Mesure de la fonction mitochondriale des lymphocytes T CD8 naïfs et effecteurs

Notre laboratoire étudie la tolérance immunitaire, la surveillance immunitaire et la signalisation des récepteurs antigéniques par les lymphocytes. Nous avons constaté que l’acide lysophosphatidique perturbe la cytotoxicité des lymphocytes T CD8, favorisant la tolérance périphérique en réduisant la flexibilité métabolique dans les cellules effectrices. Nous utilisons des technologies pour mesurer le métabolisme mitochondrial et les capacités énergétiques des lymphocytes T CD8.

Notre laboratoire a montré que l’acide lysophosphatidique module la valeur métabolique des lymphocytes T CD8 et peut être un déterminant important des phénotypes des lymphocytes T. Notre protocole décrit ici évalue le métabolisme fonctionnel et la bioénergétique de la signalisation des récepteurs des lymphocytes T en temps réel. Pour commencer, ajoutez 200 microlitres d’eau distillée dans chaque puits d’une plaque utilitaire.

Placez une cartouche de capteur sur la plaque utilitaire, en vous assurant que les extrémités de la cartouche de capteur sont immergées pour permettre une bonne hydratation. Incuber la plaque utilitaire avec la cartouche du capteur à 37 degrés Celsius pendant au moins 10 heures dans un incubateur sans dioxyde de carbone. Ensuite, remplissez un tube conique de 50 millilitres avec 50 millilitres de solution de calibrant et incubez.

Le lendemain, retournez l’assiette pour retirer l’eau distillée. Réhydratez la plaque avec 200 microlitres de calibrant. Replacez la cartouche du capteur sur le dessus de la plaque utilitaire et replacez la plaque utilitaire dans l’incubateur sans dioxyde de carbone.

Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, vous pouvez remettre en suspension 10 millions de lymphocytes T CD8 dans 4,5 millilitres de milieu complet. Pipeter 90 microlitres de suspension dans chaque puits, puis 90 microlitres du milieu désigné par puits pendant le prétraitement. Pipette 180 microlitres de milieu complet dans les puits d’angle pour éviter l’évaporation.

Placez ensuite la microplaque avec les cellules T CD8 dans un incubateur sans dioxyde de carbone. Placez les adaptateurs de plaque en toute sécurité sur la cartouche du capteur. Après l’incubation, utilisez des adaptateurs de plaque pour pipeter l’oligomycine, le FCCP, la roténone et l’antimycine A dans les ports respectifs.

Placez la microplaque dans l’incubateur sans dioxyde de carbone une heure avant de commencer le test. Ouvrez le logiciel et étalonnez l’analyseur d’instruments 30 minutes avant de charger la microplaque. Étiquetez les puits et examinez le schéma d’injection dans le système logiciel.

Chargez ensuite la cartouche du capteur dans l’instrument pendant l’étalonnage. Exécutez le test via le logiciel. Pour les injections supplémentaires, modifiez les schémas d’injection à l’aide de la chambre supplémentaire pour l’injection.

Chargez l’anti-CD3 et l’anti-CD28 dans le port A de la cartouche du capteur. Chargez l’oligomycine dans l’orifice B, le FCCP dans l’orifice C, et la roténone et l’antimycine A dans l’orifice D.Pour une stimulation individuelle anti-CD3 et anti-CD28, pipetez 20 microlitres d’anti-CD3 biotinylé à 10 microgrammes par millilitre dans les puits désignés de la cartouche du capteur. Pipeter 20 microlitres d’anti-CD28 et de streptavidine dans les puits désignés.

Pour la stimulation anti-CD3 ou CD28, combinez et pipetez 20 microlitres d’anti-CD3, d’anti-CD28 et de streptavidine biotinylés dans les puits désignés. Préparez les puits de contrôle en injectant du milieu. Pour une stimulation combinée anti-CD3 et CD-28, utilisez un rapport bille à une cellule et pipetez cinq microlitres de billes magnétiques CD-28 anti-CD3 dans les puits désignés contenant 200 000 cellules par puits.

Préparez les puits de contrôle avec des fluides uniquement pour l’injection. Ajustez les poisons dans chaque orifice pour atteindre les concentrations finales après l’injection. Assurez-vous que le schéma d’injection reflète les points temporels mis à jour avant de charger la microplaque dans l’instrument.

Programmez le logiciel pour exécuter le test de stimulation TCR aiguë pendant un total de 140 minutes. Modifier le schéma pour inclure 10 mesures de points temporels avant l’injection d’oligomycine. La stimulation TCR aiguë à l’aide d’anti-CD3 et/ou d’anti-CD28 biotinylés avec de la streptavidine et une stimulation par billes magnétiques anti-CD3 et/ou CD-28 a entraîné une augmentation du taux de consommation d’oxygène et du taux d’acidification extracellulaire par rapport aux témoins en milieu seul.

La stimulation par billes magnétiques anti-CD3 et CD-28 a montré des réponses métaboliques comparables aux injections d’anti-CD3 et de CD-28 biotinylés, avec des augmentations similaires du taux de consommation d’oxygène et du taux d’acidification extracellulaire.