Name: Cartographie de la distribution cellulaire d’une protéine optogénétique à l’aide d’une grille de stimulation lumineuse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Découvrez la cartographie de la distribution cellulaire de bPAC-nanoluciferase par stimulation lumineuse ciblée. Cette méthode optogénétique permet d'activer précisément des zones spécifiques des cellules vivantes pour étudier la signalisation cAMP.

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Le financement a été fourni par les subventions R01 des National Institutes of Health (NIH) GM099775 et GM130612 à D.L.A.

1. Culture cellulaire HC-1 et préparation pour l’imagerie
<ol>
	<li>Maintenir les cellules HC-1 dans du DMEM complétées par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), de la pénicilline (100 UI/L), de la streptomycine (100 mg/L) et de la L-glutamine dans des boîtes de 10 cm et incubées à 37 °C, 5 % de CO2, dans de l’air humidifié à 95 %.</li>
	<li>Passez les cellules tous les 2 à 4 jours une fois que les cellules sont confluentes à ~90 % en utilisant des dilutions de 1:5 ou 1:10.</li>
	<li>Cellules germes pour la transfection sur lamelles de verre 2 jours avant l’expérience.
	<ol>
		<li>En travaillant dans des conditions stériles dans une hotte de culture tissulaire avec un milieu préchauffé et du PBS, aspirez le milieu d’une boîte de cellules presque confluente et lavez-le délicatement avec 5 ml de PBS.</li>
		<li>Aspirez le PBS et ajoutez 1 mL de trypsine. Incuber à 37 °C pendant 3 à 5 minutes jusqu’à ce que les cellules se soient détachées.</li>
		<li>Remettre les cellules en suspension dans 4 mL de milieu et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL.</li>
		<li>Utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules et calculer la densité cellulaire.</li>
		<li>Diluer les cellules à une densité de 1,5 x 104 cellules/mL.</li>
		<li>Pipeter 2 mL de la suspension cellulaire sur des lamelles en verre de 25 mm avec revêtement en poly-D-lysine dans une boîte à 6 puits.</li>
		<li>Incuber les cellules pendant environ 24 h dans un incubateur jusqu’à 70 % de confluence.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfectez les cellules à l'aide d'un kit de transfection en suivant les instructions du fabricant en utilisant un rapport de 0,25 μg d'ADN NLS-bPAC-nLuc / 0,75 μg d'ADN NLS-H208 par 3 μL de réactif de transfection et 2 μL de réactif P3000 dilué dans un milieu Opti-MEM dépourvu de rouge de phénol.</li>
	<li>Placez les cellules dans l’incubateur pendant ~48 h pour permettre une expression suffisante de bPAC-nLuc, essentielle pour produire des niveaux détectables d’AMPc. 
	REMARQUE : Le niveau minimum requis d’expression de bPAC-nLuc variera en fonction de la puissance du système de stimulation et des paramètres de la stimulation.</li>
	<li>Préparer les cellules sur des lamelles pour l’imagerie.
	<ol>
		<li>Aspirez le support d’un puits et lavez-le deux fois avec 2 ml de PBS.</li>
		<li>Soulevez délicatement la lamelle à l’aide d’une pince et placez-la dans la chambre d’imagerie.</li>
		<li>Ajouter 1 mL d’Opti-MEM sans rouge de phénol dans la chambre d’imagerie. Les cellules peuvent également être imagées en HBSS ou dans toute autre solution physiologique compatible avec la fluorescence.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Simulation de lumière et imagerie de cellules vivantes
<ol>
	<li>Effectuer la culture cellulaire et la manipulation de cellules exprimant NLS-bPAC-nLuc dans un environnement sombre. Pour éviter l’exposition à des longueurs d’onde <500 nm, utilisez une lampe rouge (Table des matériaux) avec une ampoule à fluorescence compacte ambrée de 13 W (Table des matériaux).</li>
	<li>Réalisez des expériences dans un microscope motorisé à deux étages (Table des matériaux) équipé d’un moteur lumineux multi-LED à 6 lignes (Table des matériaux), d’une roue à filtres d’émission (Table des matériaux), d’une platine XY (Table des matériaux), d’une caméra numérique CMOS ORCA-Fusion (Table des matériaux) et d’un objectif à huile 100x/1.4 NA (∞/0.17/FN26.5). Capturer des images à l’aide d’un logiciel de microscopie numérique (Table des matières). Cette configuration est capable de stimuler les cellules et d’effectuer simultanément des mesures FRET en utilisant un trajet optique indépendant équipé d’un filtre dichroïque ZT458rdc (Table des matériaux). 
	REMARQUE : Toute configuration d’acquisition peut être utilisée si elle permet une stimulation optogénétique simultanée et une imagerie FRET/intensiométrique avec un capteur compatible.</li>
	<li>Activez le géosystème UGA - 42. Allumez le microscope et configurez-le avec les paramètres appropriés pour l’acquisition avec le capteur FRET H208. La configuration de l’acquisition dépendra des niveaux d’expression du capteur FRET. Les paramètres typiques sont un temps de simulation de 40 ms pour YFP/mScarletI, une puissance LED de 15 % et 0,5 Hz.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel SysCon et le logiciel d’imagerie qui contrôle le microscope.</li>
	<li>Dans la fenêtre Caméra, sélectionnez l’onglet Étalonnage et choisissez la longueur d’onde laser compatible avec la protéine optogénétique. Pour stimuler bPAC-nLuc, utilisez une longueur d’onde de 445 nm.</li>
	<li>Calibrez le système avant chaque utilisation. Ceci est important car de petites variations dans la configuration, ou même des changements de température ambiante (RT), peuvent altérer la précision de la stimulation.</li>
	<li>Dans la fenêtre de l’appareil photo, sélectionnez l’onglet Appareil photo et cliquez sur < Démarrer l’acquisition > pour démarrer l’acquisition à partir du logiciel d’imagination.</li>
	<li>Dans la fenêtre Image Viewer, visualisez une acquisition en direct ou antérieure de la fluorescence des cellules prélevées à partir du logiciel d’imagerie, qui guidera le positionnement des objets de stimulation.</li>
	<li>Utilisez le mode Click and Fire pour évaluer rapidement la réactivité d’une cellule individuelle avant de commencer l’expérience.</li>
	<li>À l’aide de la fenêtre du gestionnaire de séquences, sélectionnez <ajouter> pour créer un nouveau sequence. 
	REMARQUE : pour vérifier le bon calibrage du système, dessinez différentes formes et tailles dans la fenêtre du visualiseur d’images. Ceux-ci doivent correspondre précisément aux modèles de stimulation projetés sur les cellules, assurant un alignement précis avec le design prévu.</li>
	<li>Dans la fenêtre du visualiseur d’images , sélectionnez l’icône Rond dans la barre d’outils de gauche pour dessiner des objets de stimulation circulaires.</li>
	<li>Créez plusieurs petits cercles identiques et répartissez-les uniformément pour assurer la couverture homogène de l’ensemble du cytoplasme des cellules à stimuler.</li>
	<li>Faites un clic droit sur chacun d’eux pour vérifier l’homogénéité des objets de stimulation circulaires. Une fenêtre apparaîtra ; Utilisez-le pour examiner leur rayon, leur position, etc.</li>
	<li>Réglez le rayon entre 1 et 5, en fonction de l’objectif utilisé et de la taille de la cellule.</li>
	<li>Pour faciliter l’espacement et l’alignement réguliers des cercles, utilisez le bouton <Aligner sur la grille> dans la sous-fenêtre Affichage. De plus, définissez les propriétés de la grille à l’aide du bouton <Définir la grille>.</li>
	<li>Assurez-vous que la grille ou la matrice d’objets de stimulation circulaires régulièrement espacés recouvre entièrement la cellule et que sa taille (par exemple, 6 x 6 ou 10 x 10) est déterminée par la taille de la cellule. Pour contrôler la stimulation nulle qui ne devrait pas déclencher d’événements cellulaires, incluez des cercles positionnés à l’extérieur de la cellule.</li>
	<li>Chaque objet créé dans la fenêtre du visualiseur d’images apparaît dans la fenêtre Chronologie.
	<ol>
		<li>Dans la sous-fenêtre Synchronisation des objets, configurez les propriétés temporelles de chaque objet de stimulation (heure de début, durée, délai).</li>
		<li>Dans la sous-fenêtre Lightsource, configurez la longueur d’onde et l’intensité de chaque objet. Pour ce protocole, assurez-vous que chaque objet utilise la même longueur d’onde et qu’il est identique en durée et en intensité. L’heure de début sera différente pour chaque objet, et le délai entre eux peut être variable en fonction du résultat attendu pour éviter de superposer l’effet de différentes stimulations.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dans la fenêtre Chronologie, modifiez l’ordre dans lequel chaque objet de stimulation sera activé si nécessaire. Configurez les stimulations selon un schéma régulier (par exemple, de gauche à droite, de haut en bas) ou selon un modèle aléatoire, en fonction de l’expérience particulière.</li>
	<li>Téléchargez la séquence dans le système et configurez le nombre de cycles de séquence (exécutions) que le système effectuera.</li>
	<li>Placez les régions d’intérêt (ROI) dans le logiciel d’imagerie aux positions souhaitées.</li>
	<li>Commencez à acquérir des images de fluorescence avec le microscope et appuyez sur < Play > sur la fenêtre UGA-42.</li>
</ol>
3. Analyse des données
<ol>
	<li>Bien que le logiciel fourni par le système de stimulation permette d’enregistrer des séquences pour une utilisation ultérieure, il n’enregistre pas les informations réelles de l’expérience. Par conséquent, documentez méticuleusement tous les détails liés aux points de stimulation et aux séquences utilisés pendant l’expérience, y compris les paramètres tels que la position, l’intensité, la durée, le nombre de courses, etc. Documenter toute autre condition expérimentale pertinente, comme des agents pharmacologiques ou des solutions spécifiques.</li>
	<li>Au cours de l’expérience, positionnez les zones d’intérêt désignées sur le logiciel d’imagerie pour capturer les changements d’intensité de fluorescence de l’ensemble de la cellule ou d’emplacements spécifiques à l’intérieur des cellules.</li>
	<li>Portez une attention particulière au positionnement des zones d’intérêt par rapport aux points de stimulation. Mesurez les changements d’intensité de fluorescence à l’intérieur ou à l’extérieur des zones stimulées. Ajustez les positions des ROI après l’expérience, en fournissant le logiciel d’imagerie pour permettre d’enregistrer les images acquises pendant l’expérience et pas seulement les valeurs d’intensité du ROI.</li>
</ol>

A Light-Stimulation Grid Approach to Study Cellular Optogenetic Protein

<ol><li>Naim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescence-activated+nucleotide+cyclase+regulates+spatial+and+temporal+cAMP+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).</li>
<li>Naim, N., Reece, J. M., Zhang, X., Altschuler, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+activation+of+cAMP+production+through+photostimulation+or+chemical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Dual activation of cAMP production through photostimulation or chemical stimulation.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2173, 201-216 (2020).</li>
<li>Stierl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+modulation+of+cellular+cAMP+by+a+small+bacterial+photoactivated+adenylyl+cyclase%2C+bPAC%2C+of+the+soil+bacterium+Beggiatoa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1181-1188 (2011).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Liccardo, F., Luini, A., Di Martino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endomembrane-based+signaling+by+GPCRs+and+G-proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Endomembrane-based signaling by GPCRs and G-proteins.</a> Cells. 11 (3), 528(2022).</li>
<li>Groschner, K., Graier, W. F., Romanin, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGroschner%2C+K+%22Store-operated+ca%282%29%2B+entry+%28SOCE%29+pathways%22">Store-operated ca(2)+ entry (SOCE) pathways</a>. , Springer, Vienna. (2017).</li>
<li>Ross, E. M., Howlett, A. C., Ferguson, K. M., Gilman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+hormone-sensitive+adenylate+cyclase+activity+with+resolved+components+of+the+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of hormone-sensitive adenylate cyclase activity with resolved components of the enzyme.</a> The Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6401-6412 (1978).</li>
<li>Insel, P. A., Maguire, M. E., Gilman, A. G., Bourne, H. R., Coffino, P., Melmon, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+adrenergic+receptors+and+adenylate+cyclase%3A+products+of+separate+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Beta adrenergic receptors and adenylate cyclase: products of separate genes.</a> Molecular Pharmacology. 12, 1062-1069 (1976).</li>
<li>Pizzoni, A., Zhang, X., Naim, N., Altschuler, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+cyclase-mediated+nuclear+cAMP+synthesis+is+sufficient+for+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Soluble cyclase-mediated nuclear cAMP synthesis is sufficient for cell proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (4), e2208749120(2023).</li>
<li>Keravis, T., Lugnier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+nucleotide+phosphodiesterase+%28PDE%29+isozymes+as+targets+of+the+intracellular+signalling+network%3A+benefits+of+PDE+inhibitors+in+various+diseases+and+perspectives+for+future+therapeutic+developments%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) isozymes as targets of the intracellular signalling network: benefits of PDE inhibitors in various diseases and perspectives for future therapeutic developments.</a> British Journal of Pharmacology. 165 (5), 1288-1305 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

L’objectif de cette étude était de suivre précisément la distribution intracellulaire d’une protéine optogénétique et d’évaluer ses performances au sein d’un compartiment cytoplasmique particulier. Nous avons également montré les capacités de stimulation précises d’un système de balayage ponctuel sur des cellules exprimant une protéine optogénétique. Pour y parvenir, nous avons utilisé un bPAC-nLuc à cible nucléaire avec des niveaux d’expression élevés mais une distribution très confinée limitée au noyau. Les résultats ont montré que les points de stimulation séparés de seulement ~1 μm peuvent déclencher ou non la production d’AMPc, en fonction de la distribution cellulaire de la protéine optogénétique ; seules les stimulations dirigées vers le noyau ont permis d’augmenter les niveaux d’AMPc. Dans ce protocole, l’objectif n’était pas de générer des élévations localisées de l’AMPc, mais plutôt de montrer que de brèves stimulations lumineuses peuvent être suffisamment précises pour activer des protéines optogénétiques dans des zones très restreintes de la cellule sans stimuler les protéines environnantes. Cependant, cette approche constitue un contrôle nécessaire pour l’étude d’autres protéines optogénétiques à distributions diffuses et/ou la génération d’élévations localisées de l’AMPc. Cela peut être réalisé en faisant varier les niveaux d’expression de la protéine optogénétique, l’intensité et la fréquence de la stimulation, etc. Pour mesurer avec précision ces signaux localisés, il est crucial d’examiner attentivement les paramètres d’acquisition et les caractéristiques des capteurs. Cela inclut la sélection des positions et des tailles de retour sur investissement appropriées, la détermination de la fréquence d’acquisition et le choix de capteurs FRET/intensiométriques avec une affinité, une intensité, une plage dynamique et une constante de dissociation optimales.
Dans un article récemment publié, nous avons utilisé une stratégie similaire pour démontrer fonctionnellement la distribution d’un bPAC-nLuc à cible nucléaire et la capacité d’une phosphodiestérase modifiée (PDE ; ΔRI-PDE8) à abolir les élévations de l’AMPc dans une lignée cellulaire dérivée de la thyroïde9. Dans cet article, nous avons effectué une stimulation cellulaire le long d’une ligne droite au lieu d’une grille, et les points d’éclairage ont été placés par rapport aux points de repère cellulaires (par exemple, le centre nucléaire, le bord nucléaire, etc.) plutôt que selon un modèle systématique. Remarquablement, même les stimulations dirigées vers le bord nucléaire étaient insuffisantes pour déclencher une réponse détectable à l’AMPc. Nous avons estimé que cela était probablement dû à la stimulation d’une masse insuffisante de NLS-bPAC-nLuc9. Cependant, dans le protocole actuel, certaines stimulations dirigées vers le voisinage du bord nucléaire ont provoqué une augmentation détectable de l’AMPc. Cet écart pourrait être attribué à divers facteurs, notamment les niveaux d’expression du bPAC-nLuc, les caractéristiques de la stimulation, la morphologie du noyau, la présence de PDE endogènes, de protéines tampons, etc.
Alors que d’autres protéines optogénétiques ciblées ou non ciblées peuvent présenter des distributions plus diffuses, cette approche systématique permet de tirer des conclusions significatives en mettant en place soigneusement des expériences et en analysant les données. De plus, cette approche permet de cibler des structures cellulaires spécialisées (par exemple, les lamellipodes, les dendrites, les cils primaires, etc.), facilitant les comparaisons entre les réponses dans les régions distales et proximales de ces structures et/ou du corps cellulaire. 
Cette stratégie peut également être utilisée pour évaluer l’activation d’éléments en aval dans la voie de l’AMPc, tels que la protéine kinase A (PKA) ou la protéine d’échange directement activée par l’AMPc (EPAC1). De plus, étant donné que bPAC-nLuc n’est pas influencé par les mêmes modulateurs que les CA endogènes, qui peuvent être affectés par des interactions locales avec des protéines ou d’autres facteurs, on peut supposer qu’il génère systématiquement la même quantité d’AMPc avec le même niveau d’expression. En examinant la réduction des élévations de l’AMPc ou la diminution des niveaux d’AMPc après une augmentation temporaire, cette approche permet d’évaluer la dégradation de l’AMPc, la diffusion ou la fonctionnalité et la distribution des EDP endogènes ou transfectées. Cette stratégie s’avère particulièrement utile pour évaluer le comportement de toute protéine optogénétique à différents endroits cellulaires, ce qui permet d’éviter le biais de placer arbitrairement des points de stimulation dans le cytoplasme.
Il est important de tenir compte du fait que la taille du point de stimulation et son énergie dépendront finalement des caractéristiques particulières de l’installation utilisée (trajets lumineux, objectifs, système de balayage, etc.). Pour garantir des résultats précis, l’expression relative de la protéine optogénétique, la sensibilité des cellules à la longueur d’onde utilisée et tout autre paramètre doivent être pris en compte lors de la réalisation de chaque expérience dans chaque système particulier. Il est également essentiel de noter que nous n’avons pas étudié dans quelle mesure le système peut être piloté dans la mise en œuvre de points de stimulation plus petits et/ou de grilles plus denses (c’est-à-dire des points de stimulation moins espacés) pour évaluer systématiquement les structures cellulaires plus petites avec une précision accrue. De plus, nous avons testé cette stratégie en utilisant uniquement le système de balayage de points géographiques UGA-42. Cette approche peut être possible en utilisant différents systèmes, à condition qu’ils puissent générer de manière reproductible des taches localisées régulièrement espacées. Chaque système doit être optimisé pour donner des résultats similaires.
Enfin, la stimulation potentielle des capteurs FRET par le système de stimulation doit être soigneusement évaluée. Par exemple, la protéine fluorescente cyan (CFP) sera certainement stimulée ou même blanchie par le laser 445 nm utilisé dans ce protocole. L’utilisation de puissances laser plus élevées (ou de filtres à densité neutre (ND) à transmission plus élevée) augmentera les chances de stimuler les capteurs fluorescents et, d’introduire de fausses informations dans l’expérience et/ou de générer des problèmes lors de l’analyse des données. Le photoblanchiment normal des capteurs FRET/intensiométriques doit également être soigneusement évalué. Enfin, étant donné que le bPAC peut être sensible à la lumière ambiante et générer de l’AMPc même dans des conditions sombres (l’activité sombre du bPAC a été mesurée à 33 ± 5 pmol/min/mg de protéine3), les cellules doivent être manipulées avec soin après la transfection du bPAC-nLUC pour éviter la contamination par la lumière (par exemple, à l’incubateur, avant et/ou pendant les expériences, etc.). En option, les cellules peuvent être incubées avec un inhibiteur de PDE (par exemple, 3-isobutyl-1-méthylxanthine ; IBMX10) pour déterminer l’activité de base de bPAC-nLuc et confirmer que les conditions d’éclairage utilisées sont suffisamment sombres.

L’optogénétique, née comme un outil qui a révolutionné les neurosciences, est aujourd’hui un domaine de recherche en plein essor et une technologie en plein essor couramment utilisée par de nombreux laboratoires dans le monde entier et dans divers domaines de recherche en biologie. Nous avons développé bPAC-nLuc, une protéine optogénétique polyvalente, en fusionnant une adénylyl cyclase (AC) sensible à la lumière de Beggiatoa sp. (adénylyl cyclase photoactivable bactérienne ; bPAC) à la nanoluciférase (nLuc)1,2,3. Lorsqu'il est stimulé par la lumière bleue, le bPAC produit le deuxième messager, l'adénosine monophosphate cyclique 3',5' (AMPc). nLuc est une petite luciférase récemment développée qui, en présence de l’un de ses substrats, peut générer une bioluminescence et activer la production d’AMPc4. Ainsi, cette protéine optogénétique peut être activée transitoirement en utilisant de brèves impulsions lumineuses ou régulièrement avec de la furimazine ou d’autres substrats de la luciférase, ce qui nous permet d’imiter différents modèles de signalisation de l’AMPc et d’évaluer les réponses cellulaires (activation des facteurs de transcription, expression des gènes, prolifération cellulaire, migration, etc.). Les progrès récents dans la signalisation du 2e messager ont souligné l’importance des événements se produisant dans des régions cytosoliques très restreintes (par exemple, la production endosomale d’AMPc pour la phosphorylation de la protéine de liaison à l’élément de réponse à l’AMPc (CREB) ou les microdomaines Ca2+ pour la translocation du facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) vers le noyau)5,6. Par conséquent, il est important de développer des stratégies cohérentes et systématiques pour évaluer, imiter et bloquer la signalisation de ces compartiments dans les cellules vivantes. Pour montrer la capacité de bPAC-nLuc à être spécifiquement activé dans différents compartiments cellulaires, nous avons co-transfecté une lignée cellulaire dérivée de l’hépatome (HC-1) avec le bPAC-nLuc à cible nucléaire et H208, un capteur cAMP de transfert d’énergie de résonance (FRET) de Förster (NLS-bPAC-nLuc ; NLS-H208). Les cellules HC-1 qui dérivent de la gamme HTC sont dépourvues d’activité AC dosable, ce qui se traduit par de très faibles niveaux basaux d’AMPc, ce qui la rend idéale pour mesurer la production présumée d’AMPc tout en tirant parti de la plage dynamique complète des capteurs FRET7,8. À l’aide d’un laser à semi-conducteurs (445 nm, LDI-7, 89 North) connecté à un système de balayage ponctuel (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic), nous décrivons un protocole permettant de stimuler systématiquement de très petites zones circulaires ou taches (~1 μm2) à l’intérieur de cellules individuelles. Le système de balayage ponctuel était connecté à l’un des ports arrière d’un microscope à deux étages, ce qui nous a permis de stimuler les cellules et d’effectuer des mesures FRET simultanément via un trajet lumineux indépendant. Nous présentons une méthode dans ce protocole où le logiciel SysCon Geo, fourni avec le système de stimulation par Rapp OptoElectronic, est utilisé pour effectuer un balayage complet du cytoplasme des cellules. L’approche consiste à générer une carte de réponse à l’AMPc en mettant en place une séquence d’illuminations qui stimulent les cellules dans un motif de grille (Figure 1).

<table><tbody><tr><td>Ampoule à fluorescence compacte ambrée 13 W - Faibles lumières bleues</td><td>Développements photoniques&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I7018</td><td></td></tr><tr><td>6-lignes multi-LED Lumencor Spectra X</td><td>Lumencor&nbsp ;</td><td></td><td>Moteur d’éclairage multi-LED à 6 lignes&nbsp ;</td></tr><tr><td>Corning - DMEM&nbsp ;</td><td>Thermo Fischer</td><td>MT10013CMEA</td><td></td></tr><tr><td>Corning - Sérum bovin fœtal régulier</td><td>Thermo Fischer</td><td>MT35011CV</td><td></td></tr><tr><td>Lunettes de protection : cercles</td><td>Thermo Fischer</td><td>12545102P</td><td></td></tr><tr><td>GBX-2 dark red safelight filter 5.5"&nbsp ;</td><td>Kodak</td><td>1416827</td><td>Lampe de sécurité rouge &nbsp ;</td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) 10x</td><td>Thermo Fischer</td><td>14185052</td><td>Dilué à 1x, pH ajusté</td></tr><tr><td>LDI-7</td><td>89 North</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fischer</td><td>BW17605E</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000&nbsp ;</td><td>Thermo Fischer</td><td>L3000001</td><td>Kit de transfection</td></tr><tr><td>Olympus IX83 motorisé à deux étages&nbsp ; microscope&nbsp ;</td>Microscope motorisé à deux étages <td>Olympus</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Opti-MEM, sans rouge de phénol</td><td>Thermo Fischer</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>caméra CMOS numérique ORCA-fusion.</td><td>Hamamatsu</td><td>C14440-20UP</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Fischer</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Solution tamponnée au phosphate (1x)</td><td>Lonza</td><td>17516F</td><td></td></tr><tr><td>Roue à filtres à émission préalable et jeux de filtres</td><td>Prior Scientific, Inc.</td><td></td><td>Roue à filtres d’émissions&nbsp ;</td></tr><tr><td>Préalable&nbsp ; Proscan XY stage</td><td>Prior Scientific, Inc.</td><td></td><td>Stade XY&nbsp ;</td></tr><tr><td>Diaporama 6</td><td>Innovations en imagerie intelligente Logiciel</td><td></td> de <td>microscopie numérique</td></tr><tr><td>Logiciel SysCon</td><td>Logiciel</td><td></td><td>Logiciel fourni par le système de stimulation&nbsp ;</td></tr><tr><td>UGA-42&nbsp ; Géo&nbsp ;</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPlanSApo 100x</td><td>Olympus</td><td></td><td>100x/1.4 NA objectif à huile (&infin ;/0.17/FN26.5)</td></tr><tr><td>ZT458rdc dichroic&nbsp ;</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>BS, Longueur d’onde (CWL) :&nbsp ; 498 milles marins</td></tr></tbody></table>

cartographie de la distribution cellulaire d’une protéine optogénétique à l’aide d’une grille de stimulation lumineuse

Mapping the Cellular Distribution of an Optogenetic Protein Using a Light-Stimulation Grid

Notre objectif était de suivre avec précision la distribution cellulaire d’une protéine optogénétique et d’évaluer sa fonctionnalité à un endroit cytoplasmique spécifique. Pour y parvenir, nous avons co-transfecté des cellules avec des capteurs d’AMPc à cible nucléaire et notre protéine optogénétique développée en laboratoire, l’adénylyl cyclase-nanoluciférase photoactivable bactérienne (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc, lorsqu'il est stimulé avec de la lumière de 445 nm ou des substrats de luciférase, génère de l'adénosine 3',5'-monophosphate cyclique (AMPc). Nous avons utilisé un illuminateur laser à semi-conducteurs connecté à un système de balayage ponctuel qui nous a permis de créer un motif de grille/matrice de petits points éclairés (~1 μm2) dans tout le cytoplasme des cellules HC-1. Ce faisant, nous avons été en mesure de suivre efficacement la distribution des bPAC-nLuc à visée nucléaire et de générer une carte d’intervention complète du cAMP. Cette carte représentait avec précision la distribution cellulaire de bPAC-nLuc, et sa réponse à la stimulation lumineuse variait en fonction de la quantité de protéines dans le spot éclairé. Cette approche novatrice contribue à l’élargissement de la gamme de techniques disponibles pour l’étude des protéines optogénétiques cellulaires. La capacité de cartographier sa distribution et sa réponse avec une grande précision a un potentiel considérable et pourrait faire progresser divers domaines de recherche.

Les résultats présentés dans la Figure 1 montrent que seules les stimulations dirigées vers le noyau cellulaire ont permis de générer des augmentations mesurables du taux de CAMP. Ceci confirme que NLS-bPAC-nLuc est exprimé exclusivement dans le compartiment nucléaire des cellules HC-1. Il est possible de stimuler précisément une protéine optogénétique en utilisant ce motif de grille/matrice afin de cartographier sa distribution intracellulaire. De plus, les augmentations plus importantes du taux de CAMP vers le centre du noyau reflètent la masse plus élevée de bPAC-nLuc simulée par les taches centrales par rapport à celles situées en périphérie nucléaire (Figure 1).
<img alt="Résultat de microscopie YFP H208, stimulation lumineuse à 445 nm, graphiques de signaux transitoires, spectroscopie optique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65471/65471fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1 : Protocole de stimulation en grille et carte de réponse de l’AMPc. Des stimulations lumineuses séquentielles bleues (445 nm ; intervalle de 30 s entre les impulsions ; train d'impulsions : 50 ms, durée totale de 500 ms, 10 Hz, puissance laser de 7 %) ont été appliquées sur des cellules HC-1 transfectées avec NLS-H208 (capteur d’AMPc) et NLS-bPAC-nLuc. Le panneau gauche montre la fluorescence de la protéine fluorescente jaune (YFP) provenant de H208, superposée aux impulsions lumineuses réelles capturées par la caméra sCMOS, représentées sur une seule image. Les tracés à droite illustrent les augmentations transitoires d’AMPc induites par la stimulation de NLS-bPAC-nLuc à chaque point de stimulation. La fluorescence de NLS-H208, corrigée du fond, a été mesurée à l’aide d’une région d’intérêt unique couvrant tout le noyau, et des rapports normalisés (R/R0) ont été calculés. Les réponses dans les zones périphériques (lignes 1 et 7, colonnes A et G) étaient négatives et ne sont pas représentées. Barre = 3 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65471/65471fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole implique la transfection de capteurs d’AMPc et de bPAC-nLuc, une protéine optogénétique, pour suivre avec précision sa distribution cellulaire et sa réponse à la stimulation lumineuse. L’approche novatrice consistant à créer une carte de réponse à l’AMPc à l’aide d’un système de balayage ponctuel offre le potentiel de faire progresser la recherche sur les protéines optogénétiques dans différents domaines.

Cartographie de la distribution cellulaire d’une protéine optogénétique à l’aide d’une grille de stimulation lumineuse

Our goal was to accurately track the cellular distribution of an optogenetic protein and evaluate its functionality within a specific cytoplasmic ...

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