Name: Hybridation in situ par fluorescence de l’ARN pour la localisation de longs ARN non codants dans les cellules d’ostéosarcome humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Apprenez la technique RNA FISH pour localiser les lncRNA dans les cellules d'ostéosarcome humain. Ce protocole détaillé utilise SNHG6 comme référence pour visualiser l'ARN dans la recherche sur le cancer.

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Ces travaux sont soutenus par des subventions de (1) le Programme national de recherche et développement clés de la Chine (2020YFE0201600) ; (2) la National Nature Science Foundation (81973877 et 82174408) ; (3) Centre d’innovation collaborative de Shanghai pour la transformation industrielle de la préparation de la MTC hospitalière ; (4) Projets de recherche dans le cadre du budget de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai (2021LK047).

Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole. La figure 1 montre le protocole global pour l’ARN FISH ; Le tableau 1 contient la composition de toutes les solutions et le tableau 2 contient les séquences d’amorces utilisées dans ce protocole.
1. Préparation de la sonde
<ol><li>Identifier et acquérir la séquence FASTA d’un ARNlnc cible d’intérêt, par exemple, à partir de GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). En suivant les indications sur le site Web, concevez les sondes ISH en ligne19 et passez en revue les suggestions de l’algorithme de conception pour répertorier les sondes à commander avec l’étiquette Cy3.</li>
	<li>Incuber le tampon d’hybridation à 37 °C pendant 2 h à l’avance.</li>
	<li>Dissoudre la sonde à 4 densités optiques (OD) dans 160 μL de ddH2O traité au diéthylpyrocarbonate (DEPC) à la concentration de 1 mg/mL à l’abri de la lumière. REMARQUE : La densité optique (OD) représente l’unité de mesure de l’ADN et de l’ARN. Habituellement, 1 unité OD = 33 μg/mL d’ADN.</li>
	<li>Préparer 200 μL du mélange de sonde pour chaque puits (1,2 μL-10 μL de sonde, 70 μL de tampon d’hybridation, compléter le volume avec du ddH2O à 200 μL traité par DEPC) et mettre en place une série de 50 μg/mL, 25 μg/mL, 12,5 μg/mL et 6 μg/mL. REMARQUE : La concentration de la sonde doit être explorée expérimentalement à l’avance. Une concentration élevée de sonde conduira à une liaison non spécifique des ARNlnc, tandis qu’une faible concentration de sonde conduira à une détection insensible ou à l’échec de la détection des ARNlnc.</li>
	<li>Dénaturer le mélange de sonde à 73 °C pendant 5 min. REMARQUE : Si la sonde d’ADN marquée Cy3 est double brin, dénaturez la sonde en ADN simple brin à 95 °C pendant 5 minutes, puis refroidissez rapidement pendant 2 minutes sur de la glace.</li>
</ol>2. Préparation des cellules
<ol><li>Ensemencer 50 000 cellules 143B par puits sur des lamelles de verre stériles dans une plaque de culture cellulaire à 12 puits et les incuber pendant 24 h (37 °C, 5 % CO2) dans du DMEM. REMARQUE : Le nombre spécifique de cellules ensemencées ici varie en fonction de la taille des cellules, ce qui est approprié pour que les cellules ensemencées atteignent une confluence de 50% après avoir été incubées pendant 24 h. Les lamelles en verre stériles sont rondes pour s’adapter à la plaque à 12 puits.</li>
	<li>Retirez le milieu et lavez pendant 2 x 5 min avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). REMARQUE : Préparez 1x PBS avec du ddH2O traité par DEPC. Le PBS sans traitement DEPC ne peut pas être utilisé car il contient de la RNase. Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions exemptes de RNase.</li>
	<li>Retirez 1x PBS et ajoutez 200 μL d’éthanol à 100 % dans chaque puits pour fixer pendant 15 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirer l’éthanol, ajouter 200 μL de Triton X-100 à 0,1 % (dans 1 PBS) dans chaque puits et incuber pendant 15 min à température ambiante. REMARQUE : Le temps doit être strictement contrôlé avec la perméabilisation Triton X-100 et ne doit pas être trop long.</li>
	<li>Retirez 0,1 % de Triton X-100 et lavez 2 x 5 min avec 1x PBS. REMARQUE : Si le protocole doit être interrompu ici, remplacez le PBS par de l’éthanol à 70% (dilution de l’éthanol à 100% avec du ddH2O sans RNase) et conservez l’échantillon à 4 °C jusqu’à 3 mois.</li>
	<li>Retirer 1x PBS, ajouter 200 μL de tampon 2x citrate salin de sodium (SSC) (dilution de 20x SSC avec du ddH2O sans RNase) dans chaque puits, et incuber pendant 30 min à 37 °C.</li>
	<li>Retirez 2 tampons SSC, ajoutez 200 μL d’éthanol à 70 % dans chaque puits et incubez pendant 3 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Jeter l’éthanol à 70 %, ajouter 200 μL d’éthanol à 85 % (dilution de l’éthanol à 100 % avec du ddH2O sans RNase) dans chaque puits et incuber pendant 3 min à température ambiante.</li>
	<li>Jetez l’éthanol à 85 %, ajoutez 200 μL d’éthanol à 100 % dans chaque puits et incubez pendant 3 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Absorber et jeter 100 % d’éthanol ; Laissez sécher les puits.</li>
</ol>3. Hybridation in situ par fluorescence (FISH)
<ol><li>Ajouter 200 μL de mélange de sondes (dénaturé comme à l’étape 1.5) dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant la nuit (16-18 h). NOTE : Il existe une forte corrélation positive entre la température d’hybridation et la concentration de la sonde ; Par conséquent, pour optimiser le bruit de fond, la température d’hybridation et la concentration de la sonde doivent être réduites.</li>
	<li>Le lendemain, prélevez des échantillons à 37 °C et jetez le mélange de sondes. Ajouter 200 μL de tampon 0,4x SSC/0,3 % Tween-20 dans chaque puits (préchauffé à 65 °C) et laver pendant 2 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirez le tampon 0,4x SSC/0,3 % Tween-20, ajoutez 200 μL de tampon 2x SSC/0,1 % Tween-20 dans chaque puits et lavez pendant 2 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Retirer 2 tampons SSC/0,1 % Tween-20, ajouter 200 μL de solution colorante 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (1 μg/mL) et colorer pendant 20 minutes à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Jetez la solution de colorant DAPI et lavez avec 1x PBS pendant 2 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajoutez 50 μL de médium de montage contenant de la gomme sur la lame et placez la lamelle en verre sur la lame pour la fixer. REMARQUE : Assurez-vous de placer la lamelle sur la lame avec le côté de la cellule vers le bas.</li>
	<li>Observez au microscope à fluorescence. REMARQUE : Utilisez un microscope à fluorescence ou un microscope confocal laser ; Ce dernier produit une imagerie plus sensible et plus claire.</li>
</ol>

FISH pour la localisation de l’ARN non codant long dans les cellules d’ostéosarcome humain

<ol><li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Li, C. H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+role+of+long+noncoding+RNA+in+cancer+development+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).</li>
<li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+FBXL19-AS1+regulates+osteosarcoma+cell+proliferation%2C+migration+and+invasion+by+sponging+miR-346%5BTitle%5D)+AND+%22OncoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).</li>
<li>Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+C2dat1+promotes+cell+proliferation%2C+migration%2C+and+invasion+by+targeting+miR-34a-5p+in+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Research%22%5BJournal%5D)">lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells.</a> Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).</li>
<li>Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+MATN1-AS1+for+prediction+of+prognosis+in+osteosarcoma+patients+and+its+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function.</a> Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).</li>
<li>Luo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+long+noncoding+RNA+biology+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods to study long noncoding RNA biology in cancer.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).</li>
<li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+TUSC7+inhibits+osteosarcoma+progression+through+the+miR-181a%2FRASSF6+axis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis.</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).</li>
<li>Tong, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+RUSC1-AS1+promotes+osteosarcoma+progression+through+regulating+the+miR-340-5p+and+PI3K%2FAKT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway.</a> Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ceRNA+in+cancer%3A+possible+functions+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications.</a> Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).</li>
<li>Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).</li>
<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).</li>
<li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+%28bDNA%29+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li>
<li>Hazra, R., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+RNA+transcripts+and+proteins+in+whole-mount+mouse+preimplantation+embryos+using+single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261(2022).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+SNHG6+regulates+EZH2+expression+by+sponging+miR-26a%2Fb+and+miR-214+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer.</a> Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3(2019).</li>
<li>Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+SNHG6+is+associated+with+poor+prognosis+of+gastric+cancer+and+promotes+cell+proliferation+and+EMT+through+epigenetically+silencing+p27+and+sponging+miR-101-3p%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%3A+International+Journal+of+Experimental+Cellular+Physiology%2C+Biochemistry%2C+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).</li>
<li>Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+SNHG6+induced+cell+autophagy+by+targeting+miR-26a-5p%2FULK1+signaling+pathway+in+human+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma.</a> Cancer Cell International. 19, 82(2019).</li>
<li>Birgani, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+SNHG6+as+a+potential+biomarker+for+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+Oncology+Research%3A+POR%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma.</a> Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).</li>
<li>Nielsen, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+lncRNA+by+LNA-based+in+situ+hybridization+in+paraffin-embedded+cancer+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids.</a> Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+SNHG6+regulates+p21+expression+via+activation+of+the+JNK+pathway+and+regulation+of+EZH2+in+gastric+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells.</a> Life Sciences. 208, 295-304 (2018).</li>
<li>Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+techniques+for+paraffin-embedded+adult+coral+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853(2018).</li>
<li>Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+RNA+FISH+%28smFISH%29+in+whole-mount+mouse+embryonic+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79(2019).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ce protocole RNA FISH peut non seulement détecter la localisation des ARNlnc dans les cellules, mais aussi détecter la colocalisation d’autres ARN, ADN ou protéines dans les cellules, qui peuvent également être utilisés pour détecter l’emplacement des ARNlnc dans les tissus enrobés de paraffine. Cependant, le protocole spécifique dans de tels cas est différent car les tissus enrobés de paraffine doivent être déparaffinés21. Cette procédure expérimentale peut être appliquée dans des plaques de 48 o...

Notre compréhension du génome humain a été considérablement élargie par les progrès récents de la technologie du génome entier. Environ 93 % du génome humain peut être transcrit en ARN, mais seulement 2 % des ARN peuvent être traduits en protéines ; les 98 % restants d’ARN qui n’ont pas de fonction de traduction protéique sont appelés ARN non codant (ARNnc)1. En tant que classe d’ARN non codants (ARNnc), les ARNnc longs (ARNlnc), contenant plus de 200 nucléotides2, ont attiré une attention croissante en raison de leur implication dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques des cellules, tels que la différenciation, le contrôle du cycle, l’apoptose, la migration et l’invasion 3,4,5. Les ARNlnc jouent leur rôle par le biais de divers mécanismes, tels que la régulation de la structure de la chromatine et de l’expression des gènes nucléaires, le contrôle du processus d’épissage de l’ARNm et la modification post-transcriptionnelle6. Les ARNlnc régulent l’apparition, le développement et les métastases des tumeurs malignes aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel. La régulation transcriptionnelle est réalisée dans le noyau en affectant la transcription de l’ARN via la liaison aux structures chromosomiques, tandis que la régulation post-transcriptionnelle est réalisée dans le cytoplasme en contrôlant les gènes cibles via un mécanisme d’ARN compétitif endogène (ARNce) 5,7,8. L’ARNc a révélé un nouveau mécanisme d’interaction avec l’ARNc, à savoir que les ARNlnc peuvent agir comme une éponge pour adsorber les miARN et inhiber la dégradation médiée par les miARN des gènes cibles apparentés9. Par conséquent, les informations concernant la localisation subcellulaire des ARNlnc, qu’un ARNlnc spécifique soit situé dans le cytoplasme ou le noyau, sont importantes pour aider à identifier leurs fonctions biologiques.
À l’heure actuelle, la localisation de l’ARNlnc est principalement détectée par deux méthodes, l’une par test d’isolement de fraction noyau/cytoplasme, et l’autre par ARN FISH. Dans le premier cas, les ARN des fractions cytoplasmique et nucléaire sont extraits respectivement, puis l’amplification par PCR est réalisée avec des amorces d’ARNlnc spécifiques pour détecter le rapport des ARNlnc dans le cytoplasme et le noyau. L’avantage de cette méthode est l’efficacité temporelle, tandis que l’inconvénient est que la localisation réelle de l’ARNlnc n’est pas directement reflétée par la proportion relative d’ARNlnc dans le cytoplasme et le noyau. RNA FISH peut détecter la localisation de l’ARNlnc dans les cellules grâce à la conception de séquences de chaînes antisens spécifiques à l’ARNlnc, suivie d’un marquage avec des colorants fluorescents10. Les méthodes RNA FISH ont été améliorées grâce aux progrès des techniques de sonde et des méthodes de détection, y compris les ensembles de sondes à oligosondes multiplesmarquées aux fluorophores 11, les sondes LNA 12 et les sondes à ADN ramifié (ADNb)13. L’ARN FISH peut non seulement détecter la localisation de l’ARNlnc, mais aussi détecter la colocalisation d’autres ARN, ADN ou protéines en utilisant l’immunofluorescence bicolore ou multicolore14.
Dans ce travail, nous avons inclus le protocole détaillé de détection de localisation intracellulaire du gène hôte 6 (SNHG6) du petit ARN nucléolaire de l’ARNlnc dans les cellules d’ostéosarcome (143B) par RNA FISH à titre d’exemple. SNHG6 est un ARNlnc nucléotidique de 600 à 730 dans sa forme épissée mature et identifié comme un nouvel oncogène dans divers cancers humains, notamment le cancer colorectal, le cancer gastrique, le carcinome à cellules claires de l’ovaire, l’ostéosarcome et le carcinome hépatocellulaire15,16,17,18. Des études ont confirmé l’implication de SNHG6 dans les comportements biologiques des cellules cancéreuses, tels que la prolifération, l’EMT et l’autophagie, et ont montré la localisation cytoplasmique de SNHG6 où il peut affecter les gènes cibles en se liant (éponger) les miARN15,16,17. Ce protocole détaillé de détection de la localisation intracellulaire de SNHG6 par RNA FISH est présenté ici.

<table><tbody><tr><td>Compteur automatique de cellules</td><td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td><td>IC1000</td><td>Comptage des cellules</td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire-12</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>3513,corning</td><td>Placez les lamelles dans la plaque</td></tr><tr><td>&nbsp ; Lignée cellulaire (143B)</td><td>Banque de cellules de l’Académie chinoise des sciences</td><td>CRL-8303</td><td>Lignée cellulaire du cancer de l’ostéosarcome</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger (15 mL, 50 mL)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>&nbsp ; 430790, Corning</td><td>Centrifuge les cellules</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>abs7026</td><td>Les cellules sont ensemencées sur les lamelles</td></tr><tr><td>Cy3 mark-SNHG6 Sonde d’ADN</td><td>Shanghai GenePharma Co.,Ltd</td><td>A10005</td><td>Détecter l’emplacement SNHG6</td></tr><tr><td>Média DMEM</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>LM-E1141</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Incubateur</td> <td>à bain secHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.</td><td>DKT200-2&nbsp ;</td><td>Incubation à différentes températures élevées</td></tr><tr><td>Éthanol 100 %&nbsp ;</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10009218</td><td>déshydratation</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD</td><td>Olympus BX43 équipé d’une caméra de Olympus U-TV0.5XC-3 (SN : 5J01719),olympus</td><td>Observation et positionnement</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD</td><td>DHP-9051</td><td>Les échantillons ont été incubés à 37 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Support de montage</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>E675004</td><td>Fixez les lamelles à la lame</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.</td><td>TS-8S</td><td>Échantillon de lavage</td></tr><tr><td>Diapositive</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>188105</td><td>Les lamelles sont placées sur la diapositive</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A600198</td><td>Membrane perméable et membrane nucléaire</td></tr><tr><td>&nbsp ; Trypsine (0,25 %)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>25200056, Gibco</td><td>traitement à la trypsine des cellules</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A600560</td><td>détergent</td></tr></tbody></table>

hybridation in situ par fluorescence de l’arn pour la localisation de longs arn non codants dans les cellules d’ostéosarcome humain

RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

Les rôles importants des longs ARN non codants (ARNlnc) dans le cancer ont été étudiés, tels que la régulation de la prolifération, de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), de la migration, de l’infiltration et de l’autophagie des cellules cancéreuses. La détection de localisation des ARNlnc dans les cellules peut donner un aperçu de leurs fonctions. En concevant la séquence de chaîne antisens spécifique de l’ARNlnc suivie d’un marquage avec des colorants fluorescents, l’hybridation in situ par fluorescence de l’ARN (FISH) peut être appliquée pour détecter la localisation cellulaire des ARNlnc. Avec le développement de la microscopie, les techniques RNA FISH permettent même aujourd’hui de visualiser les ARNlnc faiblement exprimés. Cette méthode permet non seulement de détecter la localisation des ARNlnc seuls, mais aussi de détecter la colocalisation d’autres ARN, ADN ou protéines en utilisant l’immunofluorescence bicolore ou multicolore. Ici, nous avons inclus la procédure d’opération expérimentale détaillée et les précautions de l’ARN FISH en utilisant le gène hôte 6 (SNHG6) du petit ARN nucléolaire de l’ARN lnc dans les cellules d’ostéosarcome humain (143B) à titre d’exemple, afin de fournir une référence pour les chercheurs qui souhaitent effectuer des expériences RNA FISH, en particulier lncRNA FISH.

Des images représentatives de SNHG6 FISH dans des cellules d’ostéosarcome humain sont présentées (Figure 2). Le contrôle négatif est traité avec la sonde Ctrl négative ; Le contrôle positif est traité avec la sonde U6 20. La sonde SNHG6 et la sonde U6 sont marquées avec Cy3, qui émet une fluorescence rouge. Le DAPI est un colorant qui colore l’ADN, qui émet une fluorescence bleue. Ce résultat montre que SNHG6 est principalement localisé dans le cytoplasme, et cette in...

Le présent protocole décrit une méthode d’hybridation in situ par fluorescence de l’ARN pour localiser les ARNlnc dans les cellules d’ostéosarcome humain.

Hybridation in situ par fluorescence de l’ARN pour la localisation de longs ARN non codants dans les cellules d’ostéosarcome humain

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition ...

L’objectif de notre recherche est de fournir un protocole ARN FISH détaillé qui fournit une référence pour les scientifiques qui souhaitent effectuer des expériences RNA FISH. Nos recherches ont établi que l’ARN FISH peut être utilisé pour localiser l’ARNlnc dans les cellules d’ostéosarcome humain. Notre protocole a fourni une procédure expérimentale complète et les précautions pour l’ARN FISH en utilisant lncRNA-SNHG6 dans des cellules d’ostéosarcome humain comme référence.

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Visualisation de localisation de l&#39;ARN Xenopus Les ovocytes

Ce protocole est utilisé avec succès pour détecter quantitativement les niveaux et les schémas spatiaux de l'expression des ARNm de multiples types de tissus à travers les espèces de vertébrés. La méthode peut détecter des transcrits de faible abondance et permet de traiter des centaines de diapositives simultanément. Nous présentons ce protocole en utilisant le profil d'expression de la formation du cerveau embryonnaire aviaire comme un exemple.

Radioactif In situ D&#39;hybridation pour détecter divers profils d&#39;expression génique dans les tissus

Nous décrivons ici un ensemble de montage...

Toute Mont ARN fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

ARN L’hybridation in situ (ISH) permet de visualiser les ARN dans les cellules et les tissus. Nous montrons ici comment la combinaison de l’ARNASCOPE ISH avec l’immunohistochimie ou les colorants histologiques peut être utilisée avec succès pour détecter les ARNm localisés aux axones dans des sections de cerveaux de souris et d’humains.

Détection de axonaux localisée ARNm dans les sections de cerveau en utilisant haute résolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation

Nous décrivons ici une analyse de l’hybridation in situ qui permet la détection sensible et spécifique des séquences aussi courtes que 50 nucléotides avec résolution de simple-nucléotide au niveau unicellulaire. L’analyse, qui peut être réalisé manuellement ou automatiquement, pouvez activer la visualisation des variants d’épissage, courtes séquences et des mutations dans le cadre de tissu.

Visualisation des Variants génétiques, quelques cibles et des Mutations ponctuelles dans le cadre de tissu morphologique avec un ARN essai In Situ hybridation avec

Pour compter reproductible les numéros des ARNm dans les ovocytes, in situ en fluorescence seule molécule RNA hybridation (RNA-poisson) a été optimisée pour les cellules non adhérentes. Ovocytes ont été recueillis, hybridaient avec des sondes spécifiques de transcription et quantifiées à l’aide d’un logiciel de quantification d’image.

Utilisation d’unique molécule fluorescente hybridation In Situ (FISH-SM) afin de quantifier et Localize ARNm dans les ovocytes murin

Le protocole décrit un test d’hybridation par immunofluorescence en tandem avec du tissu fixé au formol et inclus dans de la paraffine pour détecter et quantifier simultanément les microARN et les protéines multiplexées.

Amplification et reconnaissance de microARN par hybridation in situ d’acides nucléiques verrouillés en tant que nouvelle méthode de détection et de quantification

Ce protocole fournit une approche détaillée pour évaluer les niveaux de modification de m6Ad’ARN spécifique à l’aide de MeRIP-qPCR.

Test MeRIP-qPCR pour détecter les niveaux de modification m6A d’ARN spécifique dans les cellules d’ostéosarcome

Ce protocole expérimental offre une méthode stable, rentable et efficace qui combine le knockdown de l’ARNnc avec des tests formant des colonies afin de quantifier l’effet de l’ARNnc sur la prolifération cellulaire de l’ostéosarcome.

Essai de formation de colonie détectant la capacité proliflective des cellules d’ostéosarcome à élimination d’ARNCn

La présence de cellules souches cancéreuses (CCF) dans sarcomes osseux a récemment été liée à leur pathogénie. Dans cet article, nous présentons l'isolement des cellules souches cancéreuses à partir de cultures de cellules primaires obtenues à partir de biopsies humaines d'ostéosarcome classique (OS) en utilisant la capacité de CSCs à croître dans des conditions non adhérentes.

Création de souches du cancer de cultures de cellules de Human ostéosarcome conventionnel

Apprenez la technique RNA FISH pour localiser les lncRNA dans les cellules d'ostéosarcome humain. Ce protocole détaillé utilise SNHG6 comme référence pour visualiser l'ARN dans la recherche sur le cancer.

Hybridation in situ par fluorescence de l’ARN pour la localisation de longs ARN non codants dans les cellules d’ostéosarcome humain (Vidéo) | JoVE Journal

Hybridation in situ par fluorescence de l’ARN pour la localisation de longs ARN non codants dans les cellules d’ostéosarcome humain

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