Name: Identification de peptides de petites vésicules extracellulaires à partir de macrophages dérivés de la moelle osseuse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Découvrez l'isolement de petites vésicules extracellulaires à partir de macrophages par ultracentrifugation différentielle et l'identification du peptidome par spectrométrie de masse LC-MS/MS. Cette méthode révèle les fonctions biologiques des peptides dans l'immunité innée.

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Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation des sciences naturelles de Chine (3157270). Nous remercions le Dr Feng Shao (Institut national des sciences biologiques, Chine) pour la mise à disposition de l’iBMDM.

Isolement de petites vésicules extracellulaires et extraction de leur peptidome

<ol><li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology%2C+function%2C+and+biomedical+applications+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li>
<li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+secreted+vesicles+and+intercellular+communications%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> F1000 Biology Reports. 3, 15(2011).</li>
<li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+PD-L1+contributes+to+immunosuppression+and+is+associated+with+anti-PD-1+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response.</a> Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).</li>
<li>Ti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS-preconditioned+mesenchymal+stromal+cells+modify+macrophage+polarization+for+resolution+of+chronic+inflammation+via+exosome-shuttled+let-7b%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 308(2015).</li>
<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+S100A4+derived+from+highly+metastatic+hepatocellular+carcinoma+cells+promotes+metastasis+by+activating+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187(2021).</li>
<li>Xun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-derived+exosomal+miR-138-5p+modulates+polarization+of+tumor-associated+macrophages+through+inhibition+of+KDM6B%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B.</a> Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).</li>
<li>Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+cancer+development+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Exosomes in cancer development and clinical applications.</a> Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).</li>
<li>Mashouri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+composition%2C+biogenesis%2C+and+mechanisms+in+cancer+metastasis+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 75(2019).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress%2C+opportunity%2C+and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome%3A+A+review+of+its+classification%2C+isolation+techniques%2C+storage%2C+diagnostic+and+targeted+therapy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications.</a> International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).</li>
<li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+toward+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).</li>
<li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+exosome+isolation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li>
<li>Palanski, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+urine+peptidomics+workflow+identifies+chemically+defined+dietary+gluten+peptides+from+patients+with+celiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease.</a> Nature Communications. 13, 888(2022).</li>
<li>Kalaora, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+bacteria-derived+HLA-bound+peptides+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma.</a> Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).</li>
<li>Hamley, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+bioactive+peptides+for+biomaterials+design+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics.</a> Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).</li>
<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+proteolysis+of+bioactive+peptides+using+a+peptidomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach.</a> Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).</li>
<li>Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidome%3A+Chaos+or+inevitability%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Peptidome: Chaos or inevitability.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128(2021).</li>
<li>Keller, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoy+exosomes+provide+protection+against+bacterial+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins.</a> Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).</li>
<li>Koeppen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Let-7b-5p+in+vesicles+secreted+by+human+airway+cells+reduces+biofilm+formation+and+increases+antibiotic+sensitivity+of+P.+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118(2021).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Lors de l’étude de la fonction des sEV, il est impératif d’obtenir des sEV de haute pureté à partir d’échantillons biologiques complexes afin d’éviter toute contamination potentielle. Diverses méthodes d’isolement des sEVs ont été mises au point13 et, parmi ces méthodes, les méthodes basées sur l’ultracentrifugation différentielle ont montré une pureté relativement élevée des sEV. Dans cette étude, 200 mL de surnageant cellulaire ont été prélevés pendant 6 h, et environ 200 à 300 μg de sEV ont été...

De petites vésicules extracellulaires (sEV) d’un diamètre inférieur à 200 nm sont présentes dans presque tous les types de fluides corporels et sécrétées par toutes sortes de cellules, y compris l’urine, la sueur, les larmes, le liquide céphalo-rachidien et le liquide amniotique1. Initialement, les sEV étaient considérés comme des réceptacles pour l’élimination des déchets cellulaires, ce qui a conduit à un minimum de recherches au cours de la décennie suivante2. Récemment, de plus en plus de preuves indiquent que les sEV contiennent des protéines, des lipides, des acides nucléiques et d’autres métabolites spécifiques. Ces molécules sont transportées vers les cellules cibles3, contribuant à la communication intercellulaire, à travers laquelle elles participent à divers processus biologiques, tels que la réparation des tissus, l’angiogenèse, l’immunité4 et l’inflammation5,6, le développement tumoral et les métastases 7,8,9, etc.
Pour faciliter l’étude des sEV, il est impératif d’isoler les sEV à partir d’échantillons complexes. Différentes méthodes d’isolement des sEVs ont été développées en fonction des propriétés physiques et chimiques des sEV, telles que leur densité, leur taille de particules et leurs protéines marqueurs de surface. Ces techniques comprennent des méthodes basées sur l’ultracentrifugation, des méthodes basées sur la taille des particules, des méthodes basées sur la capture de l’immunoaffinité, des méthodes basées sur la précipitation des sEV et des méthodes basées sur la microfluidique10,11,12. Parmi ces techniques, la méthode basée sur l’ultracentrifugation est largement reconnue comme l’étalon-or pour l’isolation des sEVs et est la technique la plus couramment utilisée13.
De plus en plus de preuves suggèrent la présence d’une multitude de peptides biologiquement actifs non découverts dans les peptidomes de divers organismes. Ces peptides contribuent de manière significative à de nombreux processus physiologiques en régulant la croissance, le développement, la réponse au stress 14,15 et la transduction du signal16. L’objectif du peptidome des sEVs est de découvrir les peptides portés par ces sEVs et de fournir des indices sur leurs fonctions biologiques. Nous présentons ici un protocole d’isolement des sEVs par ultracentrifugation différentielle, suivi de l’extraction des peptides de ces sEVs pour une analyse plus approfondie de leur peptidome.

<table><tbody><tr><td>Kit de dosage des protéines BCA</td><td>Beyotime Technology</td><td>P0012</td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td>Beyotime Technology</td><td>AF1192</td><td></td></tr><tr><td>Tube filtrant centrifuge</td><td>Millipore</td><td>UFC5010BK</td><td></td></tr><tr><td>Bouteilles de centrifugeuse en polypropylène</td><td>Beckman Coulter</td><td>357003</td><td>Centrifugeuse à grande vitesse</td></tr><tr><td>Substrat chimiluminescent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Solarbio</td><td>D8220</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Milieu de culture DMEM</td><td>Cell World</td><td>N ? A</td><td></td></tr><tr><td>GRP94</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>20292</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse à grande vitesse</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti JXN-26</td><td>Rotor de centrifugeuse (JA-25.50)</td></tr><tr><td>Macrophages dérivés de la moelle osseuse immortalisés (iBMDM)</td><td>Institut national des sciences biologiques, Chine</td><td></td><td>Fourni par le Dr Feng Shao (Institut national des sciences biologiques, Chine)</td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>Sigma</td><td>l1149</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Tube microfuge en polypropylène</td><td>Beckman Coulter</td><td>357448</td><td>1,5 mL, Ultracentrifugeuse de table&nbsp ;</td></tr><tr><td>système LC nano-haute performance</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EASY-nLC 1000</td><td></td></tr><tr><td>Analyse de suivi des nanoparticules&nbsp ;</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight NTA3.4</td></tr><tr><td>Spectromètre de masse Orbitrap Q Exactive HF-X Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger Polyallomer</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>Ultracentrifuge</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase</td><td>Bimake</td><td>B14002</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur sous vide SpeedVac</td><td>Eppendorf</td><td>Concentrator plus</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse de table</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima MAX-XP</td><td>Rotor d’ultracentrifugeuse (TLA 55)</td></tr><tr><td>Microscope électronique à transmission</td><td>HITACHI</td><td>H-7650B</td><td></td></tr><tr><td>TSG101</td><td>Sigma</td><td>AF8258</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima XPN-100</td><td>Rotor d’ultracentrifugeuse (SW32 Ti)</td></tr><tr><td>Perturbateur cellulaire à ultrasons</td><td>Scientz</td><td>SCIENTZ-IID</td><td></td></tr><tr><td>Imageur Western Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>ChemiDocXRs</td><td>Image lab 4.0 (beta 7)</td></tr><tr><td>&beta ;-actine</td><td>Sigma</td><td>A3853</td><td></td></tr></tbody></table>

identification de peptides de petites vésicules extracellulaires à partir de macrophages dérivés de la moelle osseuse

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) sont généralement sécrétées par l’exocytose des corps multivésiculaires (MVB). Ces nanovésicules d’un diamètre de <200 nm sont présentes dans divers fluides corporels. Ces sEV régulent divers processus biologiques tels que la transcription et la traduction des gènes, la prolifération et la survie des cellules, l’immunité et l’inflammation par le biais de leurs cargaisons, telles que les protéines, l’ADN, l’ARN et les métabolites. À l’heure actuelle, diverses techniques ont été mises au point pour l’isolation des sEV. Parmi eux, la méthode basée sur l’ultracentrifugation est considérée comme l’étalon-or et est largement utilisée pour l’isolation des sEV. Les peptides sont naturellement des biomacromolécules de moins de 50 acides aminés de longueur. Ces peptides participent à une variété de processus biologiques ayant une activité biologique, tels que les hormones, les neurotransmetteurs et les facteurs de croissance cellulaire. Le peptidome est destiné à l’analyse systématique des peptides endogènes dans des échantillons biologiques spécifiques par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). Ici, nous avons introduit un protocole permettant d’isoler les sEVs par ultracentrifugation différentielle et d’extraire le peptidome pour l’identification par LC-MS/MS. Cette méthode a permis d’identifier des centaines de peptides dérivés de sEVs à partir de macrophages dérivés de la moelle osseuse.

Pour les sEVs isolés par ultracentrifugation différentielle (Figure 1), nous avons évalué leur morphologie, leur distribution granulométrique et leurs marqueurs protéiques selon l’International Society for Extracellular Vesicules (ISEV)17.
Tout d’abord, la morphologie des sEVs a été observée par MET, montrant une structure typique en forme de coupe (Figure 2A). NTA a montré que les sEV isolés étaient principale...

Ce protocole décrit une procédure permettant d’isoler de petites vésicules extracellulaires des macrophages par ultracentrifugation différentielle et d’extraire le peptidome pour l’identification par spectrométrie de masse.

Identification de peptides de petites vésicules extracellulaires à partir de macrophages dérivés de la moelle osseuse

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...

Nous explorons les rôles fonctionnels des vésicules extracellulaires dans l’immunité innée. Nous avons développé un protocole permettant d’isoler de petites vésicules extracellulaires, ou sEVs, par ultracentrifugation différentielle et d’identifier le peptidome par LC-MS/MS, révélant les fonctions biologiques clés des peptides dans les sEVs. Il a été démontré que les vésicules extracellulaires interviennent dans la communication intercellulaire en transportant la cargaison vers les cellules réceptrices, telles que les protéines, les lipides et les acides nucléiques.En libérant des composants antimicrobiens, ils agissent comme la première ligne de défense contre les microbes envahisseurs dans l’immunité innée. Bien que l’ultracentrifugation différentielle produise de petits sEV extracellulaires très purs, elle peut prendre beaucoup de temps et se traduit souvent par de faibles rendements. Dans notre étude, il s’agit de défis majeurs pour l’identification stable des peptides de faible abondance dans les sEVs.

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Découvrez l'isolement de petites vésicules extracellulaires à partir de macrophages par ultracentrifugation différentielle et l'identification du peptidome par spectrométrie de masse LC-MS/MS. Cette méthode révèle les fonctions biologiques des peptides dans l'immunité innée.

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