Name: Expression de transgènes dans des cellules en culture à l’aide de vecteurs viraux adéno-associés recombinants non purifiés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Découvrez une méthode simplifiée de transduction cellulaire utilisant des préparations d'AAV non purifiés pour l'expression transgène. Cette approche économique et efficace offre une alternative moins toxique aux méthodes de transfection traditionnelles en thérapie génique.

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Nous remercions Robert Tjian et Xavier Darzacq pour leur soutien et l’utilisation du matériel de laboratoire. Nous remercions Mark Kay pour son don des plasmides rep/cap KP1 et LK03, et Luk Vandenberghe pour le plasmide rep/cap AAV4. Le financement a été fourni par le Howard Hughes Medical Institute (34430, R. T.) et le California Institute for Regenerative Medicine Training Program EDUC4-12790. N.W. remercie le Berkeley Stem Cell Center par le biais d’une bourse postdoctorale Siebel et par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) par le biais d’une bourse Walter Benjamin.

Production brute de vecteurs et administration efficace de l’ADN dans les cultures cellulaires

<ol><li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corrigendum%3A+An+essential+receptor+for+adeno-associated+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Corrigendum: An essential receptor for adeno-associated virus infection.</a> Nature. 539 (7629), 456(2016).</li>
<li>Nicolson, S. C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+utilizes+host+cell+nuclear+import+machinery+to+enter+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus utilizes host cell nuclear import machinery to enter the nucleus.</a> Journal of Virology. 88 (8), 4132-4144 (2014).</li>
<li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Vectors+in+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases%22%5BJournal%5D)">Viral Vectors in Gene Therapy.</a> Diseases. 6 (2), 42(2018).</li>
<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).</li>
<li>Ling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Adeno-Associated+Virus+Genome+Packaging+Puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Genetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Adeno-Associated Virus Genome Packaging Puzzle.</a> Journal of Molecular and Genetic Medicine. 9 (3), 175(2015).</li>
<li>Maurer, A. C., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus+Genome+Interactions+Important+for+Vector+Production+and+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus Genome Interactions Important for Vector Production and Transduction.</a> Human Gene Therapy. 31 (9-10), 499-511 (2020).</li>
<li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+the+adeno-associated+virus+DNA+termini+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Replication of the adeno-associated virus DNA termini in vitro.</a> Intervirology. 27 (3), 138-147 (1987).</li>
<li>Wang, X. S., Ponnazhagan, S., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+and+replication+of+adeno-associated+virus+type+2+as+well+as+vector+DNA+sequences+from+recombinant+plasmids+containing+deletions+in+the+viral+inverted+terminal+repeats%3A+selective+encapsidation+of+viral+genomes+in+progeny+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rescue and replication of adeno-associated virus type 2 as well as vector DNA sequences from recombinant plasmids containing deletions in the viral inverted terminal repeats: selective encapsidation of viral genomes in progeny virions.</a> Journal of Virology. 70 (3), 1668-1677 (1996).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus+Serotype-Specific+Inverted+Terminal+Repeat+Sequence+Role+in+Vector+Transgene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus Serotype-Specific Inverted Terminal Repeat Sequence Role in Vector Transgene Expression.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 151-162 (2020).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concatamerization+of+adeno-associated+virus+circular+genomes+occurs+through+intermolecular+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Concatamerization of adeno-associated virus circular genomes occurs through intermolecular recombination.</a> Journal of Virology. 73 (11), 9468-9477 (1999).</li>
<li>Au, H. K. E., Isalan, M., Mielcarek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Advances%3A+A+Meta-Analysis+of+AAV+Usage+in+Clinical+Settings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Advances: A Meta-Analysis of AAV Usage in Clinical Settings.</a> Frontiers in Medicine. 8, 809118(2021).</li>
<li>Ellis, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+ex+vivo%2Fin+vitro+transduction+efficiency+of+mammalian+primary+cells+and+cell+lines+with+Nine+natural+adeno-associated+virus+%28AAV1-9%29+and+one+engineered+adeno-associated+virus+serotype%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype.</a> Virology Journal. 10, 74(2013).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
<li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Associated+Defective+Virus+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Associated Defective Virus Particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li>
<li>Meier, A. F., Fraefel, C., Seyffert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interplay+between+Adeno-Associated+Virus+and+its+Helper+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Interplay between Adeno-Associated Virus and its Helper Viruses.</a> Viruses. 12 (6), 662(2020).</li>
<li>Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+nonviral+transfection+and+adeno-associated+viral+transduction+on+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 21-32 (2004).</li>
<li>Batista Napotnik, T., Polajzer, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+due+to+electroporation+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell death due to electroporation - A review.</a> Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).</li>
<li>McCarty, D. M., Young, S. M. Jr, Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+and+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors.</a> Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+AAV+system+enables+the+Cas9-mediated+correction+of+a+metabolic+liver+disease+in+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 334-338 (2016).</li>
<li>Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell culture contamination.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).</li>
<li>Parks, W. P., Melnick, J. L., Rongey, R., Mayor, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+assay+and+growth+cycle+studies+of+a+defective+adeno-satellite+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Physical assay and growth cycle studies of a defective adeno-satellite virus.</a> Journal of Virology. 1 (1), 171-180 (1967).</li>
<li>Bantel-Schaal, U., zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+DNA+of+a+defective+human+parvovirus+isolated+from+a+genital+site%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site.</a> Virology. 134 (1), 52-63 (1984).</li>
<li>Gao, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adeno-associated+viruses+from+rhesus+monkeys+as+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 99 (18), 11854-11859 (2002).</li>
<li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clades+of+Adeno-associated+viruses+are+widely+disseminated+in+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6381-6388 (2004).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Reports. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> Journal of Virology. 82 (12), 5887-5911 (2008).</li>
<li>Lisowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+evaluation+of+clinically+relevant+AAV+variants+in+a+xenograft+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model.</a> Nature. 506 (7488), 382-386 (2014).</li>
<li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> JCI Insight. 4 (22), e131610(2019).</li>
<li>Colon-Thillet, R., Jerome, K. R., Stone, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+AAV+vectors+to+target+persistent+viral+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimization of AAV vectors to target persistent viral reservoirs.</a> Virology Journal. 18 (1), 85(2021).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li>
<li>Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+high-resolution+imaging+of+Ku+foci+to+decipher+mechanisms+of+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair.</a> The Journal of Cell Biology. 202 (3), 579-595 (2013).</li>
<li>Bi, X., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+rearrangement+mediated+by+inverted+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA rearrangement mediated by inverted repeats.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 93 (2), 819-823 (1996).</li>
<li>Samulski, R. J., Berns, K. I., Tan, M., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+adeno-associated+virus+into+pBR322%3A+rescue+of+intact+virus+from+the+recombinant+plasmid+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning of adeno-associated virus into pBR322: rescue of intact virus from the recombinant plasmid in human cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 79 (6), 2077-2081 (1982).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li>
<li>Sommer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+adeno-associated+virus+particles+and+empty+capsids+by+optical+density+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement.</a> Molecular Therapy. 7 (1), 122-128 (2003).</li>
<li>Zhu, J., Huang, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TLR9-MyD88+pathway+is+critical+for+adaptive+immune+responses+to+adeno-associated+virus+gene+therapy+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adeno-associated virus gene therapy vectors in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2388-2398 (2009).</li>
<li>Wagner, H., Bauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+is+not+Toll%3A+new+pathways+in+DNA+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">All is not Toll: new pathways in DNA recognition.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (2), 265-268 (2006).</li>
<li>Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+Digital+Droplet-Based+AAV+Genome+Titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative and Digital Droplet-Based AAV Genome Titration.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titration+of+AAV-2+particles+via+a+novel+capsid+ELISA%3A+packaging+of+genomes+can+limit+production+of+recombinant+AAV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2.</a> Gene Therapy. 6 (7), 1322-1330 (1999).</li>
<li>Summerford, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-associated+heparan+sulfate+proteoglycan+is+a+receptor+for+adeno-associated+virus+type+2+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions.</a> Journal of Virology. 72 (2), 1438-1445 (1998).</li>
<li>Bell, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAV9+receptor+and+its+modification+to+improve+in+vivo+lung+gene+transfer+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2427-2435 (2011).</li>
<li>McCown, T. J., Xiao, X., Li, J., Breese, G. R., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+persistent+expression+patterns+of+CNS+gene+transfer+by+an+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Differential and persistent expression patterns of CNS gene transfer by an adeno-associated virus (AAV) vector.</a> Brain Research. 713 (1-2), 99-107 (1996).</li>
<li>Weitzman, M. D., Kyostio, S. R., Kotin, R. M., Owens, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+Rep+proteins+mediate+complex+formation+between+AAV+DNA+and+its+integration+site+in+human+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) Rep proteins mediate complex formation between AAV DNA and its integration site in human DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 91 (13), 5808-5812 (1994).</li>
<li>Miller, D. G., Petek, L. M., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vectors+integrate+at+chromosome+breakage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vectors integrate at chromosome breakage sites.</a> Nature Genetics. 36 (7), 767-773 (2004).</li>
<li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+AAV+vector+integration+into+CRISPR-induced+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High levels of AAV vector integration into CRISPR-induced DNA breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 4439(2019).</li>
<li>Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+mediated+by+adeno-associated+virus+and+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (10), 3558-3565 (2003).</li>
</ol>

A.C.M. est consultant pour Janssen Pharmaceuticals et siège au SAB de NewBiologix. Tous les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Clonage Le protocole de clonage n’est pas limité au plasmide pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 utilisé ci-dessus et peut être facilement modifié en fonction des besoins expérimentaux d’un chercheur. De nombreux plasmides contenant de l’ITR sont facilement disponibles à l’achat en ligne. Par exemple, des plasmides contenant à la fois Cas9 et un site de clonage d’ARNsg sont disponibles, mais nécessitent peu d’étapes supplémentaires telles que le recuit des oligonucléotides et le traitement PNK30. De plus, des plasmides contenant un site de clonage multiple (MCS) avec uniquement des ITR et aucun élément de régulation interne peuvent être trouvés31. Si différents plasmides doivent être utilisés, les enzymes de restriction (ER) utilisées pour la digestion sont généralement les seuls éléments qui peuvent avoir besoin d’être modifiés dans ce protocole. Cependant, l’une des limites du rAAV est sa capacité de chargement limitée. En raison des limitations physiques de la capside, le génome du vecteur ne doit pas dépasser 4,9 kb, y compris les ITR.
Lors de l’isolement d’un plasmide à partir de bactéries, il est essentiel d’utiliser un kit midiprep ou maxiprep à faible teneur en endotoxines ou sans endotoxines pour atténuer les dommages causés aux cellules lors de la transfection ou de la transduction de trois plasmides. Les plasmides des kits de mini-préparation contiennent souvent des impuretés plus élevées, des concentrations réduites et moins d’ADN superenroulé, ce qui peut affecter la production en aval de rAAV et n’est donc pas recommandé.
Il est essentiel de comprendre la structure et les propriétés des RTI pendant le clonage. Premièrement, il est extrêmement difficile d’utiliser la PCR dans le cadre de l’ITR. Les modèles de clonage qui nécessitent une amplification par PCR par ITR doivent être évités et limiter en outre l’utilisation de la technique de clonage d’assemblage Gibson. En tant que tel, le clonage enzymatique de restriction est la méthode préférée pour le clonage dans des plasmides contenant de l’ITR. De plus, certaines amorces pour le séquençage de Sanger peuvent ne pas être compatibles si la région séquencée contient l’ITR. Au lieu de cela, il est recommandé d’utiliser des amorces qui s’éloignent des ITR et pénètrent dans le corps du génome du vecteur pour obtenir des résultats de séquençage plus précis. Deuxièmement, les ITR sont sujets à des délétions et des réarrangements et des mutations lorsqu’ils sont transformés en bactéries pour l’amplification plasmidique32,33. Pour atténuer ces événements, il est recommandé d’utiliser des souches bactériennes compétentes déficientes en recombinaison, telles que Stbl3, et de les incuber à 30 °C pour ralentir les divisions cellulaires. Enfin, il a été observé que des colonies plus petites peuvent correspondre à des clones sans réarrangements ni délétions de plus petite taille, car celles qui n’ont pas d’ITR peuvent conférer un avantage de croissance et être plus grandes. Par conséquent, il est recommandé de choisir des colonies petites.
Production vectorielle La production réussie du vecteur rAAV peut être affectée par plusieurs éléments. Un facteur critique est la santé des cellules HEK293 ou 293T utilisées pour la transfection. En général, un faible nombre de passages est idéal, car les cellules fortement traversées peuvent présenter des variances génotypiques et phénotypiques qui peuvent réduire les titres de rAAV. De plus, la densité des cellules ensemencées doit être de 75 % à 90 % de confluence pour une production efficace. Les cellules clairsemées génèrent de faibles rendements vectoriels car il y a moins de cellules disponibles pour produire des vecteurs, tandis que les cellules envahies par la végétation ne seront pas transfectées efficacement.
Les variations entre les lots de réactifs, les stocks cellulaires et la variabilité générale d’un laboratoire à l’autre contribuent aux différences dans l’efficacité de la transfection et le titre de production. Un facteur optimisable qui peut conduire à des améliorations du titre est le rapport plasmide/PEI dans les réactions de transfection. Il est essentiel d’utiliser du PEI MAX frais (&lt;1 mois). Il est recommandé d’utiliser un rapport plasmide :PEI de 1 :1 comme point de départ, et si l’efficacité de la transfection ou de la transduction semble médiocre, tester plusieurs rapports différents. L’optimisation du titre est plus facile si l’on utilise un transgène avec une lecture visuelle, tel que le trangene rapporteur CMV.Luc.IRES.EGFP utilisé ici comme matériau de départ pour le clonage. Pour effectuer l’optimisation, suivez l’étape 3 du protocole en utilisant une plaque à 12 puits et en réduisant par deux les masses de plasmides et les volumes de réactifs (la masse finale du plasmide est de 2,6 μg). Ajustez le volume de l’IPE en conséquence pour qu’il corresponde à des rapports allant de 1 :0,75 à 1 :3, avec des incréments croissants de 0,25 (Figure 6). Diluer chaque réaction avec 950 μL de média SF après 15 min. Pour plus de commodité, il est possible de préparer un mélange maître contenant les plasmides triples et de les pipeter individuellement dans des tubes de 1,5 ml avant d’ajouter l’Île-du-Prince-Édouard (voir le fichier supplémentaire 2). Récoltez le vecteur, transduisez les cellules d’intérêt et imagez. Le puits ayant l’efficacité de transduction la plus élevée (proportion de cellules GFP+) correspond au titre le plus élevé et au rapport PEI :ADN le plus optimal.
<img alt="Schéma du processus de transfection plasmidique : Préparer le mélange maître, faire varier les ratios PEI, transduire les cellules, récolter le vecteur." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figure 6 : Flux de travail d’optimisation de l’Île-du-Prince-Édouard. Schéma des étapes nécessaires à l’optimisation de l’Île-du-Prince-Édouard. Plusieurs rapports plasmide/PEI sont testés pour déterminer le rapport optimal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Considérations relatives à la récolte et au titre La technique de congélation/décongélation utilisée pour récolter le vecteur rAAV lyse efficacement les cellules HEK293 d’une manière compatible avec l’utilisation directe du lysat clarifié pour transduire les cellules cultivées. Certains sérotypes de rAAV, tels que AAV1, AAV8 et AAV9, sont libérés par les cellules lors de la production de vecteurs et peuvent être récoltés à partir du milieu cellulaire cultivé sans cycles de congélation/décongélation34. La méthode décrite ici donne généralement des titres de l’ordre de 1 x 1010 VG/mL lors de l’utilisation de capsides AAV2, et de 1 x10 11 VG/mL pour AAV8. Bien que des titres plus élevés puissent être obtenus par lyse à base de détergent ou d’autres produits chimiques, ceux-ci sont nocifs pour les cellules en utilisation en aval et nécessitent que les rAAV soient purifiés davantage à partir du lysat. Un titre plus faible est un compromis qu’un chercheur doit prendre en compte pour déterminer si les préparations brutes sont appropriées à ses besoins de recherche, cependant, les titres légèrement inférieurs produits par les méthodes décrites ici peuvent très bien transduir de nombreux types de cellules (voir les résultats représentatifs). En plus de l’efficacité de la transfection et de la santé cellulaire, les titres de vecteur varient en fonction de la capside utilisée lors de la production de rAAV et de la taille et de la séquence du transgène dans le VG35.
Lors de la récolte de préparations de vecteurs bruts, l’ADN plasmidique utilisé lors de la transfection de trois plasmides peut être présent et, bien que rare, entraîner une transfection en aval pendant la transduction. De plus, les VG non emballés peuvent se lier à l’extérieur des capsides et invoquer une réponse immunitaire innée à l’ADN simple brin nu et étranger36,37. Par conséquent, les types de cellules sensibles peuvent nécessiter que les préparations de vecteurs soient digérées et purifiées par la DNase pour éliminer les VG et les plasmides non emballés.
Si l’on souhaite calculer le titre d’une préparation brute, la qPCR peut être réalisée pour quantifier le nombre de VG conditionnés à l’intérieur des particules résistantes à la DNase (DRP). En bref, une petite quantité de préparation brute est digérée par la DNase pour éliminer l’ADN plasmidique, les acides nucléiques contaminants ou le VG partiellement emballé. L’échantillon est ensuite soumis à la qPCR et la VG protégée à l’intérieur des PRD est quantifiée, ce qui donne un titre avec des unités de génome vecteur par mL de préparation brute38. Il n’est pas recommandé d’effectuer un titrage vectoriel à l’aide de tests ELISA qui quantifient les titres de capside. Par rapport au virus AAV de type sauvage, le rAAV souffre d’une proportion de capsides vides et partiellement emballées39. Le test ELISA va quantifier toutes les capsides quel que soit leur contenu génomique et va surestimer les unités transductibles présentes dans une préparation, qui nécessite un VG conditionné.
Considérations relatives à la transduction De nombreux facteurs influencent les transductions de rAAV et des considérations appropriées doivent être prises en compte pour toute nouvelle expérience. Selon le promoteur à l’origine de l’expression du transgène, l’expression peut se produire dès 4 h après la transduction (hpt), et le pic d’expression est généralement atteint à 48 hpt. Il est important de garder à l’esprit le temps écoulé entre l’ensemencement initial des cellules et le point final expérimental. Il s’agit d’estimer la confluence initiale des cellules et de s’assurer qu’elles ne prolifèrent pas à la fin de l’expérience. Si les cellules deviennent trop confluentes, le comportement cellulaire peut être modifié en raison d’une réponse au stress et peut fausser les résultats expérimentaux. Certains types de cellules, comme U2-OS, peuvent assez bien tolérer la prolifération / l’inhibition du contact. De plus, ils peuvent résister à de longues périodes (48 h+) dans un milieu conditionné sans sérum, produit de ce protocole de production. Cependant, les types de cellules sensibles peuvent nécessiter l’ajout ou la dilution de sérum de la préparation brute avec un milieu de croissance spécial pour maintenir la santé pendant la transduction. Une efficacité de transduction légèrement réduite par l’utilisation de milieux contenant du sérum est un compromis potentiel pour la santé cellulaire et devrait être prise en compte par le chercheur.
En règle générale, pour les cellules à division rapide, une confluence de départ d’environ 50 % est optimale pour les applications qui se termineront à 48 ch. Cependant, la confluence peut être ajustée en conséquence en fonction des besoins de l’expérience. Il n’est pas recommandé de transduire des lignées cellulaires immortalisées de type monocouche au-delà de 75 % de confluence en raison de la diminution de l’efficacité de la transduction. La plupart des types de cellules cultivées sont transduits avec succès et sains après une nuit d’incubation avec des préparations brutes de rAAV, suivies d’un changement vers un milieu frais contenant du sérum le matin.
Le sérotype de capside est un facteur important à prendre en compte lors de la production de rAAV pour la transduction d’une cellule cible, car la capside est le principal déterminant du tropisme cellulaire et de l’expression subséquente du transgène13. AAV2 est un sérotype largement utilisé en raison de sa capacité à transduire efficacement de nombreux types de cellules cultivées12. Cette propriété de l’AAV2 peut être attribuée au fait que les protéoglycanes sulfate d’héparine (HSPG) servent de principal facteur d’attachement à l’AAV2 et aux niveaux élevés de HSPG sur les cellules en culture de l’adaptation à la croissance dans une boîte40. D’autres capsides, telles que AAV9, sont moins efficaces pour transduire de grands types de cellules et peuvent s’expliquer par leurs facteurs d’attachement de dépendance qui ne sont pas exprimés dans ce contexte41. Par conséquent, nous recommandons AAV2 comme capside de premier choix dans les cellules en culture si une cellule cible souhaitée n’a pas déjà été testée avec le rAAV dans la littérature.
Veuillez noter que l’une des principales limites des préparations vectorielles brutes est qu’elles ne sont pas appropriées pour la transduction de modèles animaux. Les études in vivo nécessitent que les préparations soient purifiées et soumises à une évaluation de la qualité.
Considérations relatives à l’expression des transgènes et à leur intégration potentielle Les rAAV n’entraînent pas de manière fiable une expression permanente du transgène. Au fil du temps, les VG peuvent être réduits au silence et l’expression transgénique peut être arrêtée après plusieurs passages42. De plus, la majorité des VG restent épisomiques et les rAAV ne contiennent pas les protéines virales Rep qui médieraient une intégration fréquente dans le génome de l’hôte comme dans une infection lysogénique virale de type sauvage ou favoriseraient la réplication des VGs43. En conséquence, les épisomes dans les cellules transduites finiront par être dilués entre les cellules filles par divisions.
L’intégration au niveau basal est possible pour tout le matériel d’ADN transgénique livré. Cependant, les VG contenant de l’ITR sont susceptibles d’être intégrés à une fréquence plus élevée44. Par conséquent, l’expression permanente d’un transgène peut être observée dans un petit sous-ensemble de cellules. Les utilisateurs doivent envisager cette possibilité, en particulier lorsqu’ils utilisent le rAAV pour délivrer des enzymes de coupe de l’ADN, telles que Cas9, car les cassures double brin peuvent entraîner une fréquence d’intégration et d’expression permanente encore plus élevée45. Bien que cela fasse de rAAV un bon candidat pour fournir des modèles de réparation dirigés par homologie pour le marquage endogène ou l’ajout de gènes, la possibilité d’insertion de Cas9 doit être considérée19,46.

L’élucidation des bases moléculaires des fonctions cellulaires nécessite souvent l’expression d’ADN transgénique en culture cellulaire. Pour être exprimés, les transgènes doivent pénétrer à travers la membrane sélective d’une cellule et atteindre le noyau 1,2. Par conséquent, la capacité de contourner efficacement les barrières physiques de la cellule et de manipuler ses processus centraux est une nécessité pour appliquer la transgénèse à la découverte de nouveaux phénomènes biologiques. L’une d’entre elles s’appuie sur la capacité intrinsèque des virus à délivrer et à exprimer de l’ADN étranger 3,4.
Le virus adéno-associé (AAV) est l’un des plus petits virus de mammifères : son génome d’ADN simple brin de 4,7 kilobases (kb) contient deux gènes, rep (pour réplicase) et cap (pour capside), emballés à l’intérieur d’une capside icosaédrique de 60 mères mesurant 25 nm. Les gènes rep/cap ont de multiples promoteurs, cadres de lecture et produits d’épissage qui codent pour au moins neuf protéines uniques nécessaires à la réplication, à la production et à l’emballage du virus 5,6. De plus, les deux extrémités du génome contiennent des structures secondaires appelées répétitions terminales inversées (ITR) qui sont nécessaires à la réplication de l’ADN, à l’empaquetage du génome et au traitement en aval lors de la transduction 7,8,9,10. Les ITR sont les seuls éléments d’ADN nécessaires à l’empaquetage du génome dans la capside, et par conséquent, l’AAV peut être cloné à des fins d’administration de transgènes en remplaçant les gènes rep/cap viraux par le choix d’un chercheur d’éléments régulateurs et/ou de gènes d’intérêt6. L’AAV recombinant (rAAV) qui en résulte, avec un génome vectoriel modifié (VG), est largement utilisé en clinique pour la thérapie génique humaine et a accumulé des succès11. Une utilisation sous-estimée du vecteur est en laboratoire ; Les rAAV peuvent atteindre efficacement l’expression de transgènes dans des cellules en culture pour répondre aux besoins expérimentaux d’un chercheur12.
La méthode la plus courante pour produire du rAAV est la transfection de trois plasmides dans des cellules HEK293 ou 293T (Figure 1). Le premier plasmide, communément appelé plasmide cis, contient le transgène souhaité flanqué d’ITR (pAAV). Selon l’application, des plasmides cis avec des éléments communs, tels que des promoteurs puissants ou des outils basés sur CRISPR, sont disponibles à l’achat. Le second est le plasmide pRep/Cap qui contient les gènes AAV rep et cap de type sauvage fournis en trans – c’est-à-dire sur un plasmide séparé non ITR qui exprime des éléments régulateurs et structurels qui interagissent ensuite avec le plasmide cis – et est donc appelé plasmide trans. En plus d’enfermer physiquement la VG, la capside influence le tropisme cellulaire12,13. En fournissant le gène de la coiffe spécifique au sérotype in-trans, les chercheurs sont facilement en mesure de maximiser l’efficacité de la transduction en choisissant un sérotype de capside optimisé pour leur cellule cible donnée. Enfin, en tant que Dependoparvovirus, l’AAV a besoin d’un virus auxiliaire pour activer l’expression rep/cap de ses promoteurs viraux, obtenue par des gènes auxiliaires adénoviraux, fournis sur un troisième plasmide tel que pAdΔF614,15. Après 72 h de transfection de trois plasmides, le vecteur peut être libéré des cellules productrices dans le milieu de culture par des cycles répétés de congélation/décongélation. L’ensemble du contenu de la plaque est ensuite collecté et les gros débris cellulaires sont éliminés par centrifugation ; le surnageant de média qui en résulte est une préparation brute de rAAV prête pour les transductions en aval.
<img alt="Transfection cellulaire HEK 293(T), récolte de vecteurs, diagramme de processus de transduction, analyse de l’expression génique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Vue d’ensemble de la production de vecteurs rAAV bruts. La production et la transduction de rAAV brut peuvent être accomplies en 5 jours. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Le rAAV peut être plus favorable à l’administration de transgènes par rapport à d’autres méthodes de transfection, qui sont généralement associées à une toxicité cellulaire, à une faible efficacité et à des réactifs et équipements coûteux, tels que l’électroporation ou la transfection à base de produits chimiques/lipidiques16,17. Le rAAV contourne ces obstacles et fournit souvent une puissante expression de transgène avec une toxicité minimale et un temps de manipulation minimal. Il est important de noter que la production de rAAV et son application en culture cellulaire sont simples et nécessitent rarement la purification du vecteur à partir du milieu de culture (Figure 1). De plus, le rAAV n’intègre pas son VG dans le génome de l’hôte, contrairement à l’administration du transgène lentiviral, et réduit ainsi le risque de mutagénèse insertionnelle18. Malgré les avantages potentiels de l’utilisation du rAAV pour l’administration de transgènes, des limites doivent être prises en compte. Il est important de noter que la taille du transgène, y compris les ITR, ne doit pas dépasser 4,9 kb en raison des contraintes physiques de la capside, ce qui limite la capacité d’un chercheur à fournir efficacement de grands éléments régulateurs et transgènes. De plus, étant donné que le rAAV est un virus non intégrateur, la transduction entraîne l’expression transitoire du transgène dans les cellules en division et peut ne pas être pratique pour une expression stable. Cependant, des méthodes utilisant deux modèles Cas9 délivrés par rAAV et des modèles de réparation dirigée par homologie (HDR) peuvent être utilisées pour insérer de manière stable des séquences à des loci génomiques spécifiques si un chercheur le souhaite19.

<table><tbody><tr><td>Snapgene (en</td>) <td>Snapgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40</td><td>AddGene</td><td>105533</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/2 (Rep/Cap)</td><td>AddGene</td><td>104963</td><td></td></tr><tr><td>pAd&Delta ; F6</td><td>AddGene</td><td>112867</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Carbenicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0418</td><td></td></tr><tr><td>Boekel Scientific Economy Incubateur numérique</td><td>Boekel Scientific</td><td>133000</td><td></td></tr><tr><td>LB moyen, poudre</td><td>MP Biomedicals</td><td>113002042</td><td></td></tr><tr><td>Carbencilline (disodique)</td><td>GoldBio</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>Nouveau-Brunswick I26 Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>M1324-0000</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes à centrifuger</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22627040</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPS</td><td>USA Scientific</td><td>1402-3900</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler nexus</td><td>Eppendorf</td><td>6333000022</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>5x Tampon de Phusion</td><td>NEB</td><td>B0518S</td><td>Fourni à l’achat de Phusion Polymérase</td></tr><tr><td>Phusion&nbsp ; Colorant de chargement de gel d’ADN polymérase haute fidélité</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>, orange (6X)</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean & Concentrateur-100</td><td>Zymo</td><td>D4029</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td><td>Zymo</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer (10x)</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>Fourni à l’achat de l’enzyme</td></tr><tr><td>de restriction UltraPure Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16500100</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de réaction à l’ADN ligase T4</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>Fourni avec l’achat de tubes T4 Ligase</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock (1,5 ml)Bain d’eau</td> à microprocesseur <td>de</td> précision <td>Eppendorf</td> 22363204 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>51221046</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de culture en plastique stériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>149566B</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation de 2,0 mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>1149Y01</td><td></td></tr><tr><td>ZR Plasmid Miniprep - Classic</td><td>Zymo</td><td>D4015</td><td></td></tr><tr><td>Xma1 NEB</td><td></td><td>R0180S</td><td></td></tr><tr><td>Sma1</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6 puits</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp ; DMEM, haute teneur en glucose, pyruvate</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Sanyo MCO-18AIC(UV) Incubateur CO2</td><td>Marshall Scientific</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX (Chlorhydrate de polyéthylénimine)</td><td>Polysciences</td><td>24765-100</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur Vortex Genie 2</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>102091-234</td><td></td></tr><tr><td>Sanyo Congélateur Ultra Low Sanyo</td><td></td><td>14656-15267-16219</td><td></td></tr><tr><td>INCU-Line IL 10 avec fenêtre transparente</td><td>VWR</td><td>390-0384</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuses Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-005</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 96-well</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J souris</td><td>JAX</td><td>souche #000664</td><td></td></tr><tr><td>milieu de croissance organoïde</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>6005</td><td></td></tr><tr><td>L Wnt-3A cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>inhibiteur</td> de <td>ROCK STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72052</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Facteur de croissance réduit (GFR) Membrane basale</td><td>Fisher</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>plaque à 24 puits</td><td>Fisher</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 avec 15 mM HEPES</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>polybrène</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 48 puits</td><td>Fisher</td><td>08-772-3D</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp ; Nunc Lab-Tek Coverglass chambré</td><td>Fisher</td><td>12-565-470</td><td></td></tr><tr><td>Cellules BeWo</td><td>ATCC</td><td>CCL-98</td><td></td></tr><tr><td>F-12K Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Hepa1-6</td><td>ATCC</td><td>CRL-1830</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>UC Berkeley BSD Installation de culture cellulaire</td><td>HUH-7</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>HSkMC</td><td>ATCC</td><td>PCS-950-010</td><td></td></tr><tr><td>Croissance des cellules musculaires squelettiques Medium</td><td>Sigma</td><td>C-23060</td><td></td></tr><tr><td>Différenciation des muscles squelettiques Medium</td><td>Sigma</td><td>C-23061</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp ; EVOS Microscope numérique à fluorescence couleur</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-340</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Opera Phenix</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH14001000</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate 96 puits</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055302</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glycémie élevée, pas de glutamine, pas de rouge de phénol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplément</td><td>Thermo-Fisher</td><td>35050079</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/5 (Rep/Cap)</td><td>Addgene</td><td>104964</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/8 (Rep/Cap)</td><td>Addgene</td><td>112864</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap)</td><td>Addgene</td><td>130878</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/9n (Rep/Cap)</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td></td></tr><tr><td>pAnc80L65AAP</td><td>Addgene</td><td>92307</td><td></td></tr><tr><td>KP1 (rep/cap)</td><td></td><td></td><td>offert par le professeur Mark Kay (Université de Stanford)</td></tr><tr><td>LK03 (rep/cap)</td><td></td><td></td><td>offert par le professeur Mark Kay (Université de Stanford)</td></tr><tr><td>pAAV4 (rep/cap)</td><td></td><td></td><td>offert par le professeur Luk Vandenberghe (Harvard Medical School)</td></tr><tr><td>pAAV.Cas9.sgRNA</td><td>Addgene</td><td>61591</td><td></td></tr><tr><td>pAAV.MCS</td><td>Addgene</td><td>46954</td><td></td></tr><tr><td>gBlock (fragmentation de l’ADN synthétique)</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

expression de transgènes dans des cellules en culture à l’aide de vecteurs viraux adéno-associés recombinants non purifiés

Transgene Expression in Cultured Cells Using Unpurified Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors

Les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV) peuvent obtenir une expression transgénique puissante et durable sans intégration dans un large éventail de types de tissus, ce qui en fait un choix populaire pour l’administration de gènes dans des modèles animaux et dans des contextes cliniques. En plus des applications thérapeutiques, les rAAV sont un outil de laboratoire utile pour fournir des transgènes adaptés aux besoins expérimentaux et aux objectifs scientifiques du chercheur dans des cellules en culture. Parmi les exemples, citons les gènes rapporteurs exogènes, les cassettes de surexpression, l’interférence de l’ARN et les outils basés sur CRISPR, y compris ceux pour les criblages à l’échelle du génome. Les transductions de rAAV sont moins nocives pour les cellules que l’électroporation ou la transfection chimique et ne nécessitent pas d’équipement spécial ou de réactifs coûteux pour être produites. Des lysats bruts ou des milieux conditionnés contenant des rAAV peuvent être ajoutés directement aux cellules en culture sans purification supplémentaire pour transduire de nombreux types de cellules, une caractéristique sous-estimée des rAAV. Ici, nous fournissons des protocoles pour le clonage de base de cassettes de transgènes et démontrons comment produire et appliquer des préparations brutes de rAAV sur des cellules en culture. Comme preuve de principe, nous démontrons la transduction de trois types de cellules qui n’ont pas encore été rapportés dans les applications de rAAV : les cellules placentaires, les myoblastes et les organoïdes de l’intestin grêle. Nous discutons des utilisations appropriées des préparations brutes de rAAV, des limites des rAAV pour l’administration des gènes et des considérations relatives au choix de la capside. Ce protocole décrit une méthode simple, peu coûteuse et efficace permettant aux chercheurs d’obtenir une livraison productive d’ADN en culture cellulaire à l’aide de rAAV sans avoir besoin d’étapes laborieuses de titrage et de purification.

Trouver la capside optimale pour la transduction des cellules d’intérêt cultivées Divers types de cellules ont été transduits pour déterminer le tropisme de divers sérotypes de capside (Figure 5). Les sérotypes naturels AAV2 14, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV924 et les variantes de capside modifiées Anc80 25, DJ 26, LK0327 etKP1 28 ont été emballés avec un génome vecteur exprimant mScarlet sous un promoteur CMV, cloné à l’aide des méthodes fournies dans ce protocole. Des préparations vectorielles brutes non titrées ont été diluées dans les milieux de culture appropriés et les cellules ont été transduites pendant 24+ h et imagées (Figure 5B). L’efficacité de la transduction a été calculée par la proportion de cellules totales qui étaient mScarlet+, ou la proportion de cellules dans un seul plan z qui étaient mScarlet+ (pour les organoïdes de l’intestin grêle de souris ; Graphique 5C). L’efficacité de la transduction (cellules mScarlet+) n’est pas fournie pour les myotubes C2C12 et HSkMC différenciés, mais plutôt pour les myoblastes C2C12 et HSkMC indifférenciés (Figure 5A).
AAV2 et KP1 étaient les sérotypes les plus puissants parmi les lignées cellulaires testées (Figure 5A). Il a également été observé que des types de cellules similaires provenant d’espèces différentes sont transduits à des efficacités variables. Par exemple, Hepa1-6 (une lignée de cellules hépatiques dérivées de murines) présente une diminution marquée de la transduction par rapport à Huh7 (une lignée de cellules hépatiques d’origine humaine) lors de l’utilisation d’AAV2 (Figure 5B). De plus, les différentes conditions du milieu jouent un rôle important lors de la transduction. Les organoïdes de l’intestin grêle (mSIO) de souris cultivés dans un milieu de pré-transduction sont moins efficaces que ceux cultivés dans un milieu de croissance organoïde (Figure 5C). De plus, AAV2 transduit efficacement les myoblastes HSkMC indifférenciés et les myotubes HSkMC différenciés (Figure 5B), bien que l’analyse quantitative des myotubes soit difficile et ne soit donc pas fournie.
Les rendements de transduction élevés observés pour divers types de cellules dans la figure 5 montrent que les préparations de vecteurs bruts peuvent être utilisées efficacement pour transduire une variété de types de cellules sans autres étapes telles que la purification et le titrage. Cependant, une attention particulière doit être accordée lors du choix d’une capside pour maximiser l’administration du transgène. De nombreuses autres lignées cellulaires et capsides ont déjà été testées et sont publiées, mais avec des préparations de vecteurs purifiés12.
Un effet indépendant des particules vectorielles des conditions du milieu peut affecter l’efficacité de la transduction. Cependant, il est généralement admis que le tropisme (c’est-à-dire l’absorption et l’expression du vecteur spécifiques au type cellulaire) est une propriété spécifique de la capside29. Il n’a pas encore été observé qu’une comparaison entre les préparations brutes et les préparations purifiées à doses appariées affecte le tropisme cellulaire. Par conséquent, les préparations de vecteurs bruts peuvent être utilisées de la même manière que les vecteurs purifiés en culture cellulaire.
<img alt="l’efficacité de la transduction du vecteur AAV dans les lignées cellulaires ; Tableau de données, images de microscopie à fluorescence." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figure 5 : Transduction vectorielle brute de différents types de cellules. (A) Pourcentage de mScarlet+ après l’ajout de divers vecteurs AAV contenant un transgène mScarlet. (B) Cellules exprimant mScarlet délivrées par le sérotype 2 de l’AAV. Barres d’échelle : 100 μm (Hepa1-6, Huh7, C2C12 et HSkMC), 200 μm (BeWo), 20 μm (mSIO). Abréviations : hpt = heures après la transduction. (C) Les organoïdes de l’intestin grêle (mSIO) de souris ont été traités soit par rAAV dans des milieux de pré-transduction, soit dans des milieux de croissance d’organoïdes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Feuille de travail sur la transfection de trois plasmides. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/TriplePlasmidTransfection_Worksheet_RE.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire 2 : Feuille de travail sur l’optimisation de l’Île-du-Prince-Édouard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/PEIoptimization_Worksheet_RE.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Le virus adéno-associé recombinant (rAAV) est largement utilisé pour l’administration de gènes cliniques et précliniques. Une utilisation sous-estimée des rAAV est la transduction robuste des cellules en culture sans avoir besoin de purification. Pour les chercheurs qui découvrent le rAAV, nous fournissons un protocole pour le clonage de cassettes transgéniques, la production de vecteurs bruts et la transduction de cultures cellulaires.

Expression de transgènes dans des cellules en culture à l’aide de vecteurs viraux adéno-associés recombinants non purifiés

Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) can achieve potent and durable transgene expression without integration in a broad range of tissue ...

La thérapie génique utilise une capside virale pour introduire de l’ADN dans les cellules, puis les cellules traitent cet ADN par des mécanismes qui ne sont pas entièrement compris. En étudiant comment la cellule traite l’ADN délivré par l’AAV, nous espérons améliorer l’innocuité, l’efficacité et la longévité des thérapies géniques AAV. L’étude du traitement de l’ADN AAV au niveau des tissus ou de l’organisme était assez difficile.Et alors que nous développions des protocoles de transduction de culture cellulaire pour la visualisation de l’AAV par microscopie à super résolution, nous avons constaté que la simplicité de production et d’utilisation de préparations d’AAV non purifiées en culture cellulaire n’était pas bien connue. Cette méthode simple d’expression transitoire peut être avantageuse pour les chercheurs dans de nombreux domaines. La création de préparations AAV brutes est assez simple, et elles ont une longue durée de conservation F4C, ce qui leur permet d’être utilisées dans de nombreuses expériences.Leur application est simple, ce qui en fait une alternative rapide et rentable aux réactifs de transfection standard. Souvent, les préparations brutes AAV sont plus efficaces et moins toxiques que la transfection. La vectrologie a deux bras, la production et la transduction, et les deux sont entièrement dépendants de la machinerie cellulaire de l’hôte.Nos recherches futures visent à identifier la machinerie cellulaire impliquée dans ces processus et les moyens de les manipuler afin d’améliorer l’efficacité de la production et de la transduction. Comprendre la biologie de base qui sous-tend les deux branches de la vectrologie est essentiel pour le succès des thérapies géniques.

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Dans cet article, nous décrivons l'identification du virus adéno-associé de sérotype 3 (AAV3) comme le vecteur le plus efficace pour cibler les cellules humaines de cancer du foie.

Haute-efficacité de la transduction des cellules cancéreuses du foie par recombinants sérotype virus adéno-associé 3 Vecteurs

Recombinant virus adéno-associés (rAAVs) vecteurs sont de plus en plus précieux...

Production et titrage des adéno-associé recombinant vecteurs viraux

Nous démontrons la technique de base pour concevoir et faire évoluer moléculaire synthétiques viral adéno-associé (AAV) vecteurs de thérapie génique par l'intermédiaire de la famille réarrangement d'ADN. En outre, nous fournir des directives générales et des exemples représentatifs de sélection et d'analyse des différents capsides chimériques avec des propriétés améliorées sur les cellules cibles en culture ou chez la souris.

Vecteurs d&#39;ingénierie et de l&#39;évolution de la synthèse Adeno-Associated Virus (AAV) thérapie génique par la famille de réarrangement d&#39;ADN

Le transfert de gène adénoviral en CD4 des cellules T naïves avec expression transgénique du récepteur de l'adénovirus Coxsackie permet l'analyse moléculaire de la différenciation des cellules T...

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Intrarachidienne de recombinase dépendant adeno-associated virus recombinant (rAAV) peut être utilisée pour manipuler n’importe quel type de cellules génétiquement marquées dans la moelle épinière. Ici, nous décrivons comment transmettre des neurones de la corne dorsale de la moelle épinière lombaire. Cette technique permet d’interrogatoire fonctionnelle du sous-type neurone manipulé.

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression dans les neurones de la moelle épinière génétiquement définies

Nous décrivons ici une stratégie efficace et reproductible pour produire, titre et contrôle de la qualité des lots de vecteurs de virus adeno-associé. Il permet à l’utilisateur d’obtenir une préparation de vecteur avec haut-titre (≥1 x 1013 vecteur génomes/mL) et une grande pureté, prêt à être utilisé in vitro ou in vivo .

Production, Purification et contrôle de la qualité pour les vecteurs de base de Virus Adeno-associé

Ici, nous présentons un protocole pour la production d’adénovirus en utilisant le système pAdEasy. La technologie comprend la recombinaison des plasmides pAdTrack et pAdEasy-1, l’emballage et l’amplification des adénovirus, la purification des particules adénoviraux du lysat cellulaire et du milieu de culture, le titrage viral et le test fonctionnel de l’adénovirus.

Une méthode efficace pour la production d’adénovirus

Des méthodes sont décrites pour la génération de grandes quantités d’adénovirus recombinants, qui peuvent ensuite être utilisés pour transduire l’urothélium de rongeur natif permettant l’expression de transgènes ou la régulation négative de produits géniques endogènes.

Expression de transgènes dans l’urothélium vésical natif par transduction médiée par adénovirus

Le virus adéno-associé est produit en culture cellulaire en suspension et purifié par centrifugation à double gradient de densité d’iodixanol. Des étapes sont incluses pour augmenter le rendement total du virus, réduire le risque de précipitation du virus et concentrer davantage le produit viral final. Les titres finaux attendus atteignent 10à 12 particules virales/mL et conviennent à une utilisation préclinique in vivo .

Culture en suspension, production et purification de virus adéno-associés par centrifugation par gradient de densité d’iodixanol pour des applications in vivo

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour la génération et la purification de vecteurs viraux adéno-associés à l’aide d’une méthode de chromatographie d’affinité optimisée basée sur l’héparine. Il s’agit d’une approche simple, évolutive et rentable, qui élimine le besoin d’ultracentrifugation. Les vecteurs résultants présentent une pureté et une activité biologique élevées, ce qui prouve leur valeur dans les études précliniques.

Isolement de vecteurs viraux adéno-associés au moyen d’un protocole de chromatographie d’affinité d’héparine en une seule étape et semi-automatisé

Découvrez une méthode simplifiée de transduction cellulaire utilisant des préparations d'AAV non purifiés pour l'expression transgène. Cette approche économique et efficace offre une alternative moins toxique aux méthodes de transfection traditionnelles en thérapie génique.

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