Name: Production et optimisation de LTE, un système d’expression de protéines acellulaires dérivé de Leishmania tarentolae pour la production de protéines recombinantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T12:10:00.000+00:00
Duration: 3 min 59 s
Description: Découvrez le système d'expression acellulaire LTE dérivé de Leishmania tarentolae pour produire des protéines recombinantes. Cette version lyophilisée stable à température ambiante simplifie le transport et les applications sur le terrain.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocole simplifié pour la production d’extraits translationnels de Leishmania (LTE)

<ol><li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The dependence of cell-free protein synthesis in E.coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 47 (10), 1588-1602 (1961).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2.3+mg%2Fml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li>
<li>Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Bacillus+subtilis+cell-free+transcription-translation+system+for+prototyping+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements.</a> Metab Eng. 38, 370-381 (2016).</li>
<li>Ezure, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+system+prepared+from+insect+cells+by+freeze-thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis system prepared from insect cells by freeze-thawing.</a> Biotechnol Prog. 22 (6), 1570-1577 (2006).</li>
<li>Harbers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheat+germ+systems+for+cell-free+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Wheat germ systems for cell-free protein expression.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2762-2773 (2014).</li>
<li>Kobs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+the+cell-free+protein+expression+system+that+meets+your+experimental+goals%5BTitle%5D)+AND+%22Promega+Corporation%22%5BJournal%5D)">Selecting the cell-free protein expression system that meets your experimental goals.</a> Promega Corporation. 21, 6-9 (2008).</li>
<li>Kovtun, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+cell-free+protein+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Leishmania cell-free protein expression system.</a> Methods. 55 (1), 58-64 (2011).</li>
<li>Basile, G., Peticca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Leishmania+tarentolae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Leishmania tarentolae.</a> Mol Biotechnol. 43 (3), 273-278 (2009).</li>
<li>Mureev, S., Kovtun, O., Nguyen, U. T., Alexandrov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-independent+translational+leaders+facilitate+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Species-independent translational leaders facilitate cell-free expression.</a> Nat Biotechnol. 27 (8), 747-752 (2009).</li>
<li>Gambin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+reveals+the+oligomerization+and+folding+steps+driving+the+prion-like+behavior+of+ASC%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence reveals the oligomerization and folding steps driving the prion-like behavior of ASC.</a> J Mol Biol. 430 (4), 491-508 (2018).</li>
<li>Sierecki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mapping+of+interactions+between+human+SNX-BAR+proteins+measured+in+vitro+by+AlphaScreen+and+single-molecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Rapid mapping of interactions between human SNX-BAR proteins measured in vitro by AlphaScreen and single-molecule spectroscopy.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2233-2245 (2014).</li>
<li>Sierecki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomolar+oligomerization+and+selective+co-aggregation+of+alpha-synuclein+pathogenic+mutants+revealed+by+single-molecule+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Nanomolar oligomerization and selective co-aggregation of alpha-synuclein pathogenic mutants revealed by single-molecule fluorescence.</a> Sci Rep. 6, 37630(2016).</li>
<li>Leitao, A., Bhumkar, A., Hunter, D. J. B., Gambin, Y., Sierecki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+a+selective+mechanism+for+the+inhibition+of+alpha-synuclein+aggregation+by+beta-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Unveiling a selective mechanism for the inhibition of alpha-synuclein aggregation by beta-synuclein.</a> Int J Mol Sci. 19 (2), 334(2018).</li>
<li>Gambin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+reveals+self+assembly+and+nanoscale+segregation+of+two+distinct+cavin+subcomplexes+on+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis reveals self assembly and nanoscale segregation of two distinct cavin subcomplexes on caveolae.</a> Elife. 3, e01434(2013).</li>
<li>Ve, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+TIR-domain-assembly+formation+in+MAL-+and+MyD88-dependent+TLR4+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis of TIR-domain-assembly formation in MAL- and MyD88-dependent TLR4 signaling.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (9), 743-751 (2017).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+organisation+of+in+vitro+reconstituted+HOPS+and+CORVET+multisubunit+membrane+tethering+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Subunit organisation of in vitro reconstituted HOPS and CORVET multisubunit membrane tethering complexes.</a> PLoS One. 8 (12), e81534(2013).</li>
<li>Ruehrer, S., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+Leishmania+tarentolae+cell-free+extracts+for+the+synthesis+of+human+solute+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploiting Leishmania tarentolae cell-free extracts for the synthesis of human solute carriers.</a> Mol Membr Biol. 30 (4), 288-302 (2013).</li>
<li>Varasteh Moradi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Interactions+among+cell-free+expressed+Zika+virus+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping Interactions among cell-free expressed Zika virus proteins.</a> J Proteome Res. 19 (4), 1522-1532 (2020).</li>
<li>Gagoski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+pipeline+for+discovery+of+thermotolerant+xylanases+and+endo-1%2C4-beta-glucanases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-free pipeline for discovery of thermotolerant xylanases and endo-1,4-beta-glucanases.</a> J Biotechnol. 259, 191-198 (2017).</li>
<li>Ergun Ayva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+performance+parameters+of+artificial+allosteric+protein+switches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring performance parameters of artificial allosteric protein switches.</a> J Mol Biol. 434 (17), 167678(2022).</li>
<li>Lau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+biosensor+for+real-time+interaction+dynamics+of+host+proteins+with+HIV-1+capsid+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Fluorescence biosensor for real-time interaction dynamics of host proteins with HIV-1 capsid tubes.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 11 (38), 34586-34594 (2019).</li>
<li>Ryan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+antiinflammatory+biologics+shaped+by+parasite-host+coevolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Novel antiinflammatory biologics shaped by parasite-host coevolution.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119 (36), e2202795119(2022).</li>
<li>McMahon, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intracellular+cavin+target+proteins+reveals+cavin-PP1alpha+interactions+regulate+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of intracellular cavin target proteins reveals cavin-PP1alpha interactions regulate apoptosis.</a> Nat Commun. 10 (1), 3279(2019).</li>
<li>Sierecki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+approach+to+accelerate+the+study+of+protein-protein+interactions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">A cell-free approach to accelerate the study of protein-protein interactions in vitro.</a> Interface Focus. 3 (5), 20230018(2013).</li>
<li>Johnston, W. A., Moradi, S. V., Alexandrov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaption+of+the+Leishmania+cell-free+expression+system+to+high-throughput+analysis+of+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaption of the Leishmania cell-free expression system to high-throughput analysis of protein interactions.</a> Methods Mol Biol. 2025, 403-421 (2019).</li>
<li>Jung, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+formation+and+interactome+analysis+of+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-free formation and interactome analysis of caveolae.</a> J Cell Biol. 217 (6), 2141-2165 (2018).</li>
<li>Fontaine, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+domain+analysis+of+SOX18+transcription+factor+using+a+single-chain+variable+fragment-based+approach%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Functional domain analysis of SOX18 transcription factor using a single-chain variable fragment-based approach.</a> MAbs. 10 (4), 596-606 (2018).</li>
<li>Overman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+the+transcription+factor+SOX18+delays+breast+cancer+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of the transcription factor SOX18 delays breast cancer in mice.</a> Elife. 6, e21221(2017).</li>
<li>Kubala, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+farnesyltransferase+alpha+subunit+regulates+vacuolar+protein+sorting-associated+protein+4A+%28Vps4A%29--dependent+intracellular+trafficking+through+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Mammalian farnesyltransferase alpha subunit regulates vacuolar protein sorting-associated protein 4A (Vps4A)--dependent intracellular trafficking through recycling endosomes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 468 (4), 580-586 (2015).</li>
<li>Han, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+scaffolds+Arp2%2F3+and+WAVE2+at+the+epithelial+zonula+adherens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cortactin scaffolds Arp2/3 and WAVE2 at the epithelial zonula adherens.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7764-7775 (2014).</li>
<li>Das Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+IIa+histone+deacetylases+drive+toll-like+receptor-inducible+glycolysis+and+macrophage+inflammatory+responses+via+pyruvate+kinase+M2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Class IIa histone deacetylases drive toll-like receptor-inducible glycolysis and macrophage inflammatory responses via pyruvate kinase M2.</a> Cell Rep. 30 (8), 2712-2728.e8 (2020).</li>
<li>Leitão, A. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectivity+of+protein+interactions+along+the+aggregation+pathway+of+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Selectivity of protein interactions along the aggregation pathway of α-synuclein.</a> BioRxiv. , (2021).</li>
<li>Gagoski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+benchmarking+of+four+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Performance benchmarking of four cell-free protein expression systems.</a> Biotechnol Bioeng. 113 (2), 292-300 (2016).</li>
<li>Johnston, W. A., Alexandrov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+eukaryotic+cell-free+lysate+from+Leishmania+tarentolae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of eukaryotic cell-free lysate from Leishmania tarentolae.</a> Methods Mol Biol. 1118, 1-15 (2014).</li>
<li>Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+instabilities+explain+batch-to-batch+variability+in+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems.</a> Biotechnol Bioeng. 115 (8), 1904-1914 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>-10 SuperDex 25 Colonnes</td><td>Cytiva</td><td>17085101</td><td>Colonnes de filtration Gel</td></tr><tr><td>Nitrogen Cavitation Perturbateur cellulaire</td><td>Parr Industries</td><td>4635 ou 4639</td><td>Perturbateur cellulaire</td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5533</td><td>Additif de culture</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine 10000U/ml</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140122</td><td>Mélange</td></tr> <tr><td>d’antibiotiquesOptiplate 384</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6007290</td><td>Plaque multipuits pour les expressions 10ul</td></tr><tr><td>Synthèse</td><td></td> <td>IDT d’oligonucléotides</td><td>&nbsp ; Oligo avec séquence CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT</td></tr><tr><td>Créatine Phosphokinase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-15-4</td><td>Enzyme</td></tr><tr><td>Tecan Spark</td><td>Tecan</td><td></td><td>ou similaire Lecteur de plaques multimode</td></tr><tr><td>Chemidoc MP Imager</td><td>Biorad</td><td></td><td>ou similaire Gel SDS-PAGE Imager</td></tr><tr><td>4-12 % Bis-Tris Gels</td><td>Invitrogen</td><td>NW04125</td><td>SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>Biophotomètre</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>ou similaire Cuvette Specrophotomètre</td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>Spectrophotomètre Nanodrop</td></tr><tr><td>Centrifugeuse Avanti JXN-26</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>ou centrifugeuse similaire, avec rotors/tubes de 10K et 50K g</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse 5424R Microcentrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>ou similaire, avec tubes</td></tr> <tr><td>de microcentrifugation de 1,5 mlIncubateur à flacons Inova S44i</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>ou similaire Agitateur d’incubateur à flacons adapté aux flacons de 5L</td></tr><tr><td>Flacons</td><td></td><td></td> de culture en verre de 5L <td>Flacons en verre à chicanes pour la croissance de la culture</td></tr><tr><td>Bactotryptone</td><td>BD</td><td>211705</td><td>Milieu de croissance</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Merck</td><td>VM930053</td><td>Milieu de croissance</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td></td><td></td><td>N’importe quelle qualité analytique</td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td></td><td>N’importe quelle qualité analytique</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td>Toute qualité analytique</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td></td><td></td><td>Toute qualité analytique</td></tr><tr><td>Eau UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>Ou sortie de n’importe quel distributeur d’eau de type MilliQ</td></tr></tbody></table>

production et optimisation de lte, un système d’expression de protéines acellulaires dérivé de leishmania tarentolae pour la production de protéines recombinantes

Production and Optimization of LTE, a Leishmania tarentolae Derived Cell-Free Protein Expression System for Recombinant Protein Production

Le but de l’expression des protéines acellulaires est de produire des protéines de pleine longueur sous une forme active repliée adaptée à un large éventail d’applications. L’extrait de LTE (Leishmania tarentolae ) a déjà été comparé à d’autres systèmes d’expression acellulaire procaryotes et eucaryotes, démontrant une grande capacité à éviter la troncature et l’agrégation lorsqu’il fonctionne de manière optimale, en particulier par rapport à l’expression acellulaire basée sur E. coli 33. Cependant, cela s’accompagnait auparavant d’une variation significative de la qualité de sortie d’un lot à l’autre. La méthode actuelle intègre d’autres améliorations pour garantir une qualité de sortie constante, principalement par une supplémentation partielle de la solution d’alimentation nécessaire avant la congélation initiale du LTE dans les aliquotes. S’ensuit l’optimisation de la rNTP.Mg d’entrée transcriptionnelle dans une solution d’appoint qui peut être ajoutée à chaque réaction ultérieure ou utilisée pour compléter directement les aliquotes congelées. Il convient de noter que les réactions d’optimisation représentent également une utilisation typique de la LTE pour exprimer concrètement les protéines, avec des réactions effectuées à 25 °C pendant 2 h.
Les données issues de l’optimisation de la concentration de rNTP.Mg dans les réactions acellulaires fournissent un ensemble de données représentatif. Les niveaux d’expression augmentent généralement à mesure que l’entrée transcriptionnelle (rNTP.Mg) augmente, ce qui indique une expression réussie. Cependant, un seuil est atteint où le système tend vers l’expression non productive de produits tronqués, en particulier dans le cas de protéines plus grandes (&gt;50 kDa). Cette expression sous-optimale entraîne une perte du signal de fluorescence avec l’augmentation de la rNTP.Mg, particulièrement évidente avec les fusions de fluorophores C-terminaux, où la traduction du polypeptide n’atteint pas le fluorophore lui-même. Pour les fusions N-terminales, bien qu’une réduction des RFU (unités de fluorescence relatives) globales ne se produise pas nécessairement avec un excès de rNTP.Mg, l’échec de l’expression est visiblement apparent sur les gels SDS-PAGE sous la forme de plusieurs produits fluorescents de tailles décroissantes. Cette approche tire parti de la capacité de la GFP (Green Fluorescent Protein) à maintenir la fluorescence même lorsqu’elle est visualisée sur un gel SDS-PAGE conventionnel, à condition que les échantillons ne soient pas chauffés après le mélange. Au lieu de cela, ils sont mélangés avec un tampon de chargement de gel et chargés directement sur le gel. Bien que les matériaux et les équipements en gel SDS-PAGE soient généralement interchangeables, l’imageur sur gel doit être capable de visualiser la fluorescence GFP. Une configuration typique pour la visualisation GFP est fournie avec une excitation à 485 nm (bande passante 5 nm), une émission à 516 nm (bande passante 5 nm) et un intervalle de lecture de 1 min sur 2 h.
Il est possible d’optimiser le système en utilisant uniquement l’expression d’eGFP. Les figures 2A, B (encadré) représentent les sorties d’expression typiques des réactions d’optimisation pour deux lots LTE, avec une RFU eGFP augmentant avec l’augmentation des concentrations de rNTP.Mg, atteignant un niveau optimal de +0,6x rNTP.Mg (Figure 2A) et +0,3x rNTP.Mg (Figure 2B) pour une RFU maximale. La solution d’alimentation rNTP réduite comprend 0,6 fois rNTP.Mg, ce qui permet d’obtenir des niveaux de rNTP.Mg totaux de 1,2 fois et 0,9 fois la quantité par défaut pour ces lots LTE. La figure 2C illustre la cinétique de l’augmentation de la RFU pendant la réaction pour le lot LTE de la figure 2B, démontrant une réaction biphasique avec deux phases discrètes sur la durée de la réaction.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65592/65592fig02.jpg"> Figure 2 : Optimisation de l’ajout de rNTP.Mg complément dans LTE avec rNTP réduit 5x FS. (A) Niveaux d’expression de l’eGFP après 140 min d’expression à partir d’un plasmide témoin à différents niveaux de complément rNTP.Mg dans la réaction d’expression acellulaire (n = 3, moyenne ± SD tracée). (B) Optimisation d’un autre lot de production LTE, montrant une expression réduite au-delà d’un certain seuil rNTP.Mg. (C) Cinétique d’accumulation de l’eGFP dans les mêmes réactions que (B), avec augmentation de rNTP.Mg l’appoint. Ces données représentent également la cinétique typique de l’accumulation de protéines dans l’expression de lots LTE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65592/65592fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Cependant, il convient de noter que l’eGFP, étant une petite protéine (27 kDa) facile à replier, est susceptible d’être exprimée, repliée et mûrie quel que soit le système d’expression acellulaire utilisé. La défaillance du système est plus probable lors de l’expression de protéines d’intérêt plus grandes, les produits tronqués devenant plus apparents à des tailles de protéines d’entrée supérieures à 70 kDa33. Par conséquent, l’optimisation du système avec la ou les protéines destinées à une utilisation réelle est supérieure, avec l’eGFP toujours présente pour la quantification mais sous la forme d’une fusion N-terminale avec la protéine d’intérêt.
La figure 3 représente une optimisation typique du niveau d’appoint rNTP.Mg lors de l’utilisation d’un modèle protéique plus grand enclin à livrer des produits tronqués (eGFP-Sox18). En utilisant un format SDS-PAGE de gel semi-natif (c’est-à-dire sans chauffer les échantillons), il est possible de visualiser l’échec progressif de l’expression. L’ajout optimal de rNTP.Mg à +0,1x (combiné à la rNTP.Mg 0,6x dans la solution d’alimentation partielle, totalisant 0,7x) réduit clairement la fraction de la bande protéique pleine longueur dans le cadre des produits d’expression fluorescente totale, ce qui signifie une défaillance du système avec un excès de rNTP.Mg addition.
Comme mentionné dans le protocole, il est possible de sauter l’étape d’optimisation rNTP.Mg et d’ajouter directement la quantité totale de rNTP.Mg dans la solution d’alimentation « par défaut » lors de la supplémentation immédiatement après la filtration sur gel à l’étape 6.2. Ce faisant, le protocole revient essentiellement aux méthodes publiées d’origine pour créer LTE34. Cependant, les auteurs estiment que l’adaptation du système pour des performances optimales, comme le démontre la figure 3 (voie D à voie E), l’emporte sur la complexité supplémentaire du protocole et augmente la valeur de LTE en tant qu’outil d’expression protéique.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65592/65592fig03.jpg"> Figure 3 : Effet de l’augmentation de l’augmentation de la supplémentation en rNTP.Mg sur l’expression d’eGFP-Sox18 dans le LTE partiellement supplémenté. Gel semi-natif SDS-PAGE illustrant l’impact de l’augmentation de la recharge rNTP.Mg sur l’expression d’eGFP-Sox18. Couloir A : +0,1x (rNTP.Mg) recharge, couloir B : +0,2x (rNTP.Mg), couloir C : +0,3x (rNTP.Mg), couloir D : +0,4x (rNTP.Mg). La fusion N-terminale eGFP est visualisée par balayage de fluorescence du gel. La bande principale de la voie A représente l’eGFP-Sox18 sur toute la longueur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65592/65592fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Composant</td>
			<td rowspan="2">Concentration des stocks</td>
			<td>Solution d’alimentation 5x</td>
			<td>μL de stock/mL 5x Solution d’alimentation</td>
		</tr><tr><td>Par défaut (rNTP réduit)</td>
			<td>Par défaut (rNTP réduit)</td>
		</tr><tr><td>Spermidine</td>
			<td>100 millions d’euros</td>
			<td>1,25 million d’euros</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>La TNT</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>10 millions d’euros</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>Créatine phosphate</td>
			<td>1000 mM</td>
			<td>200 millions d’euros</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td>HEPES-KOH pH7.6</td>
			<td>2500 millions de mètres cubes</td>
			<td>100 millions d’euros</td>
			<td>40</td>
		</tr><tr><td>PEG3000</td>
			<td>0,5 v/v</td>
			<td>0,05 V/V</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td>
			<td>120 fois</td>
			<td>5 fois</td>
			<td>43</td>
		</tr><tr><td>Acides aminés</td>
			<td>3,6 mM (ch)</td>
			<td>0,68 mM (ch)</td>
			<td>190</td>
		</tr><tr><td>ATP</td>
			<td>100 millions d’euros</td>
			<td>8,5 (5,1) millions d’euros</td>
			<td>85 (51)</td>
		</tr><tr><td>GTP</td>
			<td>100 millions d’euros</td>
			<td>3,2 (1,9) millions d’euros</td>
			<td>32 (19)</td>
		</tr><tr><td>UTP</td>
			<td>100 millions d’euros</td>
			<td>2,5 (1,5) millions d’euros</td>
			<td>25 (15)</td>
		</tr><tr><td>CTP</td>
			<td>100 millions d’euros</td>
			<td>2,5 (1,5) millions d’euros</td>
			<td>25 (15)</td>
		</tr><tr><td>Mg(OAc)2</td>
			<td>1 Mois</td>
			<td>16,7 (10) millions d’euros</td>
			<td>16,7 (10)</td>
		</tr><tr><td>Oligo leader anti-épissure</td>
			<td>1 million d’euros</td>
			<td>0,05 million d’euros</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>ARN polymérase T7</td>
			<td>5 mg/mL</td>
			<td>0,5 mg/mL</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>Créatine phosphokinase</td>
			<td>5 unités/μL</td>
			<td>0,2 unités/μL</td>
			<td>42</td>
		</tr><tr><td>Eau ultra-pure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>19 (93)</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Composition de la solution d’alimentation 5x (5x FS) pour LTE. 1 mL de 5x FS est nécessaire pour chaque 2,5 mL de lysat non supplémenté après filtration sur gel. L’ajout de la fonction FS 5x par défaut crée un LTE prêt à l’expression pour une utilisation dans les réactions d’expression à un rapport de 7 μL/10 μL. La recette à rNTP.Mg réduite (quantités en italique) est recommandée pour l’optimisation de l’expression LTE et contient 0,6 fois les niveaux par défaut de rNTP et de magnésium. Ceux-ci peuvent être ajustés à des niveaux variables (0,6 à 1,1 fois) dans l’expérience d’optimisation ultérieure à l’aide des ajouts décrits dans le tableau 2.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Recharge rNTP</td>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>GTP (100 mM)</td>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>MgOAc (1 M)</td>
			<td rowspan="2">Eau ultra-pure</td>
		</tr><tr><td>(1 μL/10 μL rxn)</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
		</tr><tr><td>+0x</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td>+0,1x</td>
			<td>3.4</td>
			<td>1.3</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.7</td>
			<td>193</td>
		</tr><tr><td>+0,2x</td>
			<td>6.8</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>1.3</td>
			<td>185</td>
		</tr><tr><td>+0,3x</td>
			<td>10.2</td>
			<td>3.8</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>178</td>
		</tr><tr><td>+0,4x</td>
			<td>13.6</td>
			<td>5.1</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>2.7</td>
			<td>171</td>
		</tr><tr><td>+0,5x</td>
			<td>17</td>
			<td>6.4</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>3.3</td>
			<td>163</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Composition des (rNTP.Mg) solutions de recharge pour l’optimisation LTE. Ces solutions sont utilisées pour optimiser la LTE en ajoutant 1 μL de solution d’appoint par 10 μL de réaction d’expression protéique. Une fois qu’un niveau d’appoint est déterminé dans l’expérience d’optimisation, il peut être ajouté de manière cohérente à toutes les réactions d’expression protéique ultérieures en utilisant les mêmes aliquotes de lot LTE. Alternativement, il peut être ajouté directement aux aliquotes elles-mêmes à raison de 1 μL d’addition par 7 μL (sans décongélation). Après décongélation et mélange, ces lysats sont utilisés à 8 μL LTE par 10 μL d’expression protéique, ce qui permet de maintenir le niveau de remplissage rNTP.Mg établi lors de l’optimisation.

Production et optimisation de LTE, un système d’expression de protéines acellulaires dérivé de Leishmania tarentolae pour la production de protéines recombinantes

This protocol outlines the production and optimization of a eukaryotic Cell-Free Protein Expression System (CFPS) derived from the unicellular flagellate ...

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Production et optimisation de LTE, un système d’expression de protéines acellulaires dérivé de Leishmania tarentolae pour la production de protéines recombinantes

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