Name: In vitro Modèle de vaisseau humain fœtal sur puce pour étudier la mécanobiologie du développement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Découvrez la différenciation de cellules endothéliales à partir de cellules souches pluripotentes humaines et leur stimulation mécanique sur puce fluidique. Cette méthode permet d'étudier la mécanobiologie vasculaire in vitro avec une pureté d'environ 85%.

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Ces travaux ont été soutenus par la Research Advanced Grant 2021 de l’Association européenne d’hématologie, le Global Research Award 2021 de l’American Society of Hematology et le Fonds de soutien à la stratégie interne ISSF3 financé par le Welcome Trust et l’Université d’Édimbourg. Nous remercions Fiona Rossi du Flow Cytometry Facility pour son soutien dans l’analyse de la cytométrie en flux. Aux fins du libre accès, l’auteur a appliqué une licence Creative Commons Attribution (CC BY) à toute version du manuscrit accepté par l’auteur découlant de cette soumission.

Différenciation et stimulation mécanique de cellules endothéliales dérivées de hiPSC

<ol><li>Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+before+birth%3A+clues+from+gene+knockouts+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Death before birth: clues from gene knockouts and mutations.</a> Trends in Genetics. 11 (3), 87-93 (1995).</li>
<li>Ji, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circulation Research. 92 (2), 133-135 (2003).</li>
<li>Peacock, H. M., Daems, M., Jones, E. A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+control+of+endothelial+cell+fates+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiac+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic control of endothelial cell fates in development.</a> Cardiac and Vascular Biology. 8, 127-166 (2021).</li>
<li>Chong, D. C., Koo, Y., Xu, K., Fu, S., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+arteriovenous+fate+acquisition+during+mammalian+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stepwise arteriovenous fate acquisition during mammalian vasculogenesis.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2153-2165 (2011).</li>
<li>Jaffredo, T., Gautier, R., Eichmann, A., Dieterlen-Lièvre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraaortic+hemopoietic+cells+are+derived+from+endothelial+cells+during+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Intraaortic hemopoietic cells are derived from endothelial cells during ontogeny.</a> Development. 125 (22), 4575-4583 (1998).</li>
<li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+Tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate Tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li>
<li>Boisset, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+haematopoietic+cells+emerging+from+the+mouse+aortic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium.</a> Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).</li>
<li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+forces+promote+embryonic+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis.</a> Nature. 459 (7250), 1131-1135 (2009).</li>
<li>Diaz, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+forces+promote+blood+development+through+prostaglandin+E2+and+the+cAMP-PKA+signaling+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biomechanical forces promote blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (5), 665-680 (2015).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li>
<li>Lundin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP+regulates+hematopoietic+stem+cell+formation+in+response+to+the+biomechanical+forces+of+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow.</a> Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicry+of+embryonic+circulation+enhances+the+hoxa+hemogenic+niche+and+human+blood+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mimicry of embryonic circulation enhances the hoxa hemogenic niche and human blood development.</a> Cell Reports. 40 (11), 111339(2022).</li>
<li>Azzoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+circulation+triggers+a+metabolic+switch+required+for+endothelial+to+hematopoietic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition.</a> Cell Reports. 37 (11), 110103(2021).</li>
<li>Li, Y. S. J., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 38 (10), 1949-1971 (2005).</li>
<li>Batsivari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+hematopoietic+stem+cell+development+through+functional+correlation+of+their+proliferative+status+with+the+intra-aortic+cluster+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Understanding hematopoietic stem cell development through functional correlation of their proliferative status with the intra-aortic cluster architecture.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1549-1562 (2017).</li>
<li>Canu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+endothelial-to-haematopoietic+transition+at+the+single+cell+level+identifies+cell+cycle+regulation+as+a+driver+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of endothelial-to-haematopoietic transition at the single cell level identifies cell cycle regulation as a driver of differentiation.</a> Genome Biology. 21 (1), 157(2020).</li>
<li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2020).</li>
<li>Yang, C. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+KLF1+enhances+the+differentiation+and+maturation+of+red+blood+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+iPSC+line+capable+of+differentiating+into+functional+macrophages+expressing+ZsGreen%3A+A+tool+for+the+study+and+in+vivo+tracking+of+therapeutic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219(2018).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+human+macrophages+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).</li>
<li>Fidanza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analyses+and+machine+learning+define+hematopoietic+progenitor+and+HSC-like+cells+derived+from+human+PSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs.</a> Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li>
<li>Nguyen, J., Lin, Y. Y., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+generation+of+endothelial+differentiation%3A+Tissue-specific+ECs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The next generation of endothelial differentiation: Tissue-specific ECs.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1188-1204 (2021).</li>
<li>Petazzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+cells+support+the+development+of+human+hematopoietic+progenitors+in+vitro+via+secretion+of+IGFBP2%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Arterial cells support the development of human hematopoietic progenitors in vitro via secretion of IGFBP2.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Crosse, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layered+spatial+transcriptomics+identify+secretory+factors+promoting+human+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Multi-layered spatial transcriptomics identify secretory factors promoting human hematopoietic stem cell development.</a> Cell Stem Cell. 27 (5), 822(2020).</li>
<li>Calvanese, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+human+haematopoietic+stem+cells+from+haemogenic+endothelium+to+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth.</a> Nature. 604 (7906), 534-540 (2022).</li>
<li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+first+hematopoietic+stem+cell+generation+in+human+embryo+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing.</a> Cell Research. 29 (11), 881-894 (2019).</li>
<li>Hwa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+arterial-venous+fusions+and+fate+specification+in+mouse+embryos+lacking+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Abnormal arterial-venous fusions and fate specification in mouse embryos lacking blood flow.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11965(2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Le protocole que nous décrivons ici permet de générer des cellules endothéliales mécanosensibles à partir de cellules souches pluripotentes humaines et d’étudier leur réponse à la stimulation mécanique médiée par une contrainte de cisaillement contrôlée. Ce protocole est entièrement à base de cytokines et entièrement compatible avec les réactifs GMP pour une traduction potentielle dans la production de cellules pour la thérapie cellulaire.
La dérivation des hiPSCs fournit aux scientifiques un modèle instrumental pour les premiers stades du développement embryonnaire qui permet d’étudier des processus qui sont autrement difficiles à étudier in vivo24. En fait, les tissus embryonnaires humains disponibles pour la recherche sont prélevés sur des embryons dépourvus de circulation, ce qui pourrait avoir un impact significatif sur la signature moléculaire contrôlée par des signaux mécaniques. L’approche décrite ici permet l’imagerie en direct et l’étude en temps réel de la réponse cellulaire à la contrainte de cisaillement. La combinaison des hiPSCs avec la fluidique fournit un modèle d’étude qui permet de surmonter la disponibilité limitée et l’inaccessibilité des tissus fœtaux en développement lorsque l’initiation de la circulation remodèle et contrôle l’établissement du système cardiovasculaire et sanguin 3,9,10,25.
L’une des limites du protocole est que les cellules endothéliales dérivées de ce protocole peuvent ne pas refléter les différentes identités des différentes cellules endothéliales présentes dans les tissus en développement. Pour surmonter cette limitation, une combinaison spécifique de cytokines peut être nécessaire au cours du processus de différenciation précédant la stimulation fluidique afin d’obtenir l’identité souhaitée ou le phénotype tissulairespécifique 26. L’isolement des sous-ensembles endothéliaux peut être obtenu à l’aide d’un immunophénotype plus affiné lors de l’étape d’isolement. Ce protocole isole les cellules endothéliales en se basant uniquement sur l’expression de CD34, permettant ainsi l’isolement de la colonne au lieu du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ; Cela réduit la mort cellulaire et le risque de contamination. De plus, ce protocole est spécifiquement conçu pour étudier le rôle de la contrainte de cisaillement médiée par l’écoulement laminaire. D’autres approches fluidiques devront être employées pour étudier l’effet d’autres signaux mécaniques, tels que l’étirement ou la compression, ou d’autres types d’écoulement tels que l’écoulement perturbé ou perturbé.
Nous avons précédemment montré que les cellules endothéliales dérivées des CSPi imitent les identités cellulaires artérioveineuses hétérogènes27 similaires à celles observées dans l’aorte dorsale fœtale28,29,30. Ceci est particulièrement important dans le contexte du développement des vaisseaux et de la spécification cellulaire, dont on sait qu’ils sont contrôlés par la circulation sanguine. Des études dans différents modèles ont montré que l’absence de circulation entraîne une altération de la spécification artérioveineuse11,14,31. Les mécanismes qui relient les signaux mécaniques à la spécification cellulaire sont encore inconnus et le pipeline décrit ici permet d’affiner les études fonctionnelles qui n’ont pas pu être testées in vivo.
Ce pipeline décrit la production et la stimulation de cellules endothéliales dérivées de cellules hiPS à l’aide de canaux fluidiques disponibles dans le commerce, évitant ainsi la nécessité de couler les dispositifs comme pour les dispositifs en polydiméthylsiloxane (PDMS) largement utilisés12. De plus, l’utilisation de puces PDMS rend la collecte des cellules stimulées particulièrement difficile, tandis qu’avec ce protocole, les cellules peuvent être facilement récupérées du canal. Cela améliore considérablement la puissance analytique, ce qui permet des analyses ultérieures telles que des analyses protéomiques et transcriptomiques, la cytométrie en flux et des tests fonctionnels, qui peuvent nécessiter une culture supplémentaire ou des tests in vivo .

Au cours du développement embryonnaire, le cœur est le premier organe à établir une fonctionnalité1, avec des contractions détectables dès le stade le plus précoce de la formation du tube endocardique2. La circulation, ainsi que les signaux mécaniques médiés par le flux sanguin dans le vaisseau, contrôlent de nombreux aspects cruciaux du développement précoce. Avant l’établissement de la circulation fœtale, le système vasculaire est organisé en un plexus capillaire primaire ; Lors du fonctionnement cardiaque, ce plexus se réorganise en vascularisation veineuse et artérielle3. Le rôle des signaux mécaniques dans la spécification artérioveineuse est reflété par l’expression pan-endothéliale des marqueurs artériels et veineux avant l’initiation du flux sanguin4.
Les forces hémodynamiques contrôlent non seulement le développement du système vasculaire lui-même, mais jouent également un rôle fondamental dans le contrôle de la formation des cellules sanguines. Les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) émergent de cellules endothéliales spécialisées appelées endothélium hémogène 5,6,7,8, présentes dans différentes régions anatomiques de l’embryon exclusivement au stade précoce du développement. Des modèles déficients cardiaques, ainsi que des modèles in vitro, ont démontré que les signaux mécaniques instruisent et augmentent la production de HSPC à partir de l’endothélium hémogène 9,10,11,12,13,14.
Il a été démontré que différents types de dynamique d’écoulement contrôlent de manière différentielle le cycle cellulaire15, connu pour être important à la fois dans l’endothélium hémogène 16,17 et dans la spécification des cellules artérielles18. Dans l’ensemble, les signaux mécaniques sont des déterminants essentiels de l’identité et de la fonction cellulaires au cours du développement. De nouveaux dispositifs fluidiques in vitro nous permettent de surmonter les limites liées à l’étude de la mécanobiologie du développement au cours du développement du sang humain in vivo.
L’objectif général du protocole de ce manuscrit est de décrire, étape par étape, le pipeline expérimental pour étudier l’effet de la contrainte de cisaillement sur les cellules endothéliales humaines dérivées in vitro de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). Ce protocole contient des instructions détaillées sur la différenciation des hiPSC en cellules endothéliales et leur ensemencement ultérieur dans des puces fluidiques pour le protocole de stimulation. Grâce à cela, différentes cellules endothéliales dérivées in vitro peuvent être testées pour leur capacité à détecter la contrainte de cisaillement en analysant leur orientation en réponse à l’écoulement. Cela permettra à d’autres laboratoires de répondre à des questions sur la réponse au stress de cisaillement et ses conséquences fonctionnelles sur différentes identités de cellules endothéliales.

<table><tbody><tr><td>Lame non revêtue 0,6 Luer</td><td>ibidi</td><td>IB-80186</td><td></td></tr><tr><td>25 % BSA</td><td>Life Technologies</td><td>A10008-01</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 6 puits</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>Cité comme réactif de dissociation</td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Merck</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>Pipette d’aspiration</td><td>Sardtedt</td><td>86.1252.011</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplément</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Cité comme supplément de culture cellulaire neuronale (50x)</td></tr><tr><td>BD FACS DIVA</td><td>BD Biosciences</td><td>Version 8.0.1</td><td>Cité comme logiciel de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa 5 Laser</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>CD34 Kit de microbilles</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>30-046-702</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PE clone 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>12-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>44-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar surface répulsive cellulaire Plaques 6 puits</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657970</td><td>Cité comme plaque répulsive</td></tr><tr><td>cellulaire CHIR99021</td><td>Cayman Chemicals&nbsp ;</td><td>13122-1mg-CAY</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10&nbsp ; cryoconservation cellulaire</td><td>Merck</td><td>C2874-100ML</td><td>Cité comme solution de cryoconservation</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>VWR</td><td>200-664-3</td><td>Cité comme DMSO</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>DPB Ca2+ Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>EASY Strainer 40 &mu ; m</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life technologies</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>FcR Blocking Reagent</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td>Version 1.53c</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo</td><td></td><td>Version 10.7.1</td><td>Cité comme analyse par cytométrie en flux de tware</td></tr><tr><td>FLT3L</td><td>Peprotech</td><td>300-19-10uG</td><td></td></tr><tr><td>Unité fluidique</td><td>ibidi</td><td>10903</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td>Cité comme supplément de L-glutamine</td></tr><tr><td>Jambon F-12&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Holo-transferrine</td><td>Merk</td><td>T0665-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Sérum humain Albumine</td><td>Fujifilm UK LTD</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Système de pompe</td><td>ibidi</td><td>10902</td><td>Cité comme Système</td></tr><tr><td>de pompe IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>ioLight/Thisle Scientific</td><td>IOL-IO-INVERT</td><td>Cité comme microscope inversé dans l’incubateur</td></tr><tr><td>Lyophilisé BSA&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur MiniMACS</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-102</td><td>Cité comme Séparateur magnétique</td></tr><tr><td>Colonnes MS</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-201</td><td>Cité comme Colonne magnétique</td></tr><tr><td>MTG</td><td>Merck</td><td>M6145-25ML</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplément</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur portable pour système de pompe</td><td>ibidi</td><td>10908</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde 37-41 %</td><td>Fisher Chemicals</td><td>F/1501/PB15</td><td></td></tr><tr><td>Pastette</td><td>Greiner Bio-one</td><td>612398</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Kit de perfusion JAUNE/VERT : 50 cm, ID 1,6 mm, réservoirs de 10 mL</td><td>Ibidi</td><td>IB-10964</td><td>Cité comme Kit de perfusion</td></tr><tr><td>Polystyrène Tubes à fond rond</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td>Cité comme Tubes de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Prism 9</td><td></td><td>Verison 9.4.0</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de contrôle de pompe</td><td>ibidi</td><td>version 1.6.1</td><td>Cité comme Logiciel de pompe</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Tecchonologies des cellules souches</td><td>5872</td><td>Cité comme Solution de détachement</td></tr><tr><td>rhBMP4</td><td>R& D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>rhEPO</td><td>R& D</td><td>287-TC-500</td><td></td></tr><tr><td>rhIGF1</td><td>Peprotech</td><td>100-11-100uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL11</td><td>Peprotech</td><td>200-11-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL3</td><td>Peprotech</td><td>200-03-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL6</td><td>R& D</td><td>206-IL-010</td><td></td></tr><tr><td>rhLaminin-521</td><td>Life technologies</td><td>A29248</td><td>Cité comme Laminin</td></tr><tr><td>rhSCF</td><td>Life Technologies</td><td>PHC2111</td><td></td></tr><tr><td>rhTPO</td><td>R& D</td><td>288-TPN-025</td><td></td></tr><tr><td>rhVEGF</td><td>R& D</td><td>293-VE-010</td><td></td></tr><tr><td>RLT Tampon de lyse</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Connecteur série pour &micro ;-Lames : Stérile, Stérile</td><td>ibidi</td><td>IB-10830</td><td></td></tr><tr><td>StemPro-CD34 Milieu SFM</td><td>Life Technologies</td><td>10639011</td><td>Cité comme Milieu sans sérum pour cellules CD34+ (SFM-34)</td></tr><tr><td>Supplément nutritif StemPro-CD34&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>10641-025</td><td>Cité comme supplément de 34 nutriments</td></tr><tr><td>StemPro hESC SFM</td><td>Life Technologies</td><td>A1000701</td><td>Cité comme milieu de culture&nbsp ;</td></tr><tr><td>Supplément StemPro</td><td>Life Technologies</td><td>A10006-01</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectine (VTN-N) protéine humaine recombinante, tronquée</td><td>Invitrogen</td><td>A31804</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorhydrate</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Cité comme iRock</td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro modèle de vaisseau humain fœtal sur puce pour étudier la mécanobiologie du développement

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

Le cœur est le premier organe à être établi fonctionnellement au cours du développement, initiant ainsi la circulation sanguine très tôt dans la gestation. En plus de transporter l’oxygène et les nutriments pour assurer la croissance du fœtus, la circulation fœtale contrôle de nombreux événements de développement cruciaux qui se déroulent dans la couche endothéliale par le biais de signaux mécaniques. Les signaux biomécaniques induisent des changements structurels des vaisseaux sanguins, établissent la spécification artérioveineuse et contrôlent le développement des cellules souches hématopoïétiques. L’inaccessibilité des tissus en développement limite la compréhension du rôle de la circulation dans le développement humain précoce ; Par conséquent, les modèles in vitro sont des outils essentiels pour l’étude de la mécanobiologie des vaisseaux. Cet article décrit un protocole permettant de différencier les cellules endothéliales des cellules souches pluripotentes induites humaines et leur ensemencement ultérieur dans un dispositif fluidique afin d’étudier leur réponse aux signaux mécaniques. Cette approche permet une culture à long terme de cellules endothéliales sous stimulation mécanique, suivie d’une récupération des cellules endothéliales pour une caractérisation phénotypique et fonctionnelle. Le modèle in vitro établi ici sera déterminant pour élucider les mécanismes moléculaires intracellulaires qui transduisent la signalisation médiée par des signaux mécaniques, qui orchestrent finalement le développement des vaisseaux au cours de la vie fœtale humaine.

Nous décrivons ici un protocole de différenciation et de mécano-stimulation des cellules endothéliales dérivées des hiPSC qui permet d’étudier leur réponse aux signaux mécaniques (Figure 1). Ce protocole aboutit à la production de cellules endothéliales fonctionnellement mécanosensibles. Nous fournissons ici des résultats représentatifs et décrivons le phénotype attendu pour évaluer comment les cellules répondent à la stimulation des cytokines lors de la différenciation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig01v2.jpg"> Figure 1 : Schéma du protocole de différenciation et de stimulation mécanique. Schéma du protocole de différenciation montrant la chronologie des différents mélanges de cytokines, l’isolement des cellules CD34+, l’ensemencement de la puce fluidique et l’analyse finale des cellules stimulées mécaniquement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Culture des hiPSC Il est important de commencer le protocole à partir de hiPSC qui se développent correctement dans des conditions d’auto-renouvellement. Une bonne indication de la qualité de la culture est la vitesse de leur croissance. Après la décongélation, les cellules peuvent avoir besoin de 2 à 3 semaines pour atteindre la phase de croissance correcte qui assurera une bonne différenciation. Lorsque les cellules peuvent être traversées deux fois par semaine dans un rapport de 1 :6 pour atteindre une confluence presque complète, c’est le moment où elles sont prêtes à être différenciées le jour même où elles doivent être traversées.
Différenciation des hiPSCs en cellules endothéliales La première étape de la différenciation, qui consiste en la formation de corps embryoïdes (EB), dépend de la lignée cellulaire et peut nécessiter une certaine optimisation pour la lignée cellulaire spécifique utilisée. La dissociation décrite dans les étapes 1.3.2.2-1.3.2.4 du protocole peut être modifiée en réduisant ou en prolongeant l’incubation avec le réactif de dissociation et la dissociation ultérieure avec la pipette Pasteur. De plus, d’autres réactifs de dissociation peuvent être utilisés pour cette étape en plus de la dissociation physique des colonies à l’aide d’un outil de coupe ou d’une pointe de pipette P100. Les EB de bonne qualité présentent un bord défini au jour 2 de la différenciation et apparaissent clairs et brillants lorsqu’ils sont observés au microscope ; des zones plus foncées peuvent indiquer la mort cellulaire dans les EB (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig2v3.jpg"> Figure 2 : Morphologie des corps embryoïdes. (A) Corps embryoïdes au jour 2 montrant des bords extérieurs bien définis et une taille constante. (B) Corps embryoïdes de mauvaise qualité au jour 2 montrant une mort cellulaire étendue conduisant à une désagrégation de la structure. Barre d’échelle = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Au jour 2, l’ajout de CHIR99021 aux EB inhibe la protéine GSK-3, ce qui entraîne l’activation de la voie Wnt. Différentes lignées cellulaires ont des réponses différentes au traitement par CHIR, et cela devrait être testé en quantifiant le nombre de cellules CD34+ obtenues au jour 8 en utilisant différentes concentrations (figure 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig3v3.jpg"> Figure 3 : Différenciation des cellules endothéliales avec différents traitements CHUR. L’engagement des cellules endothéliales a été quantifié par cytométrie en flux au jour 8 de la différenciation par l’expression membranaire de CD34, après un traitement CHIR au jour 2 à (A) 3 μM, (B) 5 μM et (C) 7 μM. Les données de cytométrie en flux ont été obtenues à l’aide de cytomètres à cinq lasers et d’un logiciel dédié (voir Tableau des matériaux). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Isolement cellulaire CD34+ Il est important de valider que l’enrichissement en CD34+ à l’aide des billes magnétiques fournit au moins 80% de CD34+ après élution de la colonne. Pour assurer une pureté suffisante, une aliquote de cellules obtenues à partir de l’isolement magnétique peut être analysée par cytométrie en flux en veillant à utiliser un clone d’anticorps différent de celui utilisé pour l’enrichissement magnétique. Ici, le clone 4H11 a été utilisé et une pureté de ~85% a été atteinte après enrichissement (Figure 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig4v3.jpg"> Figure 4 : Expression membranaire de CD34 avant et après enrichissement par tri magnétique. Les corps embryoïdes dissociés du jour 8 (en gris) et les cellules après enrichissement magnétique (en vert) ont été colorés pour l’expression de CD34 et analysés par cytométrie en flux, montrant un enrichissement réussi après le tri. Les données de cytométrie en flux ont été obtenues à l’aide de cytomètres à cinq lasers et d’un logiciel dédié (voir Tableau des matériaux). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Ensemencement des cellules dans le canal fluidique Lors de l’ensemencement des cellules dans le canal fluidique, il est crucial de suivre l’adhésion et la prolifération des cellules endothéliales. Après l’ensemencement, les cellules mettent ~5 h pour adhérer complètement au canal (Figure 5A). Une solution de revêtement alternative peut également être testée pour améliorer l’adhérence à ce stade. Pour confirmer que les cellules testées sont mécanosensibles et donc capables de répondre à une stimulation mécanique, l’orientation des cellules peut être testée au fil du temps. Les cellules avant la stimulation présentent une orientation aléatoire (Figure 5A et Figure 5C) et elles se réorientent parallèlement à la direction de l’écoulement (Figure 5B, C). Le protocole décrit ici permet de prélever les cellules du canal pour effectuer une analyse en aval, par exemple une cytométrie en flux, pour l’étude de leur immunophénotype membranaire, fournissant l’identité endothéliale des cellules stimulées (Figure 5D,E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig5v3.jpg"> Figure 5 : Mécano-réactivité des cellules endothéliales dérivées des cellules hiPS. (A) Couche confluente de cellules CD34+ isolées 48 h après l’ensemencement. (B) Couche réorientée de cellules endothéliales 3 jours sous culture dynamique. (C) Analyse d’orientation des cellules endothéliales après 5 jours de culture dynamique. (D) Profil d’expression de CD34 de cellules cultivées sous flux pendant 5 jours. (E) Pourcentage de cellules CD34+ de la population cellulaire extraites du canal fluidique. Les images ont été prises à l’aide d’un microscope inversé dans l’incubateur ; Les données de cytométrie en flux ont été obtenues à l’aide de cytomètres à cinq lasers et d’un logiciel dédié (voir Tableau des matériaux). Barres d’échelle = 100 μm (A,B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Réactifs</td>
			<td>Concentration des stocks</td>
			<td>Volume ajouté</td>
			<td>Concentration finale</td>
		</tr><tr><td>Médium Dulbecco modifié d’Iscove (IMDM)</td>
			<td>-</td>
			<td>333 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Mélange nutritif F-12 de Ham’s (F-12)</td>
			<td>-</td>
			<td>167 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Supplément N-2 (100x)</td>
			<td>100 fois plus tard</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1 fois</td>
		</tr><tr><td>Supplément B-27 (50x)</td>
			<td>50 fois plus tard</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>1 fois</td>
		</tr><tr><td>Acide ascorbique</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>1,25 mL</td>
			<td>25 μg/mL</td>
		</tr><tr><td>α-monothioglycérol (MTG)</td>
			<td>11,5 millions</td>
			<td>19,5 μL</td>
			<td>448,5 μM</td>
		</tr><tr><td>Albumine sérique humaine</td>
			<td>100 mg/mL</td>
			<td>2,5 mL</td>
			<td>0,5 mg/mL</td>
		</tr><tr><td>Holo-Transferrine</td>
			<td>100 mg/mL</td>
			<td>0,75 ml</td>
			<td>150 μg/mL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Composition et recette pour 500 mL de milieu de différenciation sans sérum (SFD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Des journées de différenciation</td>
			<td>Mélange de cytokines</td>
			<td>Cytokine</td>
			<td>Concentration finale</td>
		</tr><tr><td>Jour 0 - 2</td>
			<td>Mélange 1</td>
			<td>Le BMP4</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr><tr><td>Jour 2</td>
			<td>Mélange 2</td>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>7 μM</td>
		</tr><tr><td>À partir du jour 3</td>
			<td rowspan="2">Mélangez 3 et 4</td>
			<td>Le VEGF</td>
			<td>15 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>bFGF</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr><tr><td>À partir du jour 6</td>
			<td rowspan="8">Mélange 4</td>
			<td>IL6</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>FLT3L</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>L’IGF1</td>
			<td>25 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL11</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>SCF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>OEB</td>
			<td>3 U/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>TPO</td>
			<td>30 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL3</td>
			<td>30 ng/mL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Mélanges de cytokines utilisées pour la différenciation des cellules endothéliales, jours pendant lesquels elles sont ajoutées au milieu SFD et concentration finale.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Contrainte de cisaillement (dyn/cm2)</td>
			<td>Temps (h)</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>Jusqu’à la fin de l’expérience</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 3 : Valeurs des contraintes de cisaillement pour la culture dynamique et la durée de leur application.
Figure supplémentaire S1 : Géométrie et dimensions de la puce et du tube utilisés pour ce protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/SF1.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S2 : Guide étape par étape pour le logiciel de commande de la pompe à air avec une description de chaque étape. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_Supp%20Figure%20S2%20FINAL.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S3 : Guide pour l’analyse d’orientation à l’aide de FIDJI montrant le dessin de la forme de la cellule, l’ajustement elliptique et la mesure finale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_SF3.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire S1 : Taille de l’unité, volume de remise en suspension et concentrations de la souche pour les cytokines utilisées dans le protocole de différenciation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/Ventura%20et%20al,%202023%20-%20Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Il s’agit d’un flux de travail simple permettant de différencier les cellules endothéliales des cellules souches pluripotentes humaines, suivi d’un protocole détaillé pour leur stimulation mécanique. Cela permet d’étudier la mécanobiologie du développement des cellules endothéliales. Cette approche est compatible avec les dosages en aval de cellules vivantes prélevées sur la puce de culture après stimulation mécanique.

In vitro Modèle de vaisseau humain fœtal sur puce pour étudier la mécanobiologie du développement

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Notre recherche explore comment les signaux mécaniques instruisent le destin des cellules endothéliales au cours du développement, pour lequel nous combinons la différenciation des cellules souches pluripotentes induite par l’homme avec la stimulation mécanique à médiation fluidique. Les cellules endothéliales sont constamment exposées au mouvement du sang, de sorte que des signaux importants sont manqués dans la culture statique, ce qui en fait le principal défi de l’étude de la biologie des cellules endothéliales à l’aide de systèmes de culture traditionnels. Les signaux mécaniques, en fait, activent de nombreuses voies de signalisation cruciales qui pourraient être négligées dans les cellules cultivées dans des conditions statiques.Notre protocole fournit un guide facile, étape par étape, sur la façon de différencier et de stimuler mécaniquement les cellules endothéliales pluripotentes induites dérivées de cellules souches. Cela aidera de nombreux laboratoires à adopter une culture thermique pour répondre facilement aux questions sur le comportement des cellules endothéliales lorsqu’elles sont sous flux.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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