Name: Analyse des protéines de la cellule hôte à l’aide de billes d’enrichissement couplées à une digestion limitée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Découvrez une méthode sensible d'enrichissement des protéines de la cellule hôte à l'aide de billes d'enrichissement couplées à une digestion limitée. Cette approche améliore la détection par LC-MS des protéines à faible abondance dans les produits biopharmaceutiques.

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Les abréviations utilisées dans le protocole sont énumérées dans le tableau supplémentaire 1.
1. Préparation des solutions et des tampons
REMARQUE : Les détails commerciaux de tous les réactifs sont répertoriés dans le tableau des matériaux.
<ol><li>Préparer une solution de Tris-HCl à 0,1 M, pH 8,0 en ajoutant 1 mL de Tris-HCl à pH 8,0 dans 9 mL d’eau déminéralisée dans un flacon en verre, et bien mélanger par vortex. Conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois.</li>
	<li>Préparer 24 mM de désoxycholate de sodium (SDC) en dissolvant 10 mg de SDC dans 1 mL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.</li>
	<li>Préparer 24 mM de lauroylsarcosinate de sodium (SLS) en dissolvant 7 mg de SLS dans 1 mL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.</li>
	<li>Préparer le tampon d’élution en mélangeant 24 mM de SDC et 24 mM de SLS dans un rapport de 1 :1 (v/v).</li>
	<li>Préparer 50 ng/μL de solution de trypsine en ajoutant 400 μL d’eau déminéralisée dans 20 μg de trypsine.</li>
	<li>Préparer 25 mg/mL de dithiothréitol (DTT) en ajoutant 308 μL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, dans 7,7 mg de DTT.</li>
	<li>Préparer 0,25 M d’iodoacétamide (IAM) en ajoutant 1,2 mL de 0,1 M de Tris-HCl, pH 8,0, dans 56 mg d’IAM.</li>
	<li>Préparer 10 % d’AGT en ajoutant 1 mL d’acide trifluoroacétique (AGT) dans 9 mL d’eau déminéralisée. Tourbillonner pendant 4 s et faire tourner vers le bas. Conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois.</li>
	<li>Préparer le tampon A en ajoutant 1 mL d’AGT à 10 % dans 99 mL d’eau déminéralisée.</li>
	<li>Préparer le tampon B en ajoutant 1 mL d’AGT à 10 % et 49 mL d’eau déminéralisée dans 50 mL d’acétonitrile (ACN).</li>
	<li>Préparez 10 mM de tampon d’histidine en ajoutant 37 mg de L-histidine et 54,8 mg de monochlorhydrate de L-histidine monohydraté dans 50 mL d’eau.</li>
</ol>2. Préparation de solutions d’anticorps monoclonaux (mAb)
<ol><li>Pour les produits médicamenteux dont les concentrations sont supérieures à 50 mg/mL, diluer 15 mg d’anticorps monoclonaux (mAb) (voir le tableau des matériaux) avec de l’eau déminéralisée dans un tube de microcentrifugation de 2 mL, ce qui donne un volume total de 300 μL et un pH final de ~6. Si nécessaire, ajustez le pH à l’aide d’acide acétique ou de Tris-HCl.</li>
	<li>Pour les produits pharmaceutiques dont les concentrations sont inférieures à 50 mg/mL, effectuer un échange de tampon en suivant les étapes 2.2.1 à 2.2.5.<ol><li>Transférer 20 mg de chaque échantillon dans un dispositif de filtration centrifuge 10k (voir le tableau des matériaux) et centrifuger à 14 000 x g pendant 25 min (à température ambiante, RT) jusqu’à ce qu’il reste environ 100 μL de volume.</li>
		<li>Ajouter 350 μL d’histidine à 10 mM (voir le tableau des matériaux), un tampon pH 6,0 dans le filtre, le vortex et la centrifugeuse à 14 000 x g pendant 25 min à RT. Répétez l’opération une fois.</li>
		<li>Retournez le filtre et placez-le dans le tube de prélèvement, puis centrifugez les échantillons à 1000 x g pendant 5 min à RT pour récupérer tout le volume dans le tube de prélèvement. Lavez le filtre avec 200 μL de tampon d’histidine 10 mM et pipetez de haut en bas pour récupérer les échantillons de protéines restants. Transférez l’ensemble de la solution dans le même tube de collecte, le même vortex et essorez-le.</li>
		<li>Mesurez la concentration de l’échantillon à l’aide de NanoDrop. Ajustez la concentration de chaque échantillon de protéine à 50 mg/mL en ajoutant le tampon d’histidine avant l’incubation avec des billes d’enrichissement.</li>
		<li>Transvaser 300 μL de l’échantillon dans un tube de microcentrifugation de 2 mL.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Préparation des billes d’enrichissement du protéome
<ol><li>Retirez les capuchons supérieur et inférieur de chaque colonne d’essorage obtenue à partir de la trousse d’enrichissement en protéines du commerce (voir le tableau des matériaux). Ne jetez pas les bouchons, car ils seront utilisés plus tard.</li>
	<li>Prenez la colonne d’essorage et placez-la dans un tube de microcentrifugation de 2 ml sans bouchon. Centrifugez l’installation à température ambiante et 1 000 x g pendant 30 à 60 s à RT afin d’éliminer la solution de stockage. Éliminez le matériel collecté au cours de cette étape.</li>
	<li>Ajouter un tampon de lavage de 200 μL aux billes d’enrichissement disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux) et pipeter plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Placez la colonne d’essorage dans un tube de microcentrifugation de 2 mL et centrifugez à 1 000 x g pendant 30 à 60 s à RT pour retirer le tampon. Jetez le matériel collecté. REMARQUE : Le tampon de lavage est inclus dans le kit d’enrichissement en protéines du commerce.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.3 deux fois.</li>
	<li>Replacez le capuchon inférieur et ajoutez 200 μL d’eau, puis replacez le capuchon supérieur.</li>
</ol>4. Enrichissement en protéines
<ol><li>Pipeter la boue de haut en bas (à partir de l’étape 3.5) et transférer 40 μL de boue dans l’échantillon préparé à l’étape 2. Incuber et faire tourner le tube à température ambiante pendant 2 h.</li>
	<li>Fabriquez une pointe avec de la fritte (voir le tableau des matériaux) à l’aide de l’aiguille de 16 G pour obtenir la taille de fritte appropriée, puis insérez-la dans l’extrémité de la pointe de la pointe de 200 μL.</li>
	<li>Transférez l’échantillon avec les billes sur la pointe préparée à l’étape 4.2. Centrifuger l’embout avec un tube de microcentrifugation de 2 mL à 200 x g pendant 3 min à RT pour éliminer la solution.</li>
	<li>Lavez les billes en ajoutant 200 μL de tampon de lavage à l’embout et centrifugez l’embout avec un tube de microcentrifugation de 2 mL à 200 x g pendant 2 min à RT pour éliminer la solution de lavage. Répétez l’étape deux fois.</li>
	<li>Lavez les billes en ajoutant 200 μL d’eau à l’embout et centrifugez l’embout avec un tube de microcentrifugation de 2 mL à 200 x g pendant 2 min à RT pour éliminer l’eau.</li>
	<li>Éluer les protéines des billes en ajoutant 10 μL de tampon d’élution (étape 1.4) dans la pointe, et pipeter la boue dix fois dans la pointe pour s’assurer que les billes sont imbibées de tampon d’élution.</li>
	<li>Centrifuger l’embout à l’aide d’un nouveau tube de microcentrifugation de 0,5 mL à 200 x g pendant 30 s à RT pour recueillir l’éluant. Répétez deux fois les étapes 4.6 à 4.7 et combinez toutes les élutions dans un tube de microcentrifugation de 0,5 mL.</li>
	<li>Ajouter 1,5 μL de solution de trypsine (étape 1.5) dans l’éluant pour une digestion nocturne à 28 °C. Ajouter 1,5 μL de DTT à 25 mg/mL (étape 1.6) et chauffer l’échantillon à 90 °C pendant 20 min.</li>
	<li>Ajouter 1,5 μL de 0,25 M IAM (étape 1.7) et incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 20 min. Ajouter 3,5 μL 10 % TFA (étape 1.8), vortex pendant 2 min et s’assurer que le pH est à ~2-3.</li>
	<li>Centrifuger à 14 400 × g pendant 10 min à RT pour précipiter le SDC et le SLS. Récupérez le surnageant pour le dessalage.</li>
	<li>Effectuez le dessalage en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Ajouter 50 μL de tampon B (étape 1.10) à la pointe de dessalage GC (voir le tableau des matériaux). Centrifuger l’embout à l’aide d’un support à 1000 x g pendant 3 min à RT. Jeter le matériau collecté.</li>
		<li>Ajouter 50 μL de tampon A (étape 1.9) à l’embout. Centrifuger l’embout à l’aide d’un support à 1000 x g pendant 3 min à RT. Jeter le matériau collecté.</li>
		<li>Ajouter l’échantillon acidifié à la pointe. Centrifuger l’embout à l’aide d’un support à 500 x g pendant 6 min à RT. Jeter le matériau collecté.</li>
		<li>Lavez l’embout en ajoutant 50 μL de tampon A à l’embout. Centrifuger l’embout avec le support à 500 x g pendant 3 min à RT. Jeter le matériau collecté. Répétez l’opération une fois.</li>
		<li>Éluer le peptide de l’embout en ajoutant 50 μL de tampon B à l’embout de dessalage GC. Centrifuger l’embout avec un nouveau tube à 500 x g pendant 3 min à RT. Récupérez le matériau. Répétez l’étape une fois et combinez l’éluant.</li>
		<li>Séchez l’éluant à l’aide d’un concentrateur sous vide (voir tableau des matériaux).</li>
	</ol></li>
	<li>Remettre l’éluant séché en suspension dans 30 μL de solution d’acide formique (AG) à 0,1 %.</li>
	<li>Mesurer l’UV des mélanges peptidiques à 214 nm à l’aide d’un spectrophotomètre (voir Tableau des matériaux). La concentration des mélanges peptidiques doit se situer entre 0,1 et 0,5 mg/mL.</li>
	<li>Transférez 10 μL de chaque échantillon digéré dans un flacon d’échantillon LC, puis injectez 1 μg de chaque échantillon digéré sur nano LC-MS/MS (voir le tableau des matériaux). Effectuez l’analyse en suivant l’étape 5. Conservez le reste des échantillons digérés dans un congélateur à -80 °C.</li>
</ol>5. Analyse Nano LC-MS/MS
<ol><li>Injecter le mélange peptidique dans un système nano-LC couplé à un spectromètre de masse. Charger les mélanges peptidiques (~1 μg) sur une colonne piège C18 avec le gradient indiqué dans le tableau 1A pour le dessalage, puis sur une colonne analytique C18 à 40 °C pour la séparation. NOTA : Le tampon mobile de la phase A était composé de 0,1 % d’AG dans de l’eau ultra-pure, et la phase mobile B était composée de 0,1 % d’AG dans 80 % d’ACN.</li>
	<li>Séparez les peptides et éluez avec le gradient fourni dans le tableau 1B avec un débit de 250 nL/min. REMARQUE : Le spectromètre de masse a fonctionné en mode dépendant des données (DDA) avec un temps de cycle de 3 s. Les ions ont subi une fragmentation par dissociation collisionnelle (HCD) à plus haute énergie avec une énergie de collision normalisée de 30 % pour chaque balayage MS complet. Les balayages ont été effectués à une résolution de 60 000, avec une cible de contrôle automatique du gain (AGC) de 3e6, un temps d’injection maximal de 20 ms et une plage m/z de 380 à 1600. Les événements MS/MS ont été menés à une résolution de 15 000, avec une cible AGC de 1e5, un temps d’injection maximal de 60 ms et une plage m/z de 200-2000. La durée d’exclusion a été fixée à 45 s. Les propriétés de la source d’ions sont fournies dans le tableau 1C, et les paramètres spécifiques de la spectrométrie de masse peuvent être trouvés dans le tableau 2A-F.</li>
</ol>6. Analyse des données
<ol><li>Effectuez une recherche dans les fichiers bruts de la spectrométrie de masse NISTmAb dans la base de données mus+musculus d’UniProt29. De plus, recherchez les fichiers bruts de spectrométrie de masse DS à base d’anticorps monoclonaux à base de données UniProt Cricetulus Griseus30. NOTE : Ces recherches ont été effectuées dans le logiciel Proteome Discoverer (voir la table des matériaux) à l’aide des moteurs de recherche Sequest HT et Mascot. Les bases de données utilisées étaient exemptes d’entrées redondantes.</li>
	<li>Pour les recherches par spectrométrie de masse, appliquez une tolérance de masse de 10 ppm et définissez la tolérance de masse des fragments sur 0,02 Da. NOTE : Les critères de recherche englobaient la carbamidométhylation statique des résidus de cystéine (+57,0214 Da) et la modification variable de l’oxydation (+15,9949 Da) sur les résidus de méthionine. De plus, une modification variable de la désamination (+0,984 Da) a été appliquée.</li>
	<li>Effectuez la recherche dans la base de données à l’aide de la digestion de la trypsine, en permettant un maximum de deux clivages manqués. Définissez les taux de fausses découvertes pour les protéines et les peptides à 0,01. REMARQUE : Pour identifier avec certitude les protéines de la cellule hôte (HCP), une exigence minimale d’au moins deux peptides uniques a été appliquée. Le tableau 3 fournit un résumé représentatif des professionnels de la santé identifiés associés aux anticorps monoclonaux du NIST analysés par le logiciel Proteome Discoverer.</li>
</ol>

Enrichissement de protéines de cellules hôtes dans des produits médicamenteux à base d’anticorps monoclonaux

<ol><li>Aboulaich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+monitor+clearance+of+host+cell+proteins+associated+with+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies.</a> Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).</li>
<li>Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+protein+removal+from+biopharmaceutical+preparations%3A+Towards+the+implementation+of+quality+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design.</a> Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).</li>
<li>Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+host+cell+protein+product-associated+impurities+in+monoclonal+antibody+bioprocessing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing.</a> Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).</li>
<li>Molden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+protein+profiling+of+commercial+therapeutic+protein+drugs+as+a+benchmark+for+monoclonal+antibody-based+therapeutic+protein+development%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development.</a> MAbs. 13 (1), 1955811(2021).</li>
<li>Bee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+levels+of+the+CHO+host+cell+protease+cathepsin+D+caused+particle+formation+in+a+monoclonal+antibody+product%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product.</a> Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).</li>
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<li>Gilgunn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+tracking+of+problematic+host+cell+proteins+removed+by+a+synthetic%2C+highly+functionalized+nonwoven+media+in+downstream+bioprocessing+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies.</a> Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).</li>
<li>Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+polysorbate-degrading+enzymes+in+a+monoclonal+antibody+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).</li>
<li>Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysorbates+20+and+80+degradation+by+group+XV+lysosomal+phospholipase+A2+isomer+X1+in+monoclonal+antibody+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).</li>
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<li>Madsen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+complete+characterization+of+host+cell+proteins+in+biotherapeutics+via+affinity+depletions%2C+LC-MS%2FMS%2C+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis.</a> MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).</li>
<li>Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+sensitive+method+for+deep+profiling+of+host+cell+proteins+in+therapeutic+antibodies+by+combining+ultra-low+trypsin+concentration+digestion%2C+long+chromatographic+gradients%2C+and+boxcar+mass+spectrometry+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition.</a> Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).</li>
<li>Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+LC-MS-Based+workflow+with+robust+0.1+ppm+sensitivity+for+identifying+residual+HCPs+in+biotherapeutic+products%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products.</a> Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).</li>
<li>Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+tracking+of+host+cell+proteins+during+monoclonal+antibody+purifications+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry.</a> MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+phospholipase+B-Like+2+is+not+responsible+for+polysorbate+degradation+in+monoclonal+antibody+drug+products%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).</li>
<li>Zhang, J., He, J., Smith, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acids+can+induce+the+formation+of+proteinaceous+particles+in+monoclonal+antibody+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).</li>
<li>Uniprot1. , https://www.uniprot.org/uniprotkb?query=mus%2Bmusculus (2023).</li>
<li>Uniprot2. , https://www.uniprot.org/uniprotkb (2023).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Il existe deux versions de billes d’enrichissement en protéines disponibles dans le commerce : l’une avec une plus petite capacité et l’autre avec une plus grande capacité (voir le tableau des matériaux). Les deux versions des billes d’enrichissement contiennent dix préparations dans l’emballage. Les instructions du fabricant suggèrent que chaque préparation du kit de petite capacité peut être utilisée pour enrichir 10 mg de protéines totales. Cependant, pour une performance optimale de l’enrichissement en protéines de la cellule hôte (HCP) à partir de DS, chaque préparation est bonne pour cinq échantillons de DS. Par conséquent, chaque kit peut être utilisé pour enrichir les professionnels de la santé à partir d’une cinquantaine d’échantillons. Pour chaque préparation du kit de grande capacité, il est bon pour l’enrichissement des HCP à partir de vingt-cinq échantillons DS, permettant la détection des HCP à partir d’un total de deux cent cinquante échantillons.
L’étape 3.1 déconseille de jeter les capuchons supérieurs ou inférieurs, car ils seront réutilisés tout au long du protocole. Si des billes se déposent dans le capuchon supérieur, remplacez-les après avoir retiré le bouchon inférieur et centrifugé tout en gardant le capuchon supérieur sur la colonne. Pour utiliser le capuchon inférieur comme bouchon, retournez-le et positionnez-le solidement au bas de la colonne d’essorage.
Une étape critique de la procédure est l’étape 4.1, où la boue de billes se dépose au fond du tube. Par conséquent, il est crucial de maintenir un pipetage continu de haut en bas lors du transfert de la boue dans les échantillons d’anticorps monoclonaux (mAb). Une autre étape critique est l’étape 4.6, où il est essentiel de pipeter la boue dix fois à l’intérieur de la pointe pendant que les billes sont saturées de tampon d’élution. La durée de la centrifugation aux étapes 4.3-4.5, 4.7 et 4.10 peut varier en fonction de la quantité de protéines accumulées dans les cellules hôtes (HCP). Par conséquent, il est crucial de vérifier et de s’assurer que les liquides de la pointe ont été correctement essorés avant de passer à l’étape suivante. Encore une fois, lorsque l’on commence avec une quantité initiale de 15 mg d’anticorps-médicament, environ 30 μg d’anticorps et de protéines de cellules hôtes enrichies (HCP) peuvent être élués. Pour obtenir un rapport protéine/enzyme de 400 :1 pour une digestion limitée, 75 ng de trypsine ont été ajoutés. Lorsqu’une plus faible quantité de matière première est utilisée, il est nécessaire de mesurer la concentration de l’échantillon de protéine éluée. Cette mesure permet d’ajuster la quantité de trypsine qui doit être ajoutée en conséquence. L’étape 4.9 montre un précipité blanc après l’ajout de l’AGT à 10 %. Pour éviter toute interférence des tensioactifs avec le signal MS, il est crucial de vérifier le pH après l’ajout d’acide trifluoroacétique (TFA) afin d’assurer l’élimination complète du détergent du surnageant.
Après le séchage et la remise en suspension de l’éluant dans l’eau, il est nécessaire d’effectuer une mesure UV du mélange peptidique. Cette mesure est cruciale car la quantité de peptides chargés sur la colonne peut influencer la détection à l’aide de la spectrométrie de masse. Après évaluation, il a été constaté qu’environ 1 μg du mélange peptidique présentait les meilleures performances dans la SEP. Par conséquent, cette quantité optimale doit être injectée dans la nano LC-MS/MS pour une analyse plus approfondie.
L’approche PMLD offre plusieurs avantages dans la préparation des échantillons, notamment une réduction suffisante des anticorps monoclonaux (mAb) DS tout en préservant la majorité des protéines de la cellule hôte (HCP) de faible abondance. Contrairement à l’immunoprécipitation (IP), cette technique ne repose pas sur des anticorps anti-HCP, éliminant ainsi le biais associé aux anticorps prédéfinis et réduisant le travail et le temps nécessaires à la production d’anticorps anti-HCP. De plus, contrairement aux méthodes de filtration basées sur le seuil de masse moléculaire17, la PMLD enrichit les professionnels de la santé, quelle que soit leur taille. Il peut être appliqué pour enrichir les HCP à partir de divers modules médicamenteux, tels que les anticorps, les protéines de fusion, le ScFv, etc., ce qui en fait une approche polyvalente par rapport aux méthodes de délétion de la protéine A21.
En plus de ces avantages, la PMLD présente une limite de détection plus basse et permet la détection d’un plus grand nombre de HCP à partir de NISTmAb, un étalon de référence largement caractérisé, par rapport à d’autres méthodes. Cependant, il convient de noter que le PMLD nécessite un équipement fait maison, ce qui limite son application à l’automatisation. Pour étendre sa facilité d’utilisation, il est possible de remplacer certains équipements, tels que la pointe par de la fritte, par des alternatives disponibles dans le commerce. De plus, le dessalage sur des plaques à 96 puits peut permettre un débit plus élevé en utilisant cette approche. L’exploration de l’automatisation ou de la semi-automatisation dans de futures expériences peut être une prochaine étape logique pour étendre l’application plus large de la PMLD.

Les protéines de la cellule hôte (HCP) sont des impuretés qui sont libérées par la culture cellulaire de l’organisme hôte et co-purifiées avec des anticorps monoclonaux (anticorps monoclonaux)1,2,3,4. Des traces de PS peuvent avoir un impact négatif sur la qualité du produit pharmaceutique 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 et, par conséquent, une méthode d’analyse sensible des PS est souhaitée pour détecter les PS à des niveaux inférieurs au ppm.
Des méthodes orthogonales peuvent être appliquées pour détecter les PS en faible abondance. Le test immuno-enzymatique (ELISA) est généralement utilisé pour quantifier l’ensemble des professionnels de la santé, et il peut également détecter et quantifier les professionnels de la santé individuels si les anticorps correspondants sont disponibles16. Cependant, la production d’anticorps spécifiques au HCP prend beaucoup de temps et de main-d’œuvre. En revanche, la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) peut fournir des informations complètes sur les HCP individuels dans les produits pharmaceutiques anticlonaux et est largement appliquée pour l’identification des HCP 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.
Plusieurs méthodes ont été mises au point pour détecter les professionnels de la santé avec LC-MS/MS, notamment la digestion limitée20, la filtration17, la délétion de la protéine A21, l’immunoprécipitation (IP) et l’enrichissement en protéoMiner (PM)18. La plupart des méthodes visent à réduire la quantité d’anticorps monoclonaux et à enrichir les professionnels de la santé avant l’analyse LC-MS/MS, diminuant ainsi la plage dynamique entre les peptides anticorps monoclonaux et les peptides de type HCP. Ce protocole présente une méthode d’enrichissement protéomique d’échantillons qui combine la technologie ProteoMiner et la digestion limitée (PMLD)28. Le principe d’enrichissement de ProteoMiner implique l’utilisation de billes d’enrichissement de protéome disponibles dans le commerce contenant une bibliothèque diversifiée de ligands peptidiques combinatoires. Ces ligands se lient spécifiquement aux protéines des anticorps-médicaments, ce qui permet d’éliminer les molécules en excès tout en concentrant les protéines de la cellule hôte (HCP) de faible abondance sur leurs ligands d’affinité respectifs. D’autre part, le principe de la digestion limitée implique l’utilisation d’une faible concentration de trypsine. Cette concentration est suffisante pour digérer les PS de faible abondance, mais pas assez pour digérer tous les produits médicamenteux à base d’anticorps. Cette approche permet la récupération et l’enrichissement des peptides HCP digérés à partir de la solution.
Par rapport aux méthodes de filtration, la technique PMLD n’est pas limitée par la taille des HCP détectés17. Les méthodes de délétion de la protéine A sont spécifiques à la détection des HCP associés aux anticorps21, tandis que l’immunoprécipitation est limitée aux HCP prédéfinis d’une lignée cellulaire particulière (telle que la lignée cellulaire de l’ovaire de hamster chinois (CHO)), où un anticorps anti-HCP a été généré4. En revanche, la PMLD peut être appliquée pour détecter les HCP à partir de n’importe quel module médicamenteux et des protéines de cellules hôtes co-purifiées avec des produits médicamenteux provenant de diverses lignées cellulaires. De plus, la PMLD présente une meilleure sensibilité par rapport aux méthodes mentionnées 17,18,20,21,24.
Cette approche permet d’enrichir la concentration de HCP de 7000 fois et d’abaisser la limite de détection à 0,002 ppm28. Le dispositif expérimental est illustré à la figure 1.

<table><tbody><tr><td>16 G, aiguille à moyeu métallique, 2 po, pointe 3</td><td>Hamilton</td><td>91016</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 colonne de piège (20 cm & fois ; 0,075 mm)</td><td>Thermo Fisher</td><td>164535</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Fisher-Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>avec 0,1 % d’acide formique (v/v), Optima LC/MS Grade&nbsp ;</td><td>Fisher-Scientific</td><td>LS120-4</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtre centrifuge Amicon Ultra-0.5</td> Colonne analytique <td>Millipore Sigma</td><td>UFC5010</td><td></td></tr><tr><td>C18 (0.075 mm &times ; 1.7 &mu ; m & fois ; 30 cm, 100 &Aring ;)</td><td>CoAnn Technologies</td><td>HEB07503001718I</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5424</td><td>Eppendorf</td><td>5405000646</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>A39255</td><td></td></tr><tr><td>Frit pour cartouches SPE, 9,5 mm, 3 mL, 100/pqt</td><td>Agilent</td><td>12131020</td><td></td></tr><tr><td>GL-Tip GC</td><td>GL Sciences Inc&nbsp ; &nbsp ;</td><td>7820-11201</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monobloc interne</td><td>Regeneron</td><td></td><td>concentration 200 mg/mL</td></tr><tr><td>Iodoacétamide (30 x 9,3 mg)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A39271</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher-Scientific</td><td>149320025</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6034</td><td></td></tr><tr><td>Monochlorhydrate de L-Histidine monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>53370</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher-Scientific</td><td>A456-4&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Millpore</td><td>30035</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Exploris 480</td><td>Thermo Fisher</td><td>BRE725539</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 0,5 mL</td><td>Eppendorf (VWR)</td><td>22431064</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 2,0 mL</td><td>Eppendorf (VWR)</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Discoverer software 2.4</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity</td><td>Kit Bio-Rad</td><td>1633007</td><td></td></tr><tr><td>ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity</td><td>Bio-Rad</td><td>1633006</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate (SDC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5777</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Labconco</td><td>7970010</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixeur R</td><td>Eppendorf</td><td>22670107</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoracétique (TFA)</td><td>Fisher-Scientific</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine (grade de séquençage modifié)&nbsp ; (5 x 20 μg)</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Tube Revolver Rotator</td><td>Thermo Fisher</td><td>88881001</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLC nano system</td><td>Thermo Fisher</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>VWR</td><td>102091-234</td><td></td></tr><tr><td>Eau avec 0.1 % d’acide formique (v/v), Optima LC/MS Grade&nbsp;</td><td>Fisher-Scientific</td><td>LS118-4&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des protéines de la cellule hôte à l’aide de billes d’enrichissement couplées à une digestion limitée

Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion

Les protéines de la cellule hôte (HCP) sont des impuretés qui peuvent nuire aux protéines thérapeutiques, même en petites quantités. Afin d’évaluer les risques potentiels associés aux produits pharmaceutiques, des méthodes ont été mises au point pour identifier les PS de faible abondance. Une approche cruciale pour le développement d’une méthode sensible de détection des HCP consiste à enrichir les HCP tout en éliminant simultanément les anticorps monoclonaux (mAb) avant l’analyse, en utilisant la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse (LC-MS).
Ce protocole offre des instructions détaillées pour enrichir les protéines de la cellule hôte à l’aide de billes d’enrichissement du protéome disponibles dans le commerce. Ces billes contiennent une bibliothèque diversifiée de ligands hexapeptidiques ayant des affinités spécifiques pour différentes protéines. Le protocole intègre également une digestion limitée et une détection ultérieure des peptides à l’aide de nano LC-MS/MS. En employant ces techniques, les PS de faible abondance peuvent être enrichis plus de 7000 fois, ce qui se traduit par une limite de détection impressionnante aussi basse que 0,002 ppm. De manière significative, ce protocole permet la détection de 850 HCP avec un haut niveau de confiance à l’aide d’un anticorps monoclonal du NIST. De plus, il est conçu pour être convivial et comprend une démonstration vidéo pour aider à sa mise en œuvre. En suivant ces étapes, les chercheurs peuvent enrichir et détecter efficacement les PS, ce qui améliore la sensibilité et la précision de l’évaluation des risques pour les produits pharmaceutiques.

Ce protocole présentait un flux de travail de préparation d’échantillons, appelé enrichissement protéique couplé à une digestion limitée (PMLD), pour l’analyse des protéines de la cellule hôte (HCP) dans un échantillon d’anticorps monoclonaux (mAb). La figure 1 illustre la procédure étape par étape de la PMLD. Les chercheurs ont comparé les résultats de l’analyse du HCP à l’aide de la digestion directe (illustrée dans le panneau supérieur de la figure 2) et de la PMLD (illustrée dans le panneau inférieur de la figure 2). Les profils de chromatogramme ionique total (TIC) ont indiqué que la PMLD réduisait ou éliminait significativement les principaux peptides anticlonaux tout en permettant l’observation de certains peptides HCP comparables aux peptides anticorps monoclonaux. Des paramètres détaillés pour les analyses nano LC (tableau 1) et MS/MS (tableau 2) sont fournis. De plus, le tableau 3 présente un résumé des HCP identifiés associés à l’anticorps monoclonal du NIST, y compris des informations telles que le numéro d’accession, le nom du HCP, l’espèce, le pourcentage de couverture, les PSM, les peptides uniques, le poids moléculaire, le point isoélectrique attendu (pI), le score Mascot, le score Sequest HT et le nombre de peptides identifiés par Mascot et Sequest HT.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65544/65544fig01.jpg"> Figure 1 : Flux de travail de préparation d’échantillons d’enrichissement en protéines couplé à une digestion limitée (PMLD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65544/65544fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65544/65544fig02.jpg"> Figure 2 : Profil de chromatogramme ionique total (TIC) pour l’analyse HCP des anticorps monoclonaux du NIST. Panneau supérieur : Profil TIC pour l’analyse HCP des anticorps monoclonaux du NIST par digestion directe. Panneau inférieur : Profil TIC pour l’analyse HCP des anticorps monoclonaux du NIST à l’aide de PMLD. Il ressort clairement du profil TIC que, par rapport à la digestion directe, la plupart des principaux peptides anticlonaux ont été réduits ou éliminés après PMLD, tandis que certains peptides appartenant aux professionnels de la santé peuvent être observés et sont comparables aux peptides anticorps monoclonaux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65544/65544fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Paramètres pour le nano LC. (A) Pente de la pompe de chargement. (B) Gradient de la pompe CN. (C) Propriétés de la source d’ions. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65544/65544_Table%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Paramètres pour MS/MS. (A) Propriétés d’analyse complètes. (B) Propriétés MIPS. (C) Propriétés d’intensité. (D) Propriétés de l’état de charge. (E) Exclusion dynamique. (F) Propriétés d’analyse MS2 dépendantes des données. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65544/65544_Table%202_FINAL.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 3 : Tableau récapitulatif représentatif des professionnels de la santé identifiés associés aux anticorps monoclonaux du NIST analysés par le logiciel Proteome Discoverer. Le tableau comprend des informations telles que le numéro d’accession, le nom du HCP, l’espèce, le pourcentage de couverture, le nombre de correspondances de spectre peptidique (PSM), le nombre de peptides uniques, le poids moléculaire, le point isoélectrique attendu (pI), le score Mascot, le score Sequest HT et le nombre de peptides identifiés par Mascot et Sequest HT. Veuillez <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65544/65544_Table%203.xlsx" target="_blank">cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Liste des abréviations utilisées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65544/65544_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Un protocole est présenté pour l’enrichissement des protéines de la cellule hôte (HCP) à partir de produits médicamenteux (DP) et la détection de peptides à l’aide de billes d’enrichissement du protéome. La méthode est démontrée à l’aide d’une substance médicamenteuse (DS) à base d’anticorps monoclonaux (mAb) fabriquée en interne, qui est un matériau de référence bien caractérisé pour évaluer et comparer différentes méthodes en termes de performance.

Analyse des protéines de la cellule hôte à l’aide de billes d’enrichissement couplées à une digestion limitée

Host cell proteins (HCPs) are impurities that can adversely affect therapeutic proteins, even in small quantities. To evaluate the potential risks ...

Nous avons mis au point une méthode très sensible pour détecter les protéines de cellules hôtes peu abondantes du produit médicamenteux à l’aide des billes d’enrichissement du protéome. Cette approche nous aide à trouver la cause profonde et le risque associé au produit médicamenteux. Il existe de multiples façons d’améliorer la limite de détection de l’analyse HCP, la méthode non ciblée, y compris, mais sans s’y limiter, l’épuisement de la protéine A, la digestion limitée, la limite de poids moléculaire, l’immunoprécipitation.La façon ciblée de détecter la protéine de la cellule hôte, y compris la chromatographie en phase liquide, la surveillance des réactions multiples et la surveillance des réactions parallèles par chromatographie non liquide. Le principal défi associé à ces analyses HCP est la plage dynamique importante entre les protéines des anticorps, des médicaments et des cellules hôtes. Ainsi, la plupart des méthodes visent à réduire la quantité d’anticorps et l’enrichissement du HCP avant l’analyse LCMS afin de diminuer la plage dynamique entre les peptides d’anticorps et les peptides HCP.Ainsi, la technologie ProteoMiner et le protocole de digestion limitée améliorent considérablement la limite de détection de l’analyse HCP par rapport à d’autres méthodes. Il est non biaisé par rapport à l’immunoprécipitation et peut être appliqué à différents modules de médicaments par rapport à la méthode d’épuisement de la protéine A. Ce protocole est également simple et direct.Ainsi, la technologie ProteoMiner et le protocole de digestion limité nous aident à identifier plusieurs HCP qui dégradent le polysorbate et le médicament anticorps fragmenté. En combinaison avec la méthode nano LCMPRM, la méthode d’enrichissement peut également fournir des résultats quantitatifs pour trouver la concentration biologiquement pertinente de protéines de cellules hôtes problématiques.

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Chimie

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Analyse spécifique des brins des protéines lors de brins d’ADN réplicatifs par enrichissement et séquençage de la méthode de l’ADN naissant associé aux protéines

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