Name: Double immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 dans les lymphocytes périphériques humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Découvrez une méthode d'immunofluorescence double pour détecter γH2AX et 53BP1 dans les lymphocytes périphériques humains traités par bléomycine. Cette technique permet d'évaluer la formation et la réparation des cassures double-brin de l'ADN.

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Nous sommes reconnaissants aux donneurs de sang total et à tout le personnel de santé qui a prélevé les échantillons de sang.

L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’Université de Pise, et le consentement éclairé et signé a été obtenu de chaque donneur.
1. Formation des foyers γH2AX et 53BP1
<ol><li>Préparation des échantillons et traitement mutagène<ol><li>Prélever des échantillons de sang total par ponction veineuse chez des adultes en bonne santé dans des tubes de prélèvement sanguin (p. ex. Vacutainer) contenant de l’héparine de lithium comme anticoagulant.</li>
		<li>Afin de garantir une bonne conservation des échantillons de sang, commencez la procédure dans les 24 heures suivant le prélèvement.</li>
		<li>Ajouter 300 μL de l’échantillon dans un tube contenant 4,7 mL de milieu complet (0,5 % pénicilline-streptomycine, 0,75 % phytohémagglutinine, 10 % FBS précédemment inactivé, 88,75 % RPMI 1640).</li>
		<li>Ajouter ensuite le sulfate de bléomycine à une concentration finale de 5 μg/mL. ATTENTION : Le sulfate de bléomycine est un mutagène. Éviter le contact cutané et l’inhalation. Préparer la solution et ajouter l’échantillon sous une hotte.</li>
		<li>Pour chaque échantillon, mettre en place un contrôle négatif (absence de mutagène).</li>
		<li>Placer le tube dans un thermostat à 37 °C pendant 2 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixation<ol><li>Centrifuger les échantillons à 540 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille avec du vortex.</li>
		<li>Ajouter 5 mL de solution hypotonique (2,87 g de KCl dissous dans 500 mL d’eau désionisée) et 400 μL de solution préfixatrice (acide acétique 5:3 : méthanol) pour provoquer l’hémolyse des globules rouges.</li>
		<li>Centrifuger les échantillons à 540 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 5 mL de méthanol à température ambiante pendant au moins 30 minutes pour fixer les cellules.</li>
		<li>Vous pouvez également conserver les cellules à -20 °C jusqu’à utilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation des diapositives<ol><li>Centrifuger les échantillons à 540 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 5 mL d’une solution d’acide acétique de méthanol 3:1. Répétez ces étapes une fois de plus.</li>
		<li>À la fin, centrifuger à nouveau la solution à 540 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Aspirer à nouveau le surnageant en laissant suffisamment de solution (0,5 mL) pour remettre en suspension la pastille, pipeter vigoureusement, laisser tomber la pastille de cellule remise en suspension sur les lames et sécher à l’air. Conserver les lames à 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunofluorescence NOTE: L’immunofluorescence est une méthode immunologique d’identification de cibles cellulaires spécifiques à l’aide d’un anticorps primaire liant la cible elle-même et d’un anticorps secondaire fluorescent liant la cible primaire qui permet de localiser la cible11. Dans ce cas, un anti-53BP1 monoclonal de souris (1:50) et un anti-γH2AX polyclonal de lapin (1:50) sont utilisés comme anticorps primaires, tandis que l’anti-souris AlexaFluor568 (1:400) et l’anti-lapin DyLight488 (1:200) sont utilisés comme anticorps secondaires, respectivement.<ol><li>Lavez les lames deux fois dans 50 ml de 1x PBS pendant 5 min dans un pot de couplin (16 lames dos à dos).</li>
		<li>Ensuite, conservez-les pendant 30 min dans une solution de blocage (10 mL de FBS, 10 mL de PBS 10x, 80 mL d’eau désionisée, 300 μL de Triton-X).</li>
		<li>Ajouter à chaque lame 10 μL de chacune des deux solutions contenant les anticorps primaires dissous dans la solution bloquante. Couvrir les lames avec du ruban de paraffine et incuber à 4 °C pendant la nuit.</li>
		<li>Après l’incubation, effectuer trois lavages en 1x PBS pendant 5 min.</li>
		<li>Ajouter à chaque lame 10 μL de chacune des deux solutions contenant les anticorps secondaires dissous dans la solution bloquante. Couvrir les lames avec du ruban de paraffine et incuber à température ambiante pendant 2 h.</li>
		<li>Effectuer trois lavages en 1x PBS pendant 5 min.</li>
		<li>Ajouter 2,5 μL de solution antidécoloration avec DAPI sur les lamelles de couverture avant l’assemblage pour contre-colorer les noyaux. NOTE: Afin d’évaluer la cinétique des foyers, la procédure est la même que celle décrite de 1.1 à 1.4, notant que le prélèvement cellulaire et la double immunofluorescence sont effectués à 0 h, après 2 h de traitement post-bléomycine puis, après avoir retiré le mutagène, à 4 h, 6 h et 24 h après le traitement.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Analyse au microscope à fluorescence
REMARQUE: « Microscope à fluorescence » fait référence à tout microscope qui utilise la fluorescence pour générer une image. L’échantillon est éclairé par de la lumière d’une longueur d’onde spécifique (ou de longueurs d’onde) qui est absorbée par les fluorophores, ce qui les amène à émettre de la lumière de longueurs d’onde plus longues12. AlexaFluor568 et DyLight 488 absorbent une lumière d’environ 568 et 488 nm et émettent une lumière de 603 et 520 nm, respectivement. Ainsi, ils sont visibles sous forme de fluorescence rouge ou verte à l’aide d’un filtre TRITC ou FITC, respectivement.
<ol><li>Noter la présence de foyers dans chaque diapositive sous un objectif d’immersion 100x (Figure 1).</li>
	<li>Marquez 200 noyaux par lame et comptez le nombre de foyers γH2AX/53BP1 dans chaque noyau.</li>
	<li>Exprimer les résultats en termes de nombre moyen de foyers par noyau total marqué. Ceux-ci incluent à la fois les noyaux γH2AX/53BP1 positifs (montrant au moins un signal de fluorescence) et négatifs (ne montrant aucun signal de fluorescence).</li>
</ol>

<ol><li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+response+to+double-strand+DNA+breaks+and+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair.</a> Cells. 9 (8), 1853(2020).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Dickey, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Her, J., Bunting, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+ensure+correct+repair+of+DNA+double-strand+break%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%2C+Thematic+Minireview%22%5BJournal%5D)">How cells ensure correct repair of DNA double-strand break.</a> Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).</li>
<li>Kuo, L. K., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).</li>
<li>Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+the+53BP1+protein+in+genome+protection%3A+structural+and+functional+characteristics+of+53BP1-dependent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair.</a> Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).</li>
<li>Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+microscopy+of+%CE%B3H2AX+and+53BP1+for+analyzing+the+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), 56617(2017).</li>
<li>Jezkova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particles+with+similar+LET+values+generate+DNA+breaks+of+different+complexity+and+reparability%3A+a+high-resolution+microscopy+analysis+of+%CE%B3H2AX%2F53BP1+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci.</a> Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).</li>
<li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+nuclear+phosphorylation+%28%CE%B3-H2AX%29+in+human+lymphocytes+treated+in+vitro+with+UVB%2C+bleomycin+and+mitomycin+C%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C.</a> Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).</li>
<li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li>
<li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanderson%2C+MJ+%22Fluorescence+microscopy%22">Fluorescence microscopy</a>. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of the cell membrane.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Hecht, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleomycin%3A+New+perspectives+on+the+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action.</a> Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).</li>
<li>Fei, P., El-Deiry, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+and+radiation+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">P53 and radiation responses.</a> Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).</li>
<li>Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+ionizing+radiation-induced+DNA+double-strand+breaks+by+non-homologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining.</a> Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).</li>
<li>Palla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX%3A+Can+it+be+established+as+a+classical+cancer+prognostic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor.</a> Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931(2017).</li>
<li>Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwaves+from+GSM+mobile+telephones+affect+53BP1+and+gamma-H2AX+foci+in+human+lymphocytes+from+hypersensitive+and+healthy+persons%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons.</a> Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).</li>
<li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+damage+in+peripheral+lymphocytes+of+obese+and+overweight+Italian+children+as+evaluated+by+the+%CE%B3-H2AX+focus+assay+and+micronucleus+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test.</a> The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).</li>
<li>Shanbhag, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+neuronal+accumulation+of+DNA+double-strand+breaks+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communication%22%5BJournal%5D)">Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77(2019).</li>
<li>Lassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+of+gamma-H2AX+and+53BP1+DNA+repair+foci+in+blood+cells+after+radioiodine+therapy+of+differentiated+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).</li>
<li>Derlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B3-H2AX+and+53BP1+foci+in+peripheral+blood+lymphocytes+to+predict+subclinical+hematotoxicity+and+response+in+somatostatin+receptor-targeted+radionuclide+therapy+for+advanced+gastroenteropancreatic+neuroendocrine+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors.</a> Cancers (Basel). 13 (7), 1516(2021).</li>
<li>Djuzenova, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitivity+in+breast+cancer+assessed+by+the+histone+%CE%B3-H2AX+and+53BP1+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci.</a> Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).</li>
<li>Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+DNA+double-strand+breaks+-+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’analyse par immunofluorescence des foyers γH2AX et 53BP1 est une méthode appropriée pour évaluer les dommages génomiques dans les noyaux interphasiques d’un système cellulaire. Cette procédure comporte plusieurs points critiques qui peuvent affecter le résultat des expériences, principalement les agents utilisés dans la fixation et la perméabilisation, le type d’anticorps et leurs facteurs de dilution, ainsi que la concentration du mutagène.
Le maintien de l’intégrité des protéines est fonda...

Les dommages à l’ADN sont continuellement induits par des agents qui peuvent être endogènes, tels que les ROS générés par le métabolisme oxydatif cellulaire, ou exogènes, à la fois chimiques et physiques1. Parmi les lésions les plus nocives, les cassures double brin (DSB) jouent un rôle fondamental en contribuant à l’instabilité génomique, car elles provoquent des aberrations chromosomiques qui peuvent à leur tour initier le processus de cancérogenèse. Ainsi, les cellules sont pourvues de mécanismes complexes et efficaces de réparationDSBs 2.
Lorsqu’un DSB se produit, la cellule déclenche la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) où, avec le complexe MRE11 / RAD50 / NBS1, les kinases ATM ou ATR sont recrutées pour activer d’autres protéines qui ralentissent ou arrêtent le cycle cellulaire3. Une cible essentielle de ces kinases est l’histone H2AX, qui est phosphorylée sur Ser-139 au sein de quelques mégabases issues des DSB (à savoir γH2AX), permettant ainsi le recrutement de plusieurs facteurs de réparation tels que, entre autres, BRCA1 et p53 binding protein 1 (53BP1)3. Plus tard, une voie entre la recombinaison homologue (HR), l’assemblage d’extrémité non homologue (NHEJ) ou le recuit simple brin (SSA) est déclenchée pour réparer les DSB 4,5. Par conséquent, 53BP1 est impliqué dans la dictée du choix entre HR ou NHEJ, favorisant principalement l’activation de NHEJ plutôt que HR6. De plus, la forme phosphorylée de l’histone H2AX et du 53BP1 peut former des foyers sur les sites des DSB. Comme ces foyers persistent jusqu’à ce que l’intégrité du double brin soit restaurée, l’évaluation de l’apparition/disparition des foyers γH2AX ou 53BP1 dans un intervalle de temps est considérée comme une méthode utile pour évaluer l’apparition et la réparation des DSB dans un système cellulaire 6,7. Cependant, selon les processus moléculaires décrits ci-dessus, étant donné que les foyers γH2AX et 53BP1 devraient co-localiser près des DSB au cours de la DDR8,9, il peut être utile de détecter simultanément la présence de ces marqueurs dans une double immunofluorescence.
Ainsi, le but de ce manuscrit était d’évaluer la pertinence de la quantification simultanée des foyers γH2AX et 53BP1 pour évaluer les dommages génomiques induits dans les lymphocytes périphériques humains par l’agent radiomimétique bléomycine. En utilisant la même méthodologie, nous avons également tenté de délimiter la cinétique de réparation des DSB induites par la bléomycine selon une procédure expérimentale précédemment mise en place10.

<table><tbody><tr><td>AlexaFluor 568 chèvre anti-souris IgG (&gamma ; 1)</td><td>Invitrogen</td><td>A21124</td><td>53BP1 anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Bleoprim</td><td>Sanofi</td><td></td><td>bléomycine sulfate (mutagène)</td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine 100X</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td>antibiotiques pour milieu de culture</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Termofisher</td><td>14200075</td><td>Saline tamponnée au phosphate</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Euroclone</td><td>EC20180L</td><td>Sérum fœtal bovin pour immunofluorescence</td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated</td><td>Termofisher</td><td>#35552</td><td>&gamma ; Anticorps secondaire H2AX</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-53BP1 de souris</td><td>Merck</td><td>MAB 3802</td><td>53BP1 Anticorps primaire</td></tr><tr><td>Labophot 2</td><td></td><td></td><td>Nikon Microscope à fluorescence</td></tr><tr><td>Histone P H2AX (Ser139) Anticorps de lapin</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>#2577</td><td>&gamma ; Anticorps primaire H2AX</td></tr><tr><td>Phytohémoagglutinine</td><td>Termofisher</td><td>R30852801</td><td>composant du milieu de culture</td></tr><tr><td>Réactif anti-décoloration Prolong Gold avec DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>#8961</td><td>Solution anti-décoloration avec DAPI pour contre-coloration</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td>Milieu de culture</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Détergent non ionique pour perméabilisation</td></tr></tbody></table>

double immunofluorescence de γh2ax et 53bp1 dans les lymphocytes périphériques humains

Dual Immunofluorescence of &#947;H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes

Les cassures double brin (DSB) sont l’une des lésions les plus graves qui peuvent survenir dans les noyaux cellulaires et, si elles ne sont pas réparées, elles peuvent entraîner des conséquences graves, y compris le cancer. La cellule est donc dotée de mécanismes complexes pour réparer les DSB, et ces voies impliquent l’histone H2AX sous sa forme phosphorylée à Ser-139 (à savoir γH2AX) et la protéine de liaison p53 1 (53BP1). Comme les deux protéines peuvent former des foyers sur les sites des DSB, l’identification de ces marqueurs est considérée comme une méthode appropriée pour étudier à la fois les DSB et leur cinétique de réparation. Selon les processus moléculaires qui conduisent à la formation des foyers γH2AX et 53BP1, il pourrait être plus utile d’étudier leur co-localisation à proximité des DSB afin de mettre en place une approche alternative permettant de quantifier les DSB par la détection simultanée de deux marqueurs de dommages à l’ADN. Ainsi, ce protocole vise à évaluer les dommages génomiques induits dans les lymphocytes humains par l’agent radiomimétique bléomycine par la présence de foyers γH2AX et 53BP1 dans une double immunofluorescence. En utilisant cette méthodologie, nous avons également délimité la variation du nombre de foyers γH2AX et 53BP1 au fil du temps, comme tentative préliminaire d’étudier la cinétique de réparation des DSB induits par la bléomycine.

Les données obtenues par l’analyse au microscope à fluorescence des lymphocytes périphériques nous permettent d’évaluer trois aspects principaux: l’efficacité du traitement à la bléomycine pour augmenter le nombre de foyers γH2AX et 53BP1 (et donc de DSB) en raison de son effet mutagénique, dans quelle mesure les deux foyers co-localisés sur le site des DSB, et l’évolution temporelle des foyers γH2AX et 53BP1 pour délimiter la cinétique de réparation des DSB induits par la bléomycine. Comme prévu, une fréquence très élev...

Ce protocole présente une méthode pour évaluer la formation et la réparation des cassures double brin d’ADN par la détection simultanée des foyers γH2AX et 53BP1 dans les noyaux interphasiques des lymphocytes périphériques humains traités à la bléomycine.

Double immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 dans les lymphocytes périphériques humains

Double strand breaks (DSBs) are one of the most severe lesions that can occur in cell nuclei, and, if not repaired, they can lead to severe outcomes, ...

L’objectif de ce manuscrit était d’évaluer la pertinence de la quantification simultanée des foyers Gamma H2AX et 53BP1 pour évaluer les dommages génomiques induits dans les lymphocytes périphériques humains par la bléomycine. Plusieurs facteurs peuvent provoquer des ruptures double brin. Les cellules sont ainsi pourvues de plusieurs mécanismes de réparation, impliquant à la fois Gamma H2AX et 53 Binding Protein 1, qui peuvent co-localiser près de la rupture double brin.Après avoir prélevé des échantillons de sang total, ajoutez 300 microlitres d’échantillon dans un tube contenant 4,7 millilitres de milieu complet. Ajoutez ensuite cinq microgrammes par millilitre de concentration finale de sulfate de bléomycine. Pour chaque échantillon, mettez en place un contrôle négatif.Mettez le tube dans un thermostat à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Centrifuger les échantillons à 540 g pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite cinq millilitres de solution hypotonique à la pastille.Ajoutez ensuite 400 microlitres de solution préfixative afin de provoquer une hémolyse. Centrifuger les échantillons à 540 G pendant cinq minutes, puis remettre en suspension la pastille dans cinq millilitres de méthanol à température ambiante pendant au moins 30 minutes pour fixer les cellules. Centrifuger les échantillons à 540 G pendant cinq minutes, puis remettre en suspension la pastille dans cinq millilitres de solution fixatrice.Répétez cette étape une fois de plus. Centrifuger à nouveau à 540 G pendant cinq minutes, puis aspirer le surnageant en laissant suffisamment de solution pour remettre en suspension la pastille. Déposez la pastille de cellule remise en suspension sur les lames.Préparer les deux solutions contenant les anticorps primaires anti-Gamma H2AX et anti-53BP1 dissous dans une solution de blocage. Ensuite, lavez les lames deux fois dans PBS 1X. Gardez ensuite les lames pendant 30 minutes dans une solution bloquante.Ajouter à chaque lame 10 microlitres de chacune des deux solutions contenant les anticorps primaires dissous dans la solution bloquante. Couvrez les diapositives avec du parafilm. Incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Après l’incubation, effectuez trois lavages dans PBS 1X pendant cinq minutes. Préparez les deux solutions contenant les anticorps secondaires DyLight 488 et Alexa Fluor 568 dissous dans une solution bloquante. Ajouter ensuite à chaque lame 10 microlitres de chacune des deux solutions contenant les anticorps secondaires dissous dans la solution de blocage.Couvrir les lames de parafilm et incuber à température ambiante pendant deux heures. Après cette deuxième incubation, effectuez trois lavages dans PBS 1X pendant cinq minutes. Ajouter 2,5 microlitres de solution antidécoloration avec DAPI sur les bordereaux de couvercle avant l’assemblage pour contrer la tache des noyaux.Afin d’évaluer la cinétique des foyers, la procédure est la même que celle décrite ci-dessus. La dernière phase est l’observation et la quantification des foyers. Les lymphocytes humains sans foyers Gamma H2AX et 53BP1 sont représentés dans A, dans B, et dans C, les lymphocytes humains avec différentes quantités de foyers Gamma H2AX et 53BP1 sont montrés.On observe un faible niveau de co-localisation des foyers. Comme prévu, une fréquence très élevée des foyers Gamma H2AX et 53BP1 est observée entre les cellules non traitées non traitées. En outre, une grande différence est observée dans le nombre de foyers des deux marqueurs.L’évolution temporelle des foyers Gamma H2AX et 53BP1 au fil du temps a montré un comportement différent bien qu’ils contribuent à la même fonction. L’analyse des foyers gamma H2AX et 53BP1 a la capacité d’évaluer la réponse cellulaire dans des contextes d’exposition ou pathologiques. Cependant, la double immunofluorescence Gamma H2AX et 53BP1 peut conduire à sous-estimer la fréquence réelle de l’événement.

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