Génération de lignées cellulaires knock-out Protein-E CENP-E-/- associées au centromère à l’aide du système CRISPR/Cas9
23 juin 2023
Cet article rapporte la construction de cellules knock-out de la protéine E associée au centromère (CENP-E) à l’aide du système CRISPR/Cas9 et de trois stratégies de criblage basées sur le phénotype. Nous avons utilisé la lignée cellulaire knock-out CENP-E pour établir une nouvelle approche visant à valider la spécificité et la toxicité des inhibiteurs de CENP-E, ce qui est utile pour le développement de médicaments et la recherche biologique.
La délétion génétique de la kinésine-7 et de la CENP entraîne généralement l’arrêt du cycle cellulaire et la mort cellulaire. La construction de lignées cellulaires stables du CENP est une question importante non résolue en biologie du CENP. Dans cette étude, nous avons généré des cellules HeLa knock-out CENP à l’aide d’un système CRISPR/Cas9 et établi trois stratégies de criblage optimisées.
Récemment, plusieurs technologies d’édition du génome, notamment les nucléases à doigts de zinc, les nucléases effectrices de type activateur de transcription et la façon dont nous fabriquons nos nucléases, ont été conçues pour cliver les génomes à une taille spécifique. La technologie d’inactivation des gènes CRISPR/Cas9 a révolutionné la biologie fondamentale, la biotechnologie et la médecine. Le CENP est essentiel pour fixer les kinétochores aux microtubules et aligner les chromosomes.
La perturbation de CENP, que ce soit par micro-injection d’anticorps, délétion d’ARNsg, inhibition chimique ou délétion génétique, entraîne un désalignement des chromosomes, des défauts mitotiques et souvent la mort cellulaire, compliquant l’étude des mécanismes protéiques CENP. Dans cette étude, trois stratégies de criblage optimisées basées sur le phénotype ont été établies, y compris le criblage des colonies cellulaires, l’alignement des chromosomes des phénotypes et les intensités fluorescentes des protéines CENP, ce qui a amélioré l’efficacité du criblage et le taux de réussite expérimentale. Il est important de noter que la délétion CENP entraîne un désalignement des chromosomes, la localisation anormale des protéines BubR1 et des défauts mitotiques.
Les modes d’interaction et les mécanismes moléculaires de CENP et de ses inhibiteurs sont des domaines de recherche importants en biologie cellulaire et en recherche sur le cancer. Dans cette étude, la lignée cellulaire HeLa knock-out CENP a été établie comme un outil précieux pour la validation de la spécificité et de la toxicité des inhibiteurs de CENP.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cette étude présente la génération réussie de cellules HeLa invalidées pour CENP-E à l'aide du système CRISPR/Cas9 et de stratégies de criblage optimisées. Ces lignées cellulaires invalidées constituent un modèle précieux pour étudier la spécificité et la toxicité des inhibiteurs de CENP-E, ce qui améliore le développement de médicaments et la recherche biologique.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Génétique
- Biologie cellulaire
- Recherche sur le cancer
Contexte
- Le CENP est essentiel au rétablissement des chromosomes et aux processus mitotiques.
- Les méthodes antérieures de suppression du CENP entraînaient souvent un arrêt du cycle cellulaire et la mort cellulaire.
- La technologie CRISPR/Cas9 a révolutionné les approches de l'édition génique.
Méthodes utilisées
- Technologie d'invalidation génique CRISPR/Cas9
- Cellules HeLa comme système biologique
- Stratégies de criblage basées sur le phénotype, incluant l'immunofluorescence et l'extraction d'ADN
Résultats principaux
- Augmentation du mauvais alignement des chromosomes dans les cellules avec invalidation de CENP-E par rapport au type sauvage.
- Réduction significative des niveaux de la protéine CENP-E confirmée par immunofluorescence.
- Des méthodes de criblage efficaces ont optimisé le taux de réussite pour l'identification des cellules invalidées.
Conclusions
- La lignée cellulaire HeLa avec invalidation de CENP-E fournit des informations essentielles sur la fonction et l'inhibition de CENP-E.
- Cette recherche améliore la compréhension des rôles des CENP en biologie du cancer et dans le développement de thérapeutiques potentielles.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La génération de lignées cellulaires HeLa CENP-E-/- par CRISPR/Cas9 permet l'interrogation directe des mécanismes mitotiques et la validation ciblée pour la découverte de médicaments antimitotiques. Ce système modèle répond à des difficultés persistantes dans l'étude des protéines mitotiques essentielles en offrant une plateforme robuste pour l'évaluation de la spécificité et de la toxicité des inhibiteurs de CENP-E. Cette approche renforce la fiabilité prédictive aux stades précoces de la découverte et de l'identification de candidats dans les portefeuilles oncologiques ciblant les voies de division cellulaire.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet la validation fonctionnelle de CENP-E comme cible mitotique grâce à l'ablation complète du gène.
- Contribue à l'atténuation des risques mécanistiques en révélant les conséquences phénotypiques directes de la perte de CENP-E.
- Facilite l'élucidation des voies impliquées dans l'alignement chromosomique et la biologie du point de contrôle du fuseau.
- Améliore la confiance prédictive pour le développement de programmes d'inhibiteurs de CENP-E.
Développement de criblages et de tests
- Fournit un système cellulaire de type knock-out validé pour l'évaluation de la spécificité et de la toxicité des inhibiteurs de CENP-E.
- Standardise les tests phénotypiques à l'aide de mesures de l'alignement des chromosomes et d'intensités de fluorescence.
- Permet une évaluation reproductible et quantitative des anomalies mitotiques dans le cadre de l'analyse de composés.
- Accélère le développement d'essais pour les plates-formes de criblage à contenu élevé ciblant la mitose.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les modèles précliniques avec les mécanismes pertinents de la maladie dans la division des cellules cancéreuses.
- Facilite l'identification de biomarqueurs translationnels en associant la perte de CENP-E à des phénotypes mitotiques.
- Assure une continuité entre les études de validation génétique et celles d'inhibition pharmacologique.
- Réduit les risques liés au développement d'inhibiteurs mitotiques en confirmant leurs effets cellulaires spécifiques à la cible.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce modèle de lignée cellulaire invalidée s'intègre dans le continuum de découverte, depuis la validation précoce de la cible jusqu'à l'identification des composés candidats et les études précliniques sur le mécanisme d'action.
- Biologie de la découverte : Permet le test d'hypothèses nulles concernant la fonction de CENP-E dans la mitose et le contrôle du point de contrôle.
- Criblage : Fournit des cellules avec délétion génique prêtes à l'emploi et reproductibles pour l'évaluation d'inhibiteurs et le criblage phénotypique.
- Analytique : Fournit des données quantitatives telles que les taux de mauvais alignement des chromosomes et la perte d'intensité fluorescente.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre validation génétique et validation pharmacologique pour les candidats médicaments antimiteux.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme cellulaire réutilisable pour la recherche continue sur les cibles mitotiques et le profilage d'inhibiteurs.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles mitotiques.
- Valeur opérationnelle : Normalise et rationalise les flux de travail de criblage phénotypique pour les inhibiteurs mitotiques.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées d'aller ou de ne pas aller de l'avant, ainsi qu'une priorisation efficiente en capital des cibles de division cellulaire.
- Impact sur le portefeuille : Soutient l'avancement ajusté au risque des actifs en oncologie ciblant le mécanisme mitotique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en édition génique CRISPR/Cas9 et en culture de cellules de mammifères.
- Exige un accès à une microscopie à fluorescence, au séquençage de Sanger et aux infrastructures de criblage phénotypique.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de criblage et de validation.
- L'adaptation à d'autres lignées cellulaires ou cibles mitotiques peut nécessiter une optimisation du protocole.
- Les limites potentielles incluent les contraintes liées à la viabilité cellulaire et les effets hors cible inhérents aux modèles de coupure génique.
F.A.Q. sur la bio-pharmacie
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:16
Transfection, Isolation, and Screening of the CENP‐E Knockout HeLa Cells
6:25
Immunofluorescence Staining and High‐Resolution Confocal Microscopy of CRISPR/Cas9‐Mediated CENP‐E Knockout HeLa Cells
9:29
Chromosome Preparation and Karyotype Analysis of CRISPR/Cas9‐Mediated CENP‐E Knockout HeLa Cells
