 juin 2023
Ici, nous présentons des protocoles pour travailler avec Limosilactobacillus reuteri DSM20016, détaillant la croissance, la transformation plasmidique, la PCR de colonie, la mesure de protéines rapporteures fluorescentes et la mini-préparation plasmidique limitée, ainsi que les problèmes courants et le dépannage. Ces protocoles permettent la mesure des protéines rapporteures dans DSM20016, ou la confirmation par PCR de colonie si aucun rapporteur n’est impliqué.
L.Reuteri, et en particulier la souche, DSM20016 est un commensal intestinal humain robuste et naturel, très prometteur pour l’administration thérapeutique et la détection des maladies dans tout le tractus gastro-intestinal. Ce travail aidera à positionner DSM20016 en tant que châssis de biologie synthétique pour ce type d’applications. Les lactobacillales n’ont pas d’organisme modèle spécifique.
Les espèces préférées existent, mais elles sont généralement choisies avec un parti pris pour des objectifs de recherche particuliers. La variation au sein de la famille bactérienne a conduit à des protocoles fragmentés, certains avec des itérations de modifications remontant à travers les publications. Il est très difficile pour les personnes qui débutent de filtrer exactement ce qui est utile et ce qui ne l’est pas.
Un document pour la transformation de DSM20016 existe, mais il n’est pas moderne. Des protocoles modernes pour d’autres membres de la famille Lactobacillales existent, mais ils ne sont pas DSM20016. Ici, nous nous efforçons de fournir un ensemble complet de protocoles faciles à utiliser, centralisés, modernisés et complets pour l’électroporation DSM20016.
Cet ensemble de protocoles offre une modernisation substantielle par rapport au protocole d’exploration DSM20016 précédent, et élucide certains fils suspendus, tout en mettant l’accent sur des parties qui étaient auparavant moins claires. L’ensemble de protocoles est également complet, et spécifiquement pour DSM20016, une souche pour laquelle d’autres protocoles non DSM20016 ne sont pas totalement compatibles. L’un de nos principaux objectifs est d’utiliser les microbes comme capteurs et systèmes de livraison peu coûteux.
Nous travaillons avec des experts en maladies intestinales pour utiliser DSM20016 pour détecter les conditions dans le tractus gastro-intestinal et administrer des traitements au besoin.
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Aperçu
Cet article présente des protocoles pour travailler avec Limosilactobacillus reuteri DSM20016, un commensal intestinal humain robuste. Les protocoles incluent la croissance, la transformation plasmidique, la PCR sur colonie et la mesure des protéines rapporteures fluorescentes.
Composants clés de l'étude
Domaine de la science
- Microbiologie
- Biologie synthétique
- Santé gastro-intestinale
Contexte
- Limosilactobacillus reuteri DSM20016 est un commensal intestinal humain naturel.
- Cette souche montre des promesses pour la livraison thérapeutique et la détection de maladies.
- Les protocoles dans ce domaine sont souvent fragmentés et difficiles à naviguer.
- Les objectifs de recherche peuvent influencer le choix de l'espèce bactérienne.
Objectif de l'étude
- Fournir des protocoles clairs pour travailler avec DSM20016.
- Faciliter la mesure des protéines rapporteures et la confirmation par PCR sur colonie.
- Traiter les problèmes courants et le dépannage dans les protocoles.
Méthodes utilisées
- Croissance de Limosilactobacillus reuteri DSM20016.
- Techniques de transformation plasmidique.
- PCR sur colonie pour confirmer les modifications génétiques.
- Mesure des protéines rapporteures fluorescentes.
Résultats principaux
- Des protocoles de croissance et de transformation réussis ont été établis.
- La PCR sur colonie a confirmé la présence des constructions génétiques souhaitées.
- Les protéines rapporteures fluorescentes ont été mesurées efficacement.
- Des directives de dépannage ont été fournies pour les problèmes courants.
Conclusions
- Les protocoles améliorent l'utilisabilité de DSM20016 dans la recherche.
- Ils fournissent une base pour les futures applications en biologie synthétique.
- Des conseils clairs aident les chercheurs à naviguer dans la littérature fragmentée.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Centralized, strain-specific electroporation and transformation confirmation protocols for Limosilactobacillus reuteri DSM20016 address a critical gap in synthetic biology chassis development for gut-targeted applications. Standardized workflows reduce ambiguity and enable reproducible engineering of commensal microbes for therapeutic delivery and disease sensing. This positions DSM20016 as a reliable platform for early-stage biopharma R&D targeting gastrointestinal health.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust genetic manipulation of DSM20016 for functional target interrogation.
- Supports biological de-risking by clarifying transformation feasibility in a key commensal strain.
- Facilitates predictive confidence in strain selection for synthetic biology pipelines.
Screening & Assay Development
- Provides validated protocols for preparing DSM20016 as a screening-ready chassis.
- Standardizes transformation and reporter measurement for reproducible assay outputs.
- Enables reliable evaluation of engineered constructs in a disease-relevant system.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered DSM20016 with translational goals for gut-targeted therapeutic delivery.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in gastrointestinal models.
- Reduces risk in advancing engineered commensals toward translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
These protocols integrate at the interface of early discovery and assay development, enabling streamlined progression from genetic engineering to functional screening in DSM20016.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway engineering in a commensal chassis.
- Screening: Delivers reproducible transformation and quantitative reporter readouts for downstream workflows.
- Analytics: Enables measurement of transformation efficiency and reporter expression for comparative analysis.
- Translational Research: Provides a foundation for preclinical evaluation of engineered strains in gut-relevant contexts.
- Enterprise Reuse: Establishes DSM20016 as a reusable, standardized platform for synthetic biology R&D.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in commensal engineering.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable protocols for strain manipulation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in early-stage gut microbiome programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of engineered microbial therapeutics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial genetics and electroporation techniques.
- Needs access to electroporation equipment and plate reader instrumentation.
- Demands cross-team standardization for protocol adoption and troubleshooting.
- May require adaptation for other Lactobacillales strains due to genotypic variation.
- Protocol compatibility is specific to DSM20016 and may not generalize to other strains.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:04
Preparing Limosilactobacillus reuteri DSM20016 Electrocompetent Cells for Electroporation
5:27
Measurement of the Acid‐Resistant Fluorescent Reporter Protein mCherry2
7:03
Confirmation of Plasmid Uptake via Colony PCR
8:45
Mini‐Prep Protocol for Limosilactobacillus reuteri and Confirmation of Plasmid Presence by PCR
