Un protocole simple, rapide et partiellement automatisé pour l’isolement de noyaux uniques à partir de tissus de mammifères congelés pour le séquençage d’un seul noyau
28 juillet 2023
L’étude décrit un protocole simple, rapide et partiellement automatisé pour isoler des noyaux de haute qualité à partir de tissus de mammifères congelés pour le séquençage de l’ARN de noyaux uniques en aval.
Cette recherche vise à soutenir les études de découverte de médicaments utilisant le séquençage de l’ARN à noyau unique pour étudier l’efficacité et l’innocuité de traitements potentiels. C’est pourquoi nous développons des protocoles standardisés d’extraction de noyaux pour des échantillons de tissus frais congelés provenant de divers organes. Notre objectif était d’automatiser et de standardiser l’extraction des noyaux afin d’obtenir des résultats cohérents et fiables en réduisant la variabilité non biologique.
L’avantage est l’automatisation partielle grâce à l’utilisation d’un dissociateur robotisé et le flux de travail simple et court qui peut être appliqué sur divers échantillons de tissus de différentes espèces. Le fait d’avoir des protocoles normalisés peut nous aider à répondre aux questions sur la biodistribution des médicaments, ainsi qu’à explorer les mécanismes sous-jacents aux signaux de sécurité que nous pourrions observer. À l’avenir, nous testerons l’applicabilité de notre protocole à d’autres applications en aval, telles que ATAC-seq ou multiomique.
Nous tenterons également d’établir des protocoles pour détecter les transgènes exprimés de manière virale dans des noyaux uniques.
Aperçu
Cette étude présente un protocole standardisé et partiellement automatisé pour l'extraction de noyaux de haute qualité à partir de tissus de mammifères congelés, visant à améliorer l'efficacité et la fiabilité du séquençage de l'ARN au niveau de noyaux uniques en aval. Ce protocole contribue à améliorer les études de découverte de médicaments en réduisant la variabilité non biologique.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Séquençage de l'ARN de noyaux uniques
- Études de découverte de médicaments
- Isolation de noyaux de haute qualité
Contexte
- Développement de protocoles normalisés d'extraction de noyaux
- Portant sur des échantillons de tissus congelés frais provenant de divers organes
- Visant à aborder la biodistribution des médicaments et les signaux de sécurité
Méthodes utilisées
- Extraction partielle des noyaux à l'aide d'un dissocieur robotisé
- Tissus de mammifères provenant de diverses espèces
- Mise en œuvre d'un nettoyage par gradient de saccharose
Résultats principaux
- Noyaux de haute qualité obtenus sans signes de débris ni d'agglutination
- Résultats cohérents entre différents types de tissus
- Faible variabilité technique et proportions cellulaires similaires entre les échantillons
Conclusions
- L'étude parvient à automatiser et à normaliser l'extraction des noyaux.
- Ce protocole peut grandement contribuer à répondre à des questions biologiques dans le domaine de la découverte de médicaments et des évaluations de sécurité.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement normalisé de noyaux uniques à partir de tissus congelés permet un profilage transcriptomique robuste en découverte de médicaments, soutenant à la fois les études d'efficacité et de sécurité. En réduisant la variabilité non biologique grâce à une automatisation partielle, ce protocole améliore la fiabilité prédictive du séquençage de l'ARN nucléique unique en aval. Son adaptabilité à différents types de tissus en fait une capacité réutilisable pour l'élimination des risques mécanistiques et la validation des cibles à l'échelle du portefeuille.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'analyse du mécanisme d'action des médicaments et de l'expression génique spécifique aux tissus dans des échantillons difficiles à dissocier ou des échantillons d'archives.
- Réduit la variabilité technique, soutenant ainsi la validation fonctionnelle des cibles et la réduction des risques mécanistiques.
- Facilite la génération de données reproductibles pour le triage hypothético-dépendant des portefeuilles.
Développement de criblages et de tests
- Prépare des suspensions de noyaux de haute qualité, adaptées aux protocoles standardisés de séquençage de l'ARN au niveau du noyau unique.
- Permet la reproductibilité des tests et la cohérence des résultats quantitatifs sur divers types de tissus et espèces.
- Permet un traitement d'échantillons évolutif et partiellement automatisé pour une évaluation fiable de composés.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur l'analyse tissulaire pertinente pour la découverte translationnelle de biomarqueurs, lorsqu'on utilise des échantillons congelés ou archivés.
- Assure une continuité du stade précoce de découverte jusqu'à la validation préclinique, en permettant des études multi-tissus et multi-espèces.
- Constitue une base pour les futures applications de multiomique et de séquençage ATAC, comme indiqué dans la perspective du protocole.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole s'intègre à l'interface entre la phase de découverte précoce et la recherche préclinique, permettant une analyse transcriptomique de haute fidélité à partir de tissus congelés pour l'identification de composés candidats et des études mécanistiques.
- Biologie de la découverte : Permet le criblage d'hypothèses et l'élucidation de voies biologiques en rendant possible la transcriptomique de noyaux uniques à partir de tissus variés.
- Criblage : Fournit des préparations reproductibles et quantitatives de noyaux destinées à des tests de séquençage en aval.
- Analyse : Produit des résultats standardisés tels que les comptages géniques, les comptages d'UMI et la teneur en mitochondries, permettant la comparaison entre échantillons.
- Recherche translationnelle : Facilite l'analyse de la biodistribution des médicaments et des signaux de sécurité dans des tissus pertinents pour la maladie.
- Utilisation en entreprise : Propose un protocole largement adaptable à différents types de tissus et espèces, soutenant des études à l'échelle d'un portefeuille.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les études transcriptomiques.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et une automatisation partielle des protocoles d'isolement de noyaux.
- Valeur stratégique : Permet une meilleure prise de décision quant au passage en phase suivante (go/no-go) et une utilisation plus efficace du capital en réduisant la variabilité technique.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation et une avancée ajustées au risque des candidats médicaments sur la base de données moléculaires solides.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des tissus, l'isolement des noyaux et les protocoles de séquençage en aval.
- Suppose l'accès à un dissocieur robotisé, à un compteur cellulaire fluorescent automatisé et à une infrastructure standard en biologie moléculaire.
- Exige une standardisation entre équipes afin d'assurer la reproductibilité entre les études et les sites.
- Adaptable à divers tissus de mammifères avec une optimisation minimale, comme démontré chez plusieurs espèces.
- Les limites potentielles incluent la nécessité d'ajuster le protocole pour des tissus non standard ou pour de futures applications multiomiques.
