Méthodes d’électroporation et de confirmation de transformation chez Limosilactobacillus reuteri DSM20016
23 juin 2023
Ici, nous présentons des protocoles pour travailler avec Limosilactobacillus reuteri DSM20016, détaillant la croissance, la transformation plasmidique, la PCR de colonie, la mesure de protéines rapporteures fluorescentes et la mini-préparation plasmidique limitée, ainsi que les problèmes courants et le dépannage. Ces protocoles permettent la mesure des protéines rapporteures dans DSM20016, ou la confirmation par PCR de colonie si aucun rapporteur n’est impliqué.
L.Reuteri, et en particulier la souche, DSM20016 est un commensal intestinal humain robuste et naturel, très prometteur pour l’administration thérapeutique et la détection des maladies dans tout le tractus gastro-intestinal. Ce travail aidera à positionner DSM20016 en tant que châssis de biologie synthétique pour ce type d’applications. Les lactobacillales n’ont pas d’organisme modèle spécifique.
Les espèces préférées existent, mais elles sont généralement choisies avec un parti pris pour des objectifs de recherche particuliers. La variation au sein de la famille bactérienne a conduit à des protocoles fragmentés, certains avec des itérations de modifications remontant à travers les publications. Il est très difficile pour les personnes qui débutent de filtrer exactement ce qui est utile et ce qui ne l’est pas.
Un document pour la transformation de DSM20016 existe, mais il n’est pas moderne. Des protocoles modernes pour d’autres membres de la famille Lactobacillales existent, mais ils ne sont pas DSM20016. Ici, nous nous efforçons de fournir un ensemble complet de protocoles faciles à utiliser, centralisés, modernisés et complets pour l’électroporation DSM20016.
Cet ensemble de protocoles offre une modernisation substantielle par rapport au protocole d’exploration DSM20016 précédent, et élucide certains fils suspendus, tout en mettant l’accent sur des parties qui étaient auparavant moins claires. L’ensemble de protocoles est également complet, et spécifiquement pour DSM20016, une souche pour laquelle d’autres protocoles non DSM20016 ne sont pas totalement compatibles. L’un de nos principaux objectifs est d’utiliser les microbes comme capteurs et systèmes de livraison peu coûteux.
Nous travaillons avec des experts en maladies intestinales pour utiliser DSM20016 pour détecter les conditions dans le tractus gastro-intestinal et administrer des traitements au besoin.
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Aperçu
Cet article présente des protocoles pour travailler avec Limosilactobacillus reuteri DSM20016, un commensal résistant du tube digestif humain. Les protocoles comprennent la culture, la transformation par plasmide, la PCR sur colonies et la mesure de protéines rapporteuses fluorescentes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microbiologie
- Biologie synthétique
- Santé gastro-intestinale
Contexte
- Limosilactobacillus reuteri DSM20016 est un commensal naturel du tube digestif humain.
- Cette souche présente un potentiel prometteur pour la délivrance thérapeutique et la détection de maladies.
- Les protocoles dans ce domaine sont souvent fragmentés et difficiles à suivre.
- Les objectifs de recherche peuvent influencer le choix de l'espèce bactérienne.
Objectif de l'étude
- Fournir des protocoles clairs pour travailler avec DSM20016.
- Faciliter la mesure des protéines rapporteuses et la confirmation par PCR sur colonies.
- Aborder les problèmes courants et le dépannage dans les protocoles.
Méthodes utilisées
- Culture de Limosilactobacillus reuteri DSM20016.
- Techniques de transformation de plasmide.
- PCR sur colonies pour confirmation des modifications génétiques.
- Mesure des protéines rapporteuses fluorescentes.
Résultats principaux
- Des protocoles efficaces de culture et de transformation ont été établis.
- La PCR sur colonies a confirmé la présence des constructions génétiques souhaitées.
- Les protéines rapporteuses fluorescentes ont été mesurées efficacement.
- Des directives de dépannage ont été fournies pour les problèmes courants.
Conclusions
- Les protocoles améliorent l'utilisabilité de DSM20016 dans la recherche.
- Ils fournissent une base pour de futures applications en biologie synthétique.
- Des directives claires aident les chercheurs à s'y retrouver dans une littérature fragmentée.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Des protocoles centralisés et spécifiques à la souche pour l'électroporation et la confirmation de la transformation de Limosilactobacillus reuteri DSM20016 comblent un manque critique dans le développement de souches chassis en biologie synthétique destinées à des applications ciblant le tube digestif. Des flux de travail normalisés réduisent l'ambiguïté et permettent une ingénierie reproductible de micro-organismes commensaux pour la délivrance de thérapeutiques et la détection de maladies. Cela positionne DSM20016 comme une plateforme fiable pour la recherche et le développement en biopharmacie à un stade précoce, ciblant la santé gastro-intestinale.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet une manipulation génétique robuste de DSM20016 pour l'interrogation fonctionnelle de cibles.
- Prend en charge la réduction des risques biologiques en clarifiant la faisabilité de la transformation dans une souche commensale clé.
- Facilite une prédiction fiable du choix de souche dans les pipelines de biologie synthétique.
Développement de tests et criblage
- Fournit des protocoles validés pour la préparation de DSM20016 en tant que châssis prêt à l'analyse.
- Standardise la transformation et la mesure des capteurs afin d'obtenir des résultats d'analyse reproductibles.
- Permet une évaluation fiable de constructions ingénieries dans un système pertinent pour la maladie.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne DSM20016 génétiquement modifiée avec les objectifs translationnels de délivrance thérapeutique ciblant le tube digestif.
- Assure la continuité du stade de découverte à la validation préclinique dans des modèles gastro-intestinaux.
- Réduit les risques liés à la progression des bactéries commensales modifiées vers des études translationnelles.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ces protocoles s'intègrent à l'interface entre la découverte précoce et le développement de tests, permettant une progression optimisée du génie génétique au criblage fonctionnel chez DSM20016.
- Découverte en biologie : Soutient les tests d'hypothèses et l'ingénierie de voies métaboliques dans un chassis commensal.
- Criblage : Permet une transformation reproductible et des lectures quantitatives de capteurs pour les flux de travail en aval.
- Analytique : Permet de mesurer l'efficacité de la transformation et l'expression des capteurs pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Fournit une base pour l'évaluation préclinique de souches modifiées dans des contextes pertinents pour l'intestin.
- Réutilisation en entreprise : Établit DSM20016 comme une plateforme réutilisable et standardisée pour la recherche et le développement en biologie synthétique.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique en ingénierie des commensaux.
- Valeur opérationnelle : Fournit des protocoles standardisés, reproductibles et évolutifs pour la manipulation des souches.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go) et l'efficacité du capital dans les programmes précoces sur le microbiote intestinal.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des thérapeutiques microbiennes ingénierisées.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en génétique microbienne et en techniques d'électroporation.
- Suppose l'accès à un équipement d'électroporation et à un lecteur de plaques.
- Exige une standardisation inter-équipes pour l'adoption du protocole et la résolution des problèmes.
- Pourrait nécessiter des adaptations pour d'autres souches de Lactobacillales en raison de variations génotypiques.
- La compatibilité du protocole est spécifique à la souche DSM20016 et pourrait ne pas s'étendre à d'autres souches.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:04
Preparing Limosilactobacillus reuteri DSM20016 Electrocompetent Cells for Electroporation
5:27
Measurement of the Acid‐Resistant Fluorescent Reporter Protein mCherry2
7:03
Confirmation of Plasmid Uptake via Colony PCR
8:45
Mini‐Prep Protocol for Limosilactobacillus reuteri and Confirmation of Plasmid Presence by PCR
