Double immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 dans les lymphocytes périphériques humains
14 juillet 2023
Ce protocole présente une méthode pour évaluer la formation et la réparation des cassures double brin d’ADN par la détection simultanée des foyers γH2AX et 53BP1 dans les noyaux interphasiques des lymphocytes périphériques humains traités à la bléomycine.
L’objectif de ce manuscrit était d’évaluer la pertinence de la quantification simultanée des foyers Gamma H2AX et 53BP1 pour évaluer les dommages génomiques induits dans les lymphocytes périphériques humains par la bléomycine. Plusieurs facteurs peuvent provoquer des ruptures double brin. Les cellules sont ainsi pourvues de plusieurs mécanismes de réparation, impliquant à la fois Gamma H2AX et 53 Binding Protein 1, qui peuvent co-localiser près de la rupture double brin.
Après avoir prélevé des échantillons de sang total, ajoutez 300 microlitres d’échantillon dans un tube contenant 4,7 millilitres de milieu complet. Ajoutez ensuite cinq microgrammes par millilitre de concentration finale de sulfate de bléomycine. Pour chaque échantillon, mettez en place un contrôle négatif.
Mettez le tube dans un thermostat à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Centrifuger les échantillons à 540 g pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite cinq millilitres de solution hypotonique à la pastille.
Ajoutez ensuite 400 microlitres de solution préfixative afin de provoquer une hémolyse. Centrifuger les échantillons à 540 G pendant cinq minutes, puis remettre en suspension la pastille dans cinq millilitres de méthanol à température ambiante pendant au moins 30 minutes pour fixer les cellules. Centrifuger les échantillons à 540 G pendant cinq minutes, puis remettre en suspension la pastille dans cinq millilitres de solution fixatrice.
Répétez cette étape une fois de plus. Centrifuger à nouveau à 540 G pendant cinq minutes, puis aspirer le surnageant en laissant suffisamment de solution pour remettre en suspension la pastille. Déposez la pastille de cellule remise en suspension sur les lames.
Préparer les deux solutions contenant les anticorps primaires anti-Gamma H2AX et anti-53BP1 dissous dans une solution de blocage. Ensuite, lavez les lames deux fois dans PBS 1X. Gardez ensuite les lames pendant 30 minutes dans une solution bloquante.
Ajouter à chaque lame 10 microlitres de chacune des deux solutions contenant les anticorps primaires dissous dans la solution bloquante. Couvrez les diapositives avec du parafilm. Incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Après l’incubation, effectuez trois lavages dans PBS 1X pendant cinq minutes. Préparez les deux solutions contenant les anticorps secondaires DyLight 488 et Alexa Fluor 568 dissous dans une solution bloquante. Ajouter ensuite à chaque lame 10 microlitres de chacune des deux solutions contenant les anticorps secondaires dissous dans la solution de blocage.
Couvrir les lames de parafilm et incuber à température ambiante pendant deux heures. Après cette deuxième incubation, effectuez trois lavages dans PBS 1X pendant cinq minutes. Ajouter 2,5 microlitres de solution antidécoloration avec DAPI sur les bordereaux de couvercle avant l’assemblage pour contrer la tache des noyaux.
Afin d’évaluer la cinétique des foyers, la procédure est la même que celle décrite ci-dessus. La dernière phase est l’observation et la quantification des foyers. Les lymphocytes humains sans foyers Gamma H2AX et 53BP1 sont représentés dans A, dans B, et dans C, les lymphocytes humains avec différentes quantités de foyers Gamma H2AX et 53BP1 sont montrés.
On observe un faible niveau de co-localisation des foyers. Comme prévu, une fréquence très élevée des foyers Gamma H2AX et 53BP1 est observée entre les cellules non traitées non traitées. En outre, une grande différence est observée dans le nombre de foyers des deux marqueurs.
L’évolution temporelle des foyers Gamma H2AX et 53BP1 au fil du temps a montré un comportement différent bien qu’ils contribuent à la même fonction. L’analyse des foyers gamma H2AX et 53BP1 a la capacité d’évaluer la réponse cellulaire dans des contextes d’exposition ou pathologiques. Cependant, la double immunofluorescence Gamma H2AX et 53BP1 peut conduire à sous-estimer la fréquence réelle de l’événement.
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Aperçu
Ce protocole présente une méthode permettant d'évaluer la formation et la réparation des cassures double brin de l'ADN par la détection simultanée des foyers de γH2AX et de 53BP1 dans les noyaux en interphase de lymphocytes périphériques humains traités par la bléomycine.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Génomique
Contexte
- Les cassures double brin peuvent être induites par divers facteurs.
- Les cellules possèdent plusieurs mécanismes de réparation des lésions de l'ADN.
- γH2AX et 53BP1 sont des protéines clés impliquées dans la réparation de l'ADN.
- La co-localisation de ces protéines se produit près des cassures double brin.
Objectif de l'étude
- Évaluer l'aptitude à la quantification simultanée des foyers γH2AX et 53BP1.
- Évaluer les lésions génomiques dans les lymphocytes périphériques humains.
- Comprendre les effets de la bléomycine sur l'intégrité de l'ADN.
Méthodes utilisées
- Des échantillons de sang total sont prélevés sur des sujets humains.
- Les échantillons sont traités avec du sulfate de bléomycine.
- Des contrôles négatifs sont mis en place à des fins de comparaison.
- La détection des foyers de γH2AX et de 53BP1 est réalisée dans les noyaux en interphase.
Résultats principaux
- La détection simultanée des foyers γH2AX et 53BP1 est faisable.
- Le traitement par la bléomycine entraîne des lésions de l'ADN mesurables.
- La quantification des foyers est corrélée à l'importance des dommages génomiques.
- Les résultats soutiennent l'utilisation de cette méthode pour évaluer les mécanismes de réparation de l'ADN.
Conclusions
- Le protocole évalue efficacement la formation et la réparation des cassures double brin de l'ADN.
- La détection simultanée de γH2AX et de 53BP1 fournit des informations précieuses.
- Cette méthode peut être appliquée à diverses études sur les lésions et la réparation de l'ADN.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
La détection quantitative des marqueurs de cassures double brin de l'ADN (DSB), γH2AX et 53BP1, dans les lymphocytes humains permet une évaluation précise des lésions génomiques et de la cinétique de réparation. Cette approche d'immunofluorescence double renforce la fiabilité prédictive du criblage précoce de la génotoxicité et de l'analyse mécanistique des risques associés aux composés candidats. L'intégration de ces paramètres au stade de la découverte soutient des décisions de portefeuille adaptées au risque et assure une continuité translationnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation directe des voies de réponse aux lésions de l'ADN dans les cellules humaines.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en quantifiant l'induction des cassures double brin et la cinétique de réparation.
- Permet la validation fonctionnelle des cibles impliquées dans la stabilité du génome.
- Améliore la confiance prédictive concernant les risques de génotoxicité des composés candidats.
Développement de criblages et de tests
- Offre un système validé pour la quantification des marqueurs de dommages de l'ADN dans les cellules humaines primaires.
- Permet des lectures reproductibles et quantitatives des cassures double brin induites par des composés.
- Prend en charge la standardisation des tests pour le criblage à haut contenu de modulateurs de dommages de l'ADN.
- Facilite une évaluation fiable des profils de sécurité des composés lors des premiers criblages.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne la quantification des marqueurs de dommages de l'ADN avec les stratégies de biomarqueurs translationnels.
- Permet une continuité allant de la découverte in vitro à l'évaluation préclinique de la sécurité.
- Permet la progression ajustée au risque de candidats présentant des profils favorables de réparation de l'ADN.
- Fournit un éclairage mécanistique sur les réponses cellulaires pertinentes pour les maladies et les traitements.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode de double immunofluorescence s'inscrit dans le continuum entre la découverte précoce et le stade préclinique, permettant une évaluation fondée sur des hypothèses des lésions de l'ADN et de leur réparation dans les lymphocytes humains.
- Biologie de la découverte : Quantifie les foyers marqueurs des cassures double brin (DSB) afin de préciser l'engagement des voies de réparation de l'ADN et de réduire les risques biologiques.
- Écrantage : Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs pour le profilage de la génotoxicité des composés.
- Analytique : Permet des mesures cinétiques des foyers γH2AX et 53BP1 en vue d'analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Relie les résultats in vitro aux stratégies précliniques de biomarqueurs de la réponse aux dommages de l'ADN.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme réutilisable d'évaluation des dommages de l'ADN dans divers programmes de découverte.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans l'évaluation des dommages de l'ADN.
- Valeur opérationnelle : Standardise la quantification des marqueurs de cassures double brin pour assurer la reproductibilité et la reproductibilité à grande échelle.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller ou de ne pas aller de l'avant et réduit les risques biologiques tardifs liés à la génotoxicité.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des candidats ajustée au risque en fonction de leurs profils de réparation de l'ADN.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie en immunofluorescence et en analyse quantitative d'images.
- Exige un accès à des anticorps validés et à une infrastructure d'imagerie en fluorescence.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de préparation des échantillons et de quantification.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les types cellulaires ou les systèmes modèles.
- Risque de sous-estimation de la fréquence réelle des cassures double brin en raison des limites de co-localisation des marqueurs.
