Name: Analyse de flux à double rapporteur à base de billes fluorescentes magnétiques du blocage de l’interaction-1/-L1 par les anticorps induits par le vaccin PDL1-VAXX (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Découvrez une analyse de flux à double rapporteur utilisant des billes fluorescentes magnétiques pour évaluer le blocage de l'interaction PD-1/PD-L1 par les anticorps induits par le vaccin PDL1-Vaxx. Cette méthode permet de quantifier précisément l'activité neutralisante des anticorps antitumoraux.

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Les auteurs remercient Sherry Dunbar, Ph.D., MBA de Luminex Corporation (Austin, TX) pour son soutien à la recherche, et Matthew Silverman, Ph.D., Biomedical Publishing Solutions (Panama City, FL ; mattsilver@yahoo.com) pour son aide scientifique et rédactionnelle. Ce travail a été soutenu par des prix décernés à Pravin T. P. Kaumaya par les National Institutes of Health (R21 CA13508 et R01 CA84356) et à Imugene Ltd, Sydney, Australie (OSU 900600, GR110567 et GR124326).

Analyse de flux du blocage de l’anticorps PDL1-Vaxx à l’aide de billes fluorescentes magnétiques

<ol><li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+epitope+peptide+cancer+vaccines%3A+a+new+paradigm+for+combination+immunotherapies+with+novel+checkpoint+peptide+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine.</a> Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).</li>
<li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revolutionization+in+cancer+therapeutics+via+targeting+major+immune+checkpoints+PD-1%2C+PD-L1+and+CTLA-4%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4.</a> Pharmaceuticals. 15 (3), 335(2022).</li>
<li>Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+studies+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+peptide+cancer+vaccine+PD1-Vaxx+from+BALB%2Fc+mice+to+beagle+dogs+and+to+non-human+primates+%28cynomolgus+monkeys%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys).</a> Frontiers in Oncology. 12, 826566(2022).</li>
<li>Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab%3A+Targeting+PD-1+to+bolster+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity.</a> Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).</li>
<li>Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+review+on+the+Anti-PD-L1+antibody+atezolizumab%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).</li>
<li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-related+adverse+events+associated+with+immune+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li>
<li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paradigm+shift%3A+Cancer+therapy+with+peptide-based+B-cell+epitopes+and+peptide+immunotherapeutics+targeting+multiple+solid+tumor+types%3A+Emerging+concepts+and+validation+of+combination+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).</li>
<li>Guo, L., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+prototype+checkpoint+inhibitor+B-cell+epitope+vaccine+%28PD1-Vaxx%29+en+route+to+human+Phase+1+clinical+trial+in+Australia+and+USA%3A+Exploiting+future+novel+synergistic+vaccine+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations.</a> British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).</li>
<li>Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+mammary+tumors+with+a+chimeric+HER-2+B-cell+epitope+peptide+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine.</a> Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).</li>
<li>Dakappagari, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+HER-2%2Fneu+B-cell+epitope+peptide+vaccine+designed+to+incorporate+two+native+disulfide+bonds+enhances+tumor+cell+binding+and+antitumor+activities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).</li>
<li>Kaumaya, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+active+immunotherapy+with+combination+of+two+chimeric%2C+human+epidermal+growth+factor+receptor+2%2C+B-cell+epitopes+fused+to+a+promiscuous+Tcell+epitope+in+patients+with+metastatic+and%2For+recurrent+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).</li>
<li>Bekaii-Saab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+immunotherapy+trial+with+two+chimeric+HER-2+B-cell+peptide+vaccines+emulsified+in+montanide+ISA+720VG+and+Nor-MDP+adjuvant+in+patients+with+advanced+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).</li>
<li>Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+and+antitumor+efficacy+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+vaccine+%28PD1-Vaxx%29+and+combination+immunotherapy+with+dual+trastuzumab%2Fpertuzumab-like+HER-2+B-cell+epitope+vaccines+%28B-Vaxx%29+in+a+syngeneic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1818437(2020).</li>
<li>Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+newly+discovered+PD-L1+B_cell+epitope+peptide+vaccine+%28PDL1-Vaxx%29+exhibits+potent+immune+responses+and+effective+anti-tumor+immunity+in+multiple+syngeneic+mice+models+and+%28synergizes%29+in+combination+with+a+dual+HER-2+B-cell+vaccine+%28B-Vaxx%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx).</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2127691(2022).</li>
<li>Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. Luminex Corporation. The xMAP® Cookbook, 5th edition. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F">https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F</a> (2022).</li>
<li>MagPlex® Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview">https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview</a> (2014).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting%22">Estimation of cell number by hemocytometry counting</a>. 2019 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).</li>
<li>Gibbs, J., Vessels, M., Rothenberg, M. Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf</a> (2019).</li>
</ol>

Pravin T.P. Kaumaya est consultant auprès d’Imugene, Ltd.

L’objectif de l’immunothérapie anticancéreuse liée aux points de contrôle est de perturber l’interaction entre les protéines des points de contrôle et leurs ligands importants dans la survie et la progression des tumeurs2. Ce groupe de recherche développe activement de nouveaux vaccins-1 et-L1 qui suscitent une réponse anticorps qui cible et interrompt le point de contrôle-1/-L1 3,8,13,14. Auparavant, deux variantes de tests immuno-enzymatiques (ELISA) ont été réalisées pour évaluer les effets des anticorps anti-PDL1-peptide sur l’inhibition de l’interaction recombinante PD1/-L114. (1) Dans le premier variant, rhPD-L1 a été enrobé sur une plaque de microtitration, puis la plaque a été incubée avec des anticorps dilués induits par le candidat vaccin anti-PDL1. L’inhibition de l’interaction-1/-L1 recombinante par les anticorps a ensuite été évaluée en ajoutant du rhPD-1 biotinylé et en quantifiant la liaison au rhPD-L1 immobilisé à l’aide d’un conjugué streptavidine-peroxydase de raifort et d’un substrat colorimétrique. C’est ce que nous avons défini comme le test de blocus direct. (2) Dans la deuxième variante, le-1 a été recouvert sur la plaque de microtitration. La rhPD-L1 biotinylée a été pré-incubée avec chacun des anticorps polyclonaux induits par le candidat anti-PLD1 dans des tubes de réaction séparés. Les mélanges rhPDL1/anti-PDL1 ont ensuite été ajoutés aux puits de plaques contenant du rhPD-1 immobilisé et laissés réagir. Tout rhPDL1 qui a réagi avec le rhPD-1 immobilisé en présence d’anticorps potentiellement bloquants induits par PDL1-Vaxx a été détecté lors de l’incubation ultérieure de la streptavidine-HRP et du substrat colorimétrique. C’est ce que nous avons défini comme le test de blocage inverse.
Le blocage inverse de l’interaction-1/-L1 recombinante par des anticorps anti-PDL1-peptide a montré une inhibition du signal (c’est-à-dire un blocage-1/-L1) d’une manière dépendante de la concentration d’anticorps14, tandis que l’approche de blocage direct n’a pas fourni de résultats cohérents (non illustré). Le test de blocage à double rapporteur à base de billes a été développé pour vérifier les résultats ELISA et pour étudier le blocage de l’interaction-1/-L1 dans une phase fluide, ce qui élimine les problèmes potentiels d’entrave stérique / disponibilité des épitopes de liaison associés à l’immobilisation des protéines recombinantes au fond des puits. L’analyse de la microsphère a été directement corrélée aux résultats du blocage ELISA à l’aide du test de blocage inverse (Figure 2). De plus, les immunoessais basés sur la fluorescence peuvent fournir une meilleure sensibilité du test et une plage dynamique élargie par rapport aux tests ELISA colorimétriques18, et de plus, le test à base de billes multiplexées permet la performance simultanée de deux immunoessais indépendants au sein d’une seule réaction. Le sulfo-NHS et l’EDC utilisés pour le couplage covalent des microsphères à rhPD-1 pourraient avoir conduit aux différences de performance observées entre les tests de blocage direct et de blocage inversé et aux différences de sensibilité observées entre les tests ELISA et les tests d’interaction-1/-L1 recombinants à base de billes Luminex. D’autres recherches aux niveaux chimique et moléculaire sont nécessaires pour étudier les mécanismes possibles responsables de ces différences.
Les tests ELISA14 et les tests à base de billes démontrent que les anticorps anti-PDL1 induits par PDL1-Vaxx peuvent inhiber la formation de complexes de points de contrôle PD1/-L1. Le PDL1-Vaxx à base de peptides induit avec succès des anticorps anti-PDL1 qui peuvent bloquer l’interaction-1/-L1. Cette approche pourrait constituer une nouvelle stratégie thérapeutique pour le traitement du cancer, comme le soutiennent les études précliniques chez l’animal 3,13,14. Les essais cliniques prévus détermineront l’efficacité du PDL1-Vaxx pour l’immunothérapie par point de contrôle et le contrôle de la maladie chez les patients atteints de cancer.

Dans les lymphocytes T, les lymphocytes B et les points de contrôle intracellulaires du système immunitaire, des voies de signalisation régulent les activités immunitaires. Certaines cellules cancéreuses se protègent des attaques immunitaires en stimulant des cibles de points de contrôle, ce qui inhibe la fonction immunitaire et favorise la survie et la prolifération néoplasiques. L’immunothérapie oncologique par inhibition des points de contrôle utilise des anticorps pour cibler et bloquer les points de contrôle de signalisation et, ainsi, restaurer les fonctions antinéoplasiques du système immunitaire 1,2,3. Les traitements anticancéreux les plus efficaces comprennent actuellement les anticorps monoclonaux nivolumab, qui cible la protéine de mort programmée 1 (-1)4, et l’atezolizumab, qui cible le ligand de mort programmée 1 (-L1)5. Cette approche s’est avérée très efficace dans le traitement des patients atteints de cancer. Cependant, l’utilité clinique des stratégies actuelles d’inhibition des points de contrôle est atténuée par les effets indésirables et la résistance au traitement, en particulier dans le traitement monogénique6. Une combinaison d’immunothérapie et de stratégies thérapeutiques plus efficaces avec une toxicité plus faible est nécessaire de toute urgence dans le traitement du cancer 1,3,6.
Au cours des 30 dernières années, le laboratoire du Dr Kaumaya a mis au point des vaccins contre le cancer peptidiques et des agents similaires aux peptides pour le traitement du cancer, dont certains font l’objet d’essais cliniques en cours 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . Par exemple, B-Vaxx avec l’immunothérapie combinée HER-2 a montré des avantages pour les patients contre les tumeurs solides métastatiques et/ou récurrentes dans les essais cliniques12. Les derniers vaccins anticancéreux du laboratoire sont PD1-Vaxx 2,13 et PDL1-Vaxx14, qui ont montré de grands avantages dans les études précliniques, en particulier dans le traitement combiné. Le PD1-Vaxx a terminé des essais cliniques d’escalade de dose aux États-Unis et en Australie. Le PD1-Vaxx sera associé à l’atezolizumab dans le cadre de l’essai de phase 1b qui débutera en mai 2023. Ce rapport se concentre sur l’évaluation de la capacité des anticorps induits par PDL1-Vaxx à bloquer l’interaction-1/-L1.
Le vaccin contre le cancer PDL1-Vaxx est un nouveau vaccin à épitopes peptidiques à cellules B avec les acides aminés-L1 130-147 liés au peptide de fusion du virus de la rougeole (MVF) à cellules T de promiscuité via un liant peptidique GPSL. Des études précliniques ont montré que PDL1-Vaxx est hautement immunogène pour stimuler la production d’anticorps anticancéreux dans divers modèles animaux, prolonger la survie et réduire la charge tumorale14. Ces anticorps générés contre le peptide-L1 peuvent bloquer avec succès l’interaction PD1/-L1, entraînant ainsi une activité anti-néoplasique. Ce rapport présente un test qui analyse le blocage de la formation du complexe PD1/-L1 par les anticorps induits par PDL1-Vaxx à l’aide d’un format à base de billes magnétiques avec une lecture à double rapporteur sur un instrument de cytométrie en flux.

<table><tbody><tr><td><Tampons > forts</></td><td></td><td></td><td></td> forts</tr> <tr><td>: 0,1 M NaH2PO4, pH 6,2</td><td>Millipore/Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de dosage/lavage : PBS-TBN (1x PBS, pH 7,4 + 0,1 % BSA + 0,05 % (v/v) Tween-20 ; 0,05 % NaN3)</td><td>Millipore/Sigma</td><td>P3563 (PBS+Tween20), A7888 (albumine sérique bovine), S8032 (azoture de sodium)</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de couplage : 50 mM d’acide 2-morpholinoéthanesulfonique (MES), pH 5,0</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>Agents de couplage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]chlorhydrate de carbodiimide (EDC)</td><td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>77149</td><td></td></tr><tr><td>xMAP Kit de couplage d’anticorps (si désiré), comprend :</td><td>Luminex Corp.&nbsp ; (Austin, Texas)</td><td>40-50016</td><td></td></tr><tr><td>EDC, 10 mg&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>solution sNHS, 250 & micro ; </td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>Tampon d’activation/couplage : 0,1 M Acide 2-morpholinoéthanesulfonique (MES), pH 6,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lavage : 1x PBS, pH 7,4 + 0,1 % BSA + 0,05 % (v/v) Tween-20 ; 0,05 % NaN3 (PBS-TBN)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td><td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentation and Ancillary Lab Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>xMAP INTELLIFLEX (instrument à double rapporteur)</td><td>Luminex Corp.&nbsp ; (Austin, Texas)</td><td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à fond rond à 96 puits à faible liaison aux protéines</td><td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>07-200-761</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur de plaques magnétiques Luminex (ou comparable)&nbsp ;</td><td>Luminex Corp.&nbsp ; (Austin, Texas)</td><td>CN-0269-01</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur de tubes magnétiques Luminex (ou comparable)</td><td>Luminex Corp.&nbsp ; (Austin, Texas)</td><td>CN-0288-01</td><td></td></tr><tr><td>Microsphères MagPlex (magnétiques, fluorescentes, 6,5-& micro ; m)</td><td>Luminex Corp.&nbsp ; (Austin, Texas)</td><td>MC-1**** (varie selon l’étiquette de la bille)</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuger Protein LoBind</td><td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Peptides, Antibodies, & Réactifs de détection </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atezolizumab (anticorps monoclonal humanisé anti-PDL1 IgG1), contrôle positif</td><td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td><td>n/a (médicaments sur ordonnance)</td>PDL1 humain recombinant biotinylé&<td></td></tr><tr><td>nbsp ;</td><td>Sino Biologique (Wayne, Pennsylvanie)</td><td>10084-H49H-B</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG</td><td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td><td>709-675-149</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG</td><td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td><td>711-675-152</td><td></td></tr><tr><td>-1 humain recombinant (marqué par la polyhistidine)</td><td>Acro Biosystems (Newark, DE)</td><td>PD1-H5256&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>R-phycoérythrine conjuguée à la streptavidine (SAPE)</td><td>Agilent (Santa Clara, CA)</td><td>PJRS34-1</td><td></td></tr><tr><td>Trastuzumab (Herceptin, anticorps monoclonal anti-HER2 humanisé), contrôle négatif</td><td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td><td>n/a (médicaments sur ordonnance)</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de flux à double rapporteur à base de billes fluorescentes magnétiques du blocage de l’interaction-1/-l1 par les anticorps induits par le vaccin pdl1-vaxx

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction

L’inhibition des récepteurs de point de contrôle (-1,-L1 et CTLA-4) avec des anticorps monoclonaux s’est avérée très bénéfique dans les essais cliniques pour le traitement des patients atteints de cancer et est devenue une approche de base dans l’immunothérapie moderne du cancer. Cependant, seul un sous-ensemble de patients répond à l’immunothérapie par anticorps monoclonaux de point de contrôle. Il est donc urgent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer. Un nouveau vaccin contre le cancer à épitope peptidique des cellules B PDL1 (ligand de mort programmée 1) a été développé, avec les acides aminés 130-147 liés au peptide MVF (protéine de fusion du virus de la rougeole à cellules T de promiscuité) via un linker GPSL. Des tests précliniques ont indiqué que ce vaccin PDL1 (PDL1-Vaxx) stimule efficacement les anticorps hautement immunogènes chez les animaux. Les animaux immunisés avec PDL1-Vaxx présentent une charge tumorale réduite et des taux de survie prolongés dans divers modèles de cancer animal. Les mécanismes d’action indiquent que les anticorps induits par le vaccin inhibent la prolifération des cellules tumorales, induisent l’apoptose et bloquent l’interaction-1/-L1. Ce manuscrit présente un test à base de billes magnétiques qui utilise un système d’analyse de flux à double rapporteur pour évaluer l’interaction-1/-L1 et son blocage par les anticorps anti-PDL1 élevés contre le PDL1-Vaxx.

Le test a permis de quantifier avec précision l’inhibition de l’interaction-1/-L1 par quatre anticorps polyclonaux uniques, générés contre les peptides vaccinaux rhPD-L1, qui sont explorés en tant qu’agents thérapeutiques potentiels contre le cancer. Le schéma de ce test est fourni à la figure 1. La quantité de rhPD-L1 biotinylée qui s’est liée aux billes conjuguées de rhPD-1 et l’inhibition de cette liaison par les quatre candidats anticorps induits par PLD1-Vaxx ont été mesurées dans le canal Reporter 1 à l’aide d’un réactif de détection de streptavidine-PE qui se lie directement à rhPD-L1 (Figure 2).
Les quatre anticorps polyclonaux anti-PDL1-peptide ont bloqué l’interaction rhPD-L1 avec-1 qui avait été immobilisée sur des microsphères à des degrés variables. Le pourcentage d’inhibition des différents anticorps peptidiques anti-PDL1 variait de 48 % à 74 % à la concentration maximale testée de 1 000 μg/mL. L’anticorps monoclonal témoin positif, l’atezolizumab, a permis d’obtenir un blocage de 92 % de l’interaction-1/-L1 à la concentration maximale testéede 14 μg/mL (Figure 2). Tous les anticorps expérimentaux PDL1-Vaxx ont montré une inhibition dépendante de la concentration de la liaison de rhPD-L1 aux billes conjuguées rhPD-1 par rapport au trastuzumab, l’anticorps témoin négatif qui ne devrait pas interagir avec le système-1/-L1.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig02.jpg"> Figure 2 : Blocage de l’interaction de rhPD-L1 avec rhPD-1 couplé à des billes magnétiques par des anticorps anti-PDL1-peptide, comme le montre un nouveau test immunologique à base de billes fluorescentes. La-1 humaine recombinante a été couplée à des microsphères magnétiques, et les billes ont ensuite été incubées avec du rhPD-L1 biotinylé qui avait été pré-incubé avec différents anticorps anti-PDL1-peptide. Un réactif de détection de la streptavidine-phycoérythrine a été utilisé pour se lier à la biotine et, ainsi, évaluer la quantité relative de rhPD-L1 disponible pour se lier à-1. Les anticorps polyclonaux élevés chez le lapin contre les vaccins peptidiques PDL1 (anti-PDL1[36], anti-PDL1[50], anti-PDL1[95] et anti-PDL1[130]) ont été testés pour leur activité inhibitrice et ont montré un blocage de 48%-74% des interactions-1/-L1 recombinantes à la concentration la plus élevée testée. L’atezolizumab (un anticorps monoclonal anti-PDL1 différent) a été utilisé comme témoin positif. L’anticorps monoclonal commercial non apparenté trastuzumab (anti-HER2) a été utilisé comme témoin négatif. Cette figure est adaptée de Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig03.jpg"> Figure 3 : Liaison comparative de différents anticorps induits par PDL1-Vaxx à rhPD-L1 complexés à des billes magnétiques enrobées de rhPD1. Un anticorps de détection secondaire conjugué violet brillant 421 a été utilisé pour comparer la liaison de différents anticorps polyclonaux anti-PDL1-peptide de lapin à rhPD-L1 via des billes enrobées de rhPD-1. Le signal de fluorescence bleue BV421 a été enregistré dans le canal 2 du Reporter de l’instrument à double rapporteur ; ce signal est corrélé à l’efficacité relative de liaison des anticorps expérimentaux anti-PDL1-peptide. Le trastezumab (anti-HER2), un anticorps monoclonal qui cible un point de contrôle différent de celui de-1/-L1, a été utilisé comme témoin négatif. L’IMF représente l’intensité de fluorescence médiane moyenne des billes, qui a été mesurée dans des puits de réaction dupliqués par condition. Cette figure est adaptée de Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Les capacités relatives des quatre anticorps candidats expérimentaux induits par PDL1-Vaxx à se lier à rhPD-L1 ont été comparées à l’aide d’un système de détection séparé (IgG anti-lapin conjuguées BV421) qui a été évalué sur le deuxième canal rapporteur de l’instrument. Ces résultats indiquent que les quatre anticorps polyclonaux anti-PDL1-peptide se lient à rhPD-L1 d’une manière dépendante de la concentration14 (Figure 3). L’anticorps anti-PDL1(130) a montré le signal de liaison rhPDL1 le plus élevé des quatre candidats anticorps induits par PDL1-Vaxx.

Les inhibiteurs de point de contrôle sont des cibles importantes dans le développement de thérapies pour la lutte contre le cancer. Ce rapport présente un nouveau vaccin anticancéreux à base de peptides PDL1, PDL1-Vaxx, qui induit la production d’anticorps polyclonaux neutralisants qui bloquent la formation du complexe-1/PDL1. Ce travail détaille également le développement et la mise à l’essai d’un test à base de billes fluorescentes pour l’analyse de cette activité.

Analyse de flux à double rapporteur à base de billes fluorescentes magnétiques du blocage de l’interaction-1/-L1 par les anticorps induits par le vaccin PDL1-VAXX

The inhibition of checkpoint receptors (PD-1, PD-L1, and CTLA-4) with monoclonal antibodies has shown great benefit in clinical trials for treating cancer ...

Notre projet, dirigé par le professeur Pravin Kaumaya, se concentre sur le développement de vaccins peptidiques à épitopes de cellules B qui peuvent être utilisés pour renforcer le système immunitaire afin de mieux lutter contre le cancer. Nous pensons que les vaccins peptidiques ciblant les cibles de points de contrôle immunitaires peuvent même être combinés à d’autres thérapies pour améliorer les résultats pour les patients. Nous voulions tester la capacité de blocage de nos anticorps anti--L1 dans un test traditionnel de microbilles où la protéine-L1 recombinante humaine était liée à des billes MagPlex.Nous avons constaté qu’une fois que le-L1 était lié aux billes, celles-ci avaient une faible capacité de liaison pour son ligand-1. Cela nous a empêché d’utiliser cette voie de blocage des tests. Lorsque la liaison de la protéine aux billes inhibe la liaison au ligand ou aux anticorps, un prétraitement avec les anticorps de test en solution est une option, puis l’ajout ultérieur de billes enrobées de ligands au mélange de bloqueurs cibles.Leur interaction peut être examinée. Il peut s’agir d’une voie différente pour étudier la même interaction cible-ligand-liaison Nous avons développé les vaccins anticancéreux B-Vaxx, PD1-Vaxx, PDL1-Vaxx et CTLA4-Vaxx. Ces vaccins ciblent HER2 et plusieurs marqueurs de points de contrôle immunitaires sont impliqués dans diverses formes de cancer.B-Vaxx et PD1-Vaxx font l’objet d’essais cliniques en cours en Australie et aux États-Unis. Nous espérons que nos vaccins aux points de contrôle immunitaires bénéficieront à un plus grand nombre de patients. Dans des expériences précédentes sur les microsphères, nous avons constaté que-1 interagissait bien avec son ligand-L1. Par conséquent, nous avons repensé le protocole, en préliant les anticorps peptidiques anti--L1 à la protéine-L1 biotinylée avant d’ajouter les billes MagPlex marquées-1.Cela nous a permis de tester notre capacité à bloquer l’interaction-1/-L1 de nos anticorps. Nous continuerons de nous concentrer sur les immunothérapies combinées qui surmontent la résistance aux traitements. Nous voulons également explorer des thérapies combinées plus efficaces qui inhibent mieux la croissance tumorale, préviennent les métastases et prolongent les taux de survie des patients.

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Dans cette vidéo, nous démontrons une technique permettant d’effectuer la co-immunoprécipitation de protéines-1 de type sauvage et mutées marquées à la GFP à l’aide de billes enrobées d’anticorps anti-GFP. Les protéines-1-GFP liées aux billes sont incubées avec les protéines SHP2 qui interagissent avec-1, ce qui permet d’identifier des motifs structurels spécifiques dans-1 qui jouent un rôle essentiel dans l’interaction SHP2.

Dosage de l’immunoprécipitation pour étudier les interactions entre les récepteurs enzymatiques dans les cellules transfectées

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L&#39;analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l&#39;interaction protéine-protéine

Nous décrivons des techniques basées sur l’imagerie de l’animal entier et la cytométrie en flux pour surveiller l’expansion des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène en réponse à l’immunisation par des nanoparticules dans un modèle murin de vaccination.

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Nous présentons ici un protocole pour co-immunoprécipitation et un dosage de l’activité enzymatique sur-perle d’étudier simultanément la contribution de domaines de protéines spécifiques des récepteurs de la membrane plasmique à la fois de recrutement d’enzyme et de l’activité enzymatique.

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Nous avons développé un essai simple de cytométrie de flux pour évaluer la liaison des anticorps de PD-1-bloquant aux cellules De, exigeant seulement une goutte de sang périphérique des patients cancéreux.

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Un test de neutralisation rapide et multiplex à double rapporteur IgG et IgM SARS-CoV-2 pour un système d’analyse de débit à base de billes multiplexées

Ce protocole décrit un test de blocage des inhibiteurs de-1/-L1 à l’aide de la technologie de résonance plasmonique de surface. Il utilise une stratégie d’immobilisation en deux étapes et un système tampon adapté pour mesurer avec précision les unités d’intervention, facilitant ainsi l’évaluation des taux de blocage des composés ou des produits biologiques. De plus, il prend en charge l’identification à haut débit des inhibiteurs de-1/-L1.

Identification des inhibiteurs de-1/-L1 à l’aide de la technologie de résonance plasmonique de surface

Sélectivement marqué fluorescent GnRH-I, -II et -III dérivés sont des outils fiables pour le suivi et la quantification de leur absorption cellulaire. Ce manuscrit présente des expériences pour visualiser, quantifier et comparer l'efficacité d'absorption de ces conjugués de GnRH dans diverses lignées cellulaires.

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Découvrez une analyse de flux à double rapporteur utilisant des billes fluorescentes magnétiques pour évaluer le blocage de l'interaction PD-1/PD-L1 par les anticorps induits par le vaccin PDL1-Vaxx. Cette méthode permet de quantifier précisément l'activité neutralisante des anticorps antitumoraux.

Analyse de flux à double rapporteur à base de billes fluorescentes magnétiques du blocage de l’interaction-1/-L1 par les anticorps induits par le vaccin PDL1-VAXX (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse de flux à double rapporteur à base de billes fluorescentes magnétiques du blocage de l’interaction-1/-L1 par les anticorps induits par le vaccin PDL1-VAXX

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