Name: Criblage de médicaments cellulaires pour les inhibiteurs de la cystéine 4B peptidase liée à l’autophagie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Découvrez un criblage cellulaire haut débit basé sur la luciférase pour identifier des inhibiteurs de la cystéine peptidase ATG4B liée à l'autophagie. Cette méthode permet de développer de nouvelles thérapies contre le cancer et les maladies neurodégénératives.

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Ce travail a été soutenu par le financement de base du Conseil de la recherche médicale du Royaume-Uni pour la subvention d’unité universitaire MRC-UCL Ref MC_U12266B, la subvention de la plateforme de démence MRC UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (référence de subvention 2018RIF_15) et le programme de soutien à l’accélération thérapeutique de l’UCL, soutenu par le financement de MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Le plasmide codant pour l’ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) a été obtenu auprès du Dr Robin Ketteler (Département de médecine humaine, Faculté de médecine de Berlin).

Analyse de dépistage à haut débit pour l’inhibiteur de l’autophagie de la cystéine peptidase 4B

<ol><li>Kocaturk, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+molecular+target+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a molecular target for cancer treatment.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ATG4+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Targeting ATG4 in cancer therapy.</a> Cancers. 11 (5), 649(2019).</li>
<li>Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of autophagy.</a> EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).</li>
<li>Agrotis, A., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+ATG4B+as+drug+target+for+treatment+of+solid+tumours-the+knowns+and+the+unknowns%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns.</a> Cells. 9 (1), 53(2019).</li>
<li>Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting autophagy in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).</li>
<li>Kimmelman, A. C., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+tumor+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Autophagy and tumor metabolism.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).</li>
<li>Tran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+role+of+ATG4B+as+target+for+autophagy+inhibition+in+prostate+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).</li>
<li>Pengo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+kinases+and+phosphatases+that+regulate+ATG4B+activity+by+siRNA+and+small+molecule+screening+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148(2018).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delipidation+of+mammalian+Atg8-family+proteins+by+each+of+the+four+ATG4+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases.</a> Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).</li>
<li>Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8L%2FApg8L+is+the+fourth+mammalian+modifier+of+mammalian+Atg8+conjugation+mediated+by+human+Atg4B%2C+Atg7+and+Atg3%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3.</a> The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).</li>
<li>Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+of+human+ATG4+protease+isoforms+in+autophagy+and+LC3%2FGABARAP+processing+revealed+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells.</a> Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).</li>
<li>Nguyen, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+family+LC3%2FGABARAP+proteins+are+crucial+for+autophagosome-lysosome+fusion+but+not+autophagosome+formation+during+PINK1%2FParkin+mitophagy+and+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).</li>
<li>Ketteler, R., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG4%3A+More+than+a+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATG4: More than a protease.</a> Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).</li>
<li>Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+roles+of+Atg4+proteases+from+autophagy+modulation+to+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy.</a> Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).</li>
<li>Fernández, ÁF., López-Otín, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+and+pathologic+relevance+of+autophagy+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The functional and pathologic relevance of autophagy proteases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).</li>
<li>Maruyama, T., Noda, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-regulating+protease+Atg4%3A+structure%2C+function%2C+regulation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition.</a> The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).</li>
<li>Ketteler, R., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+autophagy+by+luciferase+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Quantitation of autophagy by luciferase release assay.</a> Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).</li>
<li>Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+sensor+for+genome-wide+screens+of+intracellular+proteolytic+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage.</a> Genome Biology. 9 (4), 64(2008).</li>
<li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15, 14(2014).</li>
<li>Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+transgene+expression+in+primitive+hematopoietic+progenitor+cells+and+embryonic+stem+cells+efficiently+transduced+by+optimized+retroviral+hybrid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors.</a> Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Ce protocole décrit un test de gène rapporteur basé sur des cellules pour l’identification d’inhibiteurs de l’ATG4B. L’identification des hits primaires est basée sur l’activité de la luciférase lors du traitement des cellules exprimant le cadre de lecture ouvert sur toute la longueur de la LC3B entre la β-actine et le dNGLUC. Certains avantages de ce test sont qu’il est sensible, hautement quantitatif et non invasif, car il peut détecter le dNGLUC sans lyser les cellules. Cet article présente un protocole détaillé pour ...

L’autophagie est un processus métabolique conservé qui permet aux cellules de maintenir l’homéostasie intracellulaire et de répondre au stress en dégradant le contenu cellulaire vieilli, défectueux ou inutile via les lysosomes 1,2,3. Dans certaines conditions physiopathologiques, ce processus agit comme une réponse cellulaire cruciale à la privation de nutriments et d’oxygène, ce qui se traduit par le recyclage des nutriments et des lipides, permettant aux cellules de s’adapter à leurs besoins métaboliques 2,3,4. L’autophagie a également été identifiée comme une réponse cellulaire au stress liée à plusieurs maladies, telles que les troubles neurodégénératifs, les infections pathogènes et divers types de cancer. La fonction de l’autophagie dans le cancer est complexe et dépend du type, du stade et de l’état de la tumeur. Il peut supprimer la tumorigenèse par dégradation autophagique des cellules endommagées, mais peut également favoriser la survie des tumeurs avancées en améliorant la survie des cellules dans des conditions stressantes, telles que l’hypoxie, la privation de nutriments et les dommages cytotoxiques 2,4,5,6.
Plusieurs études ont montré que l’inhibition de l’autophagie offre un avantage en tant que stratégie anticancéreuse. Ainsi, l’inhibition d’étapes critiques, telles que la formation de l’autophagosome ou sa fusion avec le lysosome, pourrait être une méthode efficace pour le contrôle du cancer 2,4,5,6. De plus en plus de preuves ont montré que l’ATG4B est impliqué dans certaines conditions pathologiques, et il a attiré l’attention en tant que cible anticancéreuse potentielle 2,3,4. Par exemple, il a été observé que les cellules cancéreuses colorectales et les cellules cancéreuses du sein positives pour le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2) avaient des niveaux d’expression d’ATG4B significativement plus élevés que les cellules normales adjacentes 2,4. Dans les cellules cancéreuses de la prostate, l’inhibition de l’ATG4B a entraîné une susceptibilité spécifique de la lignée cellulaire à la chimiothérapie et à la radiothérapie7. Récemment, des preuves solides ont émergé que l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est particulièrement vulnérable à l’inhibition de l’ATG4B. Par exemple, dans un modèle murin génétiquement modifié, il a été démontré que la perte intermittente de la fonction ATG4B réduit la croissance tumorale de la PDAC et augmente la survie 3,4. Dans l’ensemble, l’ATG4B est fortement surexprimé dans certains types de cancer, est lié à la progression de la tumeur et est lié à la résistance au traitement anticancéreux 2,4,8.
Les protéases de cystéine ATG4 chez les mammifères ont quatre membres de la famille, ATG4A-ATG4D. Ces protéines présentent une certaine sélectivité vis-à-vis de la famille des protéines LC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 et peuvent avoir des fonctions supplémentaires non liées à leur activité protéase12,13. De plus, l’ATG4 fonctionne dans la régulation d’un nouveau type de modification post-traductionnelle, l’ATG8-ylation des protéines11,12. Alors que l’ATG4B et son substrat principal LC3B sont les plus étudiés, une image émerge qui suggère un rôle complexe pour chaque membre de la sous-famille dans la régulation des processus autophagiques et non autophagiques. Ceci est en outre corroboré par un réseau complexe de modifications post-traductionnelles qui régulent l’activité de l’ATG4B via la phosphorylation, l’acétylation, la glycosylation et la nitrosylation 9,10,11,12,13.
Plusieurs inhibiteurs connus de l’ATG4B ont été publiés 2,4,14,15. Bien qu’ils conviennent comme outils de recherche, leur profil pharmacodynamique, leur sélectivité ou leur puissance les ont encore empêchés de se développer en tant que candidats précliniques 4,16. Dans l’ensemble, il est urgent d’identifier des composés plus puissants et plus sélectifs. Souvent, les composés sont de bons inhibiteurs biochimiques de la fonction des protéines, mais leur efficacité dans les tests cellulaires est médiocre. Il existe plusieurs tests pour surveiller l’activité de l’ATG4B, y compris des méthodes biochimiques et des tests cellulaires4. Nous avons précédemment développé un test simple, basé sur la luminescence et à haut débit, pour surveiller l’activité de l’ATG4B dans les cellules 8,17. Ce test utilise une protéine luciférase de Gaussia princeps (GLUC) qui est stable et active dans le milieu extracellulaire et peut être libérée de manière inductive par les cellules en réponse à l’activité protéolytique ATG4B18,19.
Dans cette construction rapporteure, dNGLUC est lié au cytosquelette d’actine des cellules. Un agent de liaison spécifique de la protéase peut être introduit entre l’ancre β-actine et le dNGLUC, ce qui rend la sécrétion dépendante du clivage du liant. Nous avons utilisé le cadre de lecture ouvert sur toute la longueur de la LC3B entre la β-actine et le dNGLUC, afin de pouvoir surveiller le clivage de la LC3B17,18,19. Bien que le mécanisme de sécrétion de dNGLUC soit mal compris, il est spécifique pour le suivi de l’activité de l’ATG4B, ne dépend pas de l’autophagie globale telle qu’elle se produit dans les cellules knock-out de l’ATG5, et est médié par des mécanismes non conventionnels qui ne nécessitent pas de peptide signal classique 4,18,19. Nous avons utilisé avec succès ce rapporteur pour cribler de petites molécules et des banques de siRNA, et avons identifié de nouveaux régulateurs de l’activité de l’ATG4B, tels que les protéines kinasesAkt 8. Cet article décrit un protocole détaillé pour l’utilisation de ce rapporteur de luciférase dans un format de criblage semi-automatisé à haut débit.

<table><tbody><tr><td>50 et micro ; L Embouts jetables - Non filtré, Pur, Imbriqué 8 Stack (Passive Stack)</td><td>Tecan</td><td>30038609</td><td>Disposable 96-tip</td></tr> rack <tr><td>BioTek MultiFlo</td><td>BioTek</td><td></td><td>Distributeur en vrac</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-205904</td><td>substrat</td></tr><tr><td>Columbus Logiciel d’analyse d’images</td><td>Perkin Elmer</td><td>Version 2.9.1</td><td>Logiciel d’analyse d’images</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Microplaque en polypropylène 384 puits qualifiée Echo, transparente, non stérile</td><td>Beckman Coulter</td><td>001-14555</td><td>Plaque 384PP</td></tr><tr><td>EnVision II</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>lecteur de plaque</td></tr><tr><td>de luminescence Express pick Bibliothèque (96-well)-L3600-Z369949-100&micro ; L</td><td>Selleckchem</td><td>L3600</td><td>Selleckchem</td></tr><tr><td>FMK9A</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-100522</td><td></td></tr><tr><td>Greiner FLUOTRAC 200 384 plaques à 384 puits</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781076</td><td>solide-noir Plaques à 384 puits</td></tr><tr><td>Harmony Logiciel d’imagerie</td><td>Perkin Elmer</td><td>Version 5.1</td><td>Logiciel d’imagerie</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trichlorhydrate, Trihydrate - 10 mg/mL Solution dans l’eau</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>Labcyte Echo 550 series avec logiciel Echo Cherry Pick</td><td>Labcyte/Beckman Coulter</td><td></td><td>Distributeur de liquide acoustique à l’échelle nanométrique Eau</td></tr><tr><td>déminéralisée</td>à<td>l’eau</td><td></td><td></td> Milli-Q</tr><tr><td>Opera Phenix Système de dépistage à haut contenu Microscope</td><td>automatisé</td><td>Perkin Elmer</td><td></td></tr><tr><td>Solution de paraformaldéhyde 4 % dans PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate 384-well, noir, optiquement clair, fond plat, traité par culture tissulaire, couvercles</td><td>Perkin Elmer</td><td>6057300</td><td>CellCarrier-384 Ultra PN</td></tr><tr><td>pMOWS-ActinLC3dNGLUC</td><td></td><td></td><td>Obtenu du Dr Robin Ketteler (Département de médecine humaine, Faculté de médecine de Berlin)Réactif d’infection</td></tr><tr><td>/transfection en polybrène</td><td>Merck</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorhydrate de puromycine, 98 %, Thermo Scientific Chemicals</td><td>ThermoFisher</td><td>J61278.ME</td><td>Puromycin</td></tr><tr><td>Tecan Freedom EVO 200 robot</td><td>Tecan</td><td></td><td>plateforme robotique de manipulation de liquide</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA Réactif de transfection d’ADN Roche</td><td></td><td>Merck 6366244001</td> réactif de <td>transfection d’ADN</td></tr></tbody></table>

criblage de médicaments cellulaires pour les inhibiteurs de la cystéine 4b peptidase liée à l’autophagie

Cell-Based Drug Screening for Inhibitors of Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase

De plus en plus de preuves ont montré qu’un flux autophagique élevé est lié à la progression tumorale et à la résistance au traitement anticancéreux. Le dosage des protéines d’autophagie individuelles est une condition préalable aux stratégies thérapeutiques ciblant cette voie. Il a été démontré que l’inhibition de la protéase de l’autophagie ATG4B augmente la survie globale, ce qui suggère que l’ATG4B pourrait être une cible médicamenteuse potentielle pour le traitement du cancer. Notre laboratoire a mis au point un test sélectif à base de luciférase pour le suivi de l’activité de l’ATG4B dans les cellules. Pour ce test, le substrat d’ATG4B, LC3B, est marqué à l’extrémité C avec une luciférase sécrétée du copépode marin Gaussia princeps (GLUC). Ce rapporteur est lié au cytosquelette d’actine, le maintenant ainsi dans le cytoplasme des cellules lorsqu’il n’est pas clivé. Le clivage médié par l’ATG4B entraîne la libération de GLUC par sécrétion non conventionnelle, qui peut ensuite être surveillée en récoltant des surnageants de culture cellulaire en tant que corrélat de l’activité cellulaire de l’ATG4B. Cet article présente l’adaptation de ce test à base de luciférase au criblage automatisé à haut débit. Nous décrivons le flux de travail et l’optimisation pour une analyse exemplaire à haut débit de l’activité cellulaire ATG4B.

Dans une publication précédente8, nous avons utilisé avec succès ce test pour cribler de petites molécules et des banques de siRNA et identifié de nouveaux régulateurs de l’ATG4B. Nous décrivons ici le protocole et les résultats représentatifs de ce rapporteur de luciférase dans un format de criblage semi-automatisé à haut débit. La figure 8 montre un exemple d’analyse des données brutes pour les noyaux cellulaires et la luminescence. Un résultat typique d’une mesure ...

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’utilisation d’un test rapporteur à base de luciférase dans un format de criblage semi-automatisé à haut débit.

Criblage de médicaments cellulaires pour les inhibiteurs de la cystéine 4B peptidase liée à l’autophagie

Growing evidence has shown that high autophagic flux is related to tumor progression and cancer therapy resistance. Assaying individual autophagy proteins ...

L’objectif principal de la recherche dans mon laboratoire est de comprendre la régulation de l’autophagie et en particulier de la cystéine protéiforme ATG4 et d’utiliser ces connaissances pour développer de petites molécules inhibitrices qui ciblent cette voie en particulier pour des maladies telles que le cancer du pancréas. Nous utilisons des technologies de criblage à haut contenu et à haut débit pour identifier des cibles médicamenteuses ainsi que des candidats-médicaments et nous nous concentrons sur la famille des protéases de cystéine ATG4 car nous pensons qu’il s’agit d’une très bonne cible médicamenteuse pour diverses formes de cancer. Nous étudions les membres de la famille ATG4 depuis un certain temps maintenant.Nous avons fait des découvertes importantes sur le dysfonctionnement de cette famille de protéines et de cellules. Nous avons également identifié de nouveaux mécanismes post-traductionnels de régulation des membres de la famille ATG4 et nous développons actuellement de petites molécules inhibitrices et également des activateurs de la famille ATG4 pour des maladies telles que le cancer et la neurodégénérescence. Il n’y a pas beaucoup de tests pour surveiller l’activité de la protéase ATG4 dans les cellules.Nous avons donc été l’un des premiers à développer un test basé sur la luciférase pour surveiller cette activité. Et notre test est assez inhabituel parce qu’il utilise des mots sécrétés, disons, donc nous n’avons pas besoin d’obtenir de licence pour les cellules et nous pouvons facilement adapter ce protocole aux méthodes de criblage à haut débit et à l’automatisation du laboratoire. Nous nous concentrons sur la protéase de la protéine ATG4 B depuis un certain temps déjà.Nous avons généré des lignées cellulaires knock-out des membres de la famille ATG4. Nous avons identifié de nouveaux mécanismes de régulation post-traductionnelle de l’ATG4 et, en fin de compte, nous avons également identifié plusieurs nouveaux composés de petites molécules qui pourraient inhiber et même activer la protéase ATG4 B. À l’avenir, nous aimerions continuer à travailler sur les membres de la famille ATG4.Nous pensons qu’il y a beaucoup de choses qui sont actuellement inconnues et qui restent encore à découvrir. Par exemple, la façon dont ces protéines régulent l’autophagie dans les neurones n’est actuellement pas du tout comprise. Nous aimerions également concentrer nos travaux sur la validation de ces composés à petites molécules que nous avons identifiés et potentiellement sur l’utilisation d’activateurs dans les maladies neurodégénératives.

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L'autophagie est un processus omniprésents qui permet aux cellules de se dégradent et recyclent des protéines et des organites. Nous appliquons la microscopie par fluorescence de pointe pour visualiser et quantifier les petits, mais les changements essentiels, physiques associés à l'induction de l'autophagie, y compris la formation et la distribution de autophagosomes et des lysosomes, et leur fusion dans autolysosomes.

Analyse quantitative de l&#39;autophagie en utilisant avancée Fluorescence Microscopy 3D

Pour contrer la diffusion de l'agent pathogène, les cellules hôtes réorganisent leur cytosquelette de compartimenter les bactéries et d'induire l'autophagie. Utilisation de shigellose des cellules de culture de tissu, hôte et les déterminants de pathogènes sous-jacents de ce processus sont identifiés et caractérisés. En utilisant des modèles de poisson zèbre de shigellose, le rôle des molécules et des mécanismes découverts sont étudiés in vivo.

Utilisation d&#39;<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Pour étudier les interactions de l&#39;autophagie cytosquelette

Ici, la cytométrie de flux d'imagerie multispectrale avec une caractéristique analytique qui compare les images détaillées lumineuses de 3 marqueurs d'autophagie et qui quantifie leur co-localisation, ainsi que le comptage de points LC3, a été utilisée pour mesurer l'autophagie d'une manière objective, quantitative et statistiquement robuste.

Évaluation du flux autophagique en mesurant LC3, p62 et LAMP1 Co-localisation à l&#39;aide de la cytométrie de flux d&#39;imagerie multispectrale

Présentées ici sont deux techniques de recherche d’interaction protéine-protéine de base d’anticorps : immunofluorescence et immunoprécipitation. Ces techniques ne conviennent pas pour l’étude des interactions physiques entre les protéines pour la découverte de nouvelles composantes des voies de signalisation cellulaires et pour comprendre la dynamique de protéine.<br...

Étude des Interactions protéine-protéine dans la recherche de l’autophagie

Mitophagy, le processus de compensation endommagée mitochondries, est nécessaire au maintien de l’homéostasie et de la santé mitochondriale. Cet article présente certaines de la mitophagy dernière méthodes de détection dans les cellules humaines, Caenorhabditis eleganset la souris.

In Vitro et In Vivo la détection des Mitophagy dans les cellules humaines, C. Eleganset la souris

Un protocole simple et bien validé pour mesurer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères est décrit ici. La méthode est basée sur la quantification de la proportion de la lactate déshydrogénase (LDH) dans les fractions de cellules sédimentables par rapport aux niveaux LDH cellulaires totales.

Le test de fixation du Lactate déshydrogénase — Une méthode Simple et fiable pour déterminer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères

Cet article utilise un écoulement cytometry-test aux bibliothèques d’écran d’inhibiteurs chimiques pour l’identification des inhibiteurs et leurs objectifs qui influent sur la signalisation de récepteur de T-cellule. Les méthodes décrites ici peuvent aussi être étendues pour des projections de haut débit.

Identification des médiateurs du récepteur des cellules T signalisation via la projection des bibliothèques inhibiteur chimique

Un protocole détaillé pour la génération de microarrays de protéines humaines auto-assemblés pour le dépistage des inhibiteurs de la kinase est présenté.

Dépistage de l'inhibiteur de kinase dans les microréseaux de protéines humaines auto-assemblés

Dans cette étude, nous présentons des stratégies inhibitrices et siRNA-basées pour interférer avec le flux autophagique dans le virus simplex d'herpès type-1 (HSV-1)--infecté des cellules monocyte-dérivées de monocyte-dérivées.

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells SiRNA Electroporation to Modulate Autophagie in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

L’objectif de ce protocole est de déterminer les niveaux autophagiques dans le cancer du pancréas et les cellules acineuses pancréatiques par immunofluorescence CL3 et quantification des points CL3.

Évaluation des niveaux d’autophagie dans deux modèles de cellules pancréatiques différents à l’aide de l’immunofluorescence LC3

Découvrez un criblage cellulaire haut débit basé sur la luciférase pour identifier des inhibiteurs de la cystéine peptidase ATG4B liée à l'autophagie. Cette méthode permet de développer de nouvelles thérapies contre le cancer et les maladies neurodégénératives.

Criblage de médicaments cellulaires pour les inhibiteurs de la cystéine 4B peptidase liée à l’autophagie

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