Évaluation rapide de la cytotoxicité in vitro du récepteur de l’antigène chimérique exprimant le jurkat à l’aide de l’imagerie fluorescente
27 octobre 2023
Un protocole pour évaluer la destruction quantitative des cellules tumorales par les cellules de Jurkat exprimant le récepteur de l’antigène chimérique (CAR) ciblant l’antigène tumoral unique. Ce protocole peut être utilisé comme plate-forme de criblage pour l’optimisation rapide des constructions de charnières CAR avant la confirmation dans les lymphocytes T dérivés du sang périphérique.
Les cellules CAR-T sont constamment améliorées pour obtenir de meilleures réponses dans les essais cliniques humains. Nous cherchons des moyens d’évaluer cela dans notre laboratoire à l’aide d’une méthode impartiale à haut débit, comme l’utilisation de l’imagerie fluorescente pour filtrer les combinaisons qui fonctionnent le mieux. Il existe plusieurs combinaisons de constructions qui peuvent être conçues pour n’importe quel fragment variable de chaîne unique en modifiant la géométrie des domaines extracellulaire et charnière.
Nous avons conçu ce protocole pour identifier les combinaisons les plus efficaces dans l’élimination des cellules cibles à l’aide de cellules Jurkat. Il s’agit d’un protocole rapide et à haut débit pour cribler les constructions CAR en fonction de leur cytotoxicité à l’aide de cellules Jurkat, qui sont ensuite validées avec des cellules T conventionnelles. Une douzaine de constructions CAR différentes peuvent être testées simultanément dans une plaque de 96 puits en utilisant cette technique.
Ici, à Akhavan Lab, nous quantifions en chiffres absolus la cyclose directe des cellules cibles par les cellules CAR exprimant les cellules Jurkat à haut débit pour cribler plusieurs constructions CAR. L’objectif principal de notre laboratoire est d’améliorer la traduction clinique de la thérapie par cellules CAR-T contre les tumeurs cérébrales de haut grade. Nous tirons parti des criblages de médicaments à haut débit comme modalité pour améliorer la cytotoxicité des cellules CAR-T, ainsi que pour cibler le microenvironnement tumoral.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode à haut débit pour évaluer la cytotoxicité de cellules Jurkat exprimant un CAR vis-à-vis de cellules tumorales. Elle permet le criblage rapide de diverses constructions de CAR afin d'identifier les combinaisons les plus efficaces pour cibler des antigènes tumoraux spécifiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Biologie du cancer
- Thérapie cellulaire
Contexte général
- Les cellules CAR T sont en cours d'optimisation afin d'améliorer les résultats cliniques.
- Les méthodes de criblage à haut débit sont essentielles pour optimiser les constructions de CAR.
- Les cellules Jurkat servent de modèle pour évaluer l'efficacité du CAR.
- Cette étude se concentre sur la cytotoxicité des constructions de CAR vis-à-vis des cellules cibles.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole permettant de cribler efficacement les constructions de CAR.
- Quantifier les effets cytotoxiques des cellules Jurkat exprimant des CAR.
- Identifier les configurations optimales de CAR pour cibler les antigènes tumoraux.
Méthodes utilisées
- Imagerie fluorescente pour le criblage à haut débit.
- Évaluation de multiples constructions de CAR dans un format de plaque 96 puits.
- Quantification de la destruction des cellules cibles par les cellules Jurkat exprimant un CAR.
- Comparaison avec les réponses conventionnelles des lymphocytes T à des fins de validation.
Résultats principaux
- Identification de constructions CAR efficaces pour la destruction des cellules tumorales.
- Démonstration des capacités de haut débit à l'aide de cellules Jurkat.
- Évaluation quantitative de la cytotoxicité entre différentes constructions.
- Potentiel d'optimisation rapide des conceptions de CAR avant leur application clinique.
Conclusions
- Le protocole permet un criblage efficace des constructions CAR.
- Les cellules Jurkat fournissent un modèle fiable pour évaluer l'efficacité du CAR.
- Cette approche peut accélérer le développement de thérapies par cellules T à récepteur CAR.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'évaluation rapide et à haut débit de la cytotoxicité de constructions de CAR dans des cellules Jurkat permet une réduction précoce des risques et la priorisation des conceptions de CAR avant la validation exigeante en ressources sur des lymphocytes T primaires. Cette plateforme accélère l'identification de CAR dotés d'une charnière optimisée et d'une capacité supérieure à tuer les cellules cibles, facilitant ainsi un tri efficace des portefeuilles dans les voies thérapeutiques cellulaires en oncologie. En quantifiant la cytotoxicité de plusieurs constructions simultanément, les équipes peuvent prendre des décisions fondées sur des données aux points critiques de bifurcation de la découverte.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une interrogation rapide des permutations du construit CAR pour la validation fonctionnelle de la cible.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en quantifiant la cytotoxicité directe dans un système contrôlé.
- Permet une prédiction fiable du choix du construit avant l'ingénierie des lymphocytes T primaires.
Développement de tests et criblage
- Prépare des systèmes CAR-Jurkat validés pour des flux de travail de criblage à haut débit en aval.
- Normalise les tests de cytotoxicité avec des sorties quantitatives par imagerie fluorescente.
- Permet une évaluation reproductible et évolutive de plusieurs constructions de CAR en parallèle.
- Prend en charge l'évaluation fiable de composés ou de constructions en formats de plaques 96-puits.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les données précoces de cytotoxicité avec les objectifs translationnels en confirmant les résultats dans des lymphocytes T dérivés de PBMC.
- Assure une continuité entre l'optimisation des constructions en phase de découverte et les étapes de validation préclinique.
- Réduit le risque d'échec en phase avancée en éliminant précocement les conceptions de CAR sous-optimales.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette plateforme de cytotoxicité haut débit s'inscrit à l'interface entre la phase de découverte précoce et l'identification de candidats, assurant un lien entre la conception de constructions et la validation préclinique. Elle permet un test rapide des hypothèses et le tri des constructions avant de passer à des études plus exigeantes en ressources, comme celles utilisant des lymphocytes T primaires ou des modèles in vivo.
- Biologie de la découverte : Soutient l'évaluation fondée sur des hypothèses des modifications de la charnière et des domaines extracellulaires pour l'efficacité du CAR.
- Tri : Fournit des données quantitatives et reproductibles de cytotoxicité permettant la comparaison et le classement des constructions.
- Analytique : Fournit des décomptes cellulaires absolus et des résultats statistiques (par exemple, ANOVA à un facteur) pour éclairer la prise de décision.
- Recherche translationnelle : Confirme le rendement des constructions dans les lymphocytes T dérivés de PBMC, soutenant la continuité translationnelle.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme évolutible et réutilisable pour des campagnes continues d'optimisation des constructions de CAR.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans le choix des constructions CAR.
- Valeur opérationnelle : Standardise et permet l'analyse de la cytotoxicité à plus grande échelle, favorisant une allocation efficace des ressources.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go) et l'efficacité du capital en éliminant précocement certaines constructions.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation et un développement des candidats CAR ajustés au risque.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la conception de vecteurs CAR et la transduction lentivirale de cellules Jurkat.
- Requiert un accès à un équipement d'imagerie fluorescente et à un logiciel analytique pour des lectures quantitatives.
- Exige une standardisation interéquipes du montage des essais et des paramètres d'analyse des données.
- L'adaptation à d'autres modèles cellulaires ou antigènes peut nécessiter une optimisation du protocole.
- Dépend d'une analyse statistique rigoureuse (par exemple, ANOVA) pour la comparaison des vecteurs.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Plating CFSE‐Labelled Tumor Cells and Co‐Culturing CAR‐Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
5:19
Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR‐Jurkat Co‐Culture with CFSE‐Labeled Tumor Cells
![Imagerie dynamique des lymphocytes T récepteurs de l’antigène chimérique avec [18F]Tomographie par émission de positons tétrafluoroborates/Tomodensitométrie](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
