Name: PCR bloquante de type sauvage combinée au séquençage de Sanger pour la détection de mutations somatiques à basse fréquence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Découvrez une méthode de PCR bloquante combinée au séquençage de Sanger pour détecter les mutations somatiques à basse fréquence dans les tissus cancéreux. Cette technique offre une sensibilité élevée et un coût réduit pour la recherche en oncologie.

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<meta charset="utf8"></head><body>Optimisation de la détection des mutations à basse fréquence avec la PCR bloquante de type sauvage

<ol><li>Penn Medicine. Testing for measurable/minimal residual disease (MRD). , Oncolink Team. 
 <a target="_blank" href="https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd">https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd</a> (2019).</li>
<li>Xie, Y., Elaine, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+I+diagnose+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">How I diagnose angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Am J Clin Pathol. 156, 1-14 (2021).</li>
<li>Mariko, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Cancer Treat Res. 176, 99-126 (2019).</li>
<li>Daniel, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute+lukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute lukemia.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li>
<li>Rita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5th+edition+of+the+World+Health+Organization+Classification+of+Haematolymphoid+Tumours+%3A+Lymphoid+Neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The 5th edition of the World Health Organization Classification of Haematolymphoid Tumours : Lymphoid Neoplasms.</a> Leukemia. 36 (7), 1720-1748 (2022).</li>
<li>Hae, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recurrent+inactivating+mutation+in+RHOA+GTPase+in+angioimmunoblastic+T+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A recurrent inactivating mutation in RHOA GTPase in angioimmunoblastic T cell lymphoma.</a> Nat Genet. 46 (4), 371-375 (2014).</li>
<li>Lee, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RHOA+G17V+mutation+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%3AA+potential+biomarker+for+cytological+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">RHOA G17V mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma:A potential biomarker for cytological assessment.</a> Exp Mol Pathol. 110, 104294(2019).</li>
<li>Mamiko, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+RHOA+mutation+in+angioimmunoblastic+T+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Somatic RHOA mutation in angioimmunoblastic T cell lymphoma.</a> Nat Genet. 46 (2), 171-175 (2014).</li>
<li>Palomero, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+epigenetic+regulators%2C+RHOA+and+FYN+kinase+in+peripheral+T+cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in epigenetic regulators, RHOA and FYN kinase in peripheral T cell lymphomas.</a> Nat Genet. 46 (2), 166-170 (2014).</li>
<li>Fujisawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+RHOA-VAV1+signaling+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Activation of RHOA-VAV1 signaling in angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Leukemia. 32 (3), 694-702 (2018).</li>
<li>Voena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RHO+family+GTPases+in+the+biology+of+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">RHO family GTPases in the biology of lymphoma.</a> Cells. 8 (7), 646(2019).</li>
<li>Shendure, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+an+40%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing an 40: past, present and future.</a> Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).</li>
<li>Athanasios, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Sanger+sequencing%2C+pyrosequencing%2C+and+melting+curve+analysis+for+the+detection+of+KRAS+mutations%3A+diagnostic+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications.</a> J Mol Diagn. 12 (4), 425-432 (2010).</li>
<li>Wu, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+enrichment+of+rare+DNA+variants+via+sequence-selective+and+temperature-robust+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Multiplexed enrichment of rare DNA variants via sequence-selective and temperature-robust amplification.</a> Nat Biomed Eng. 1, 714-723 (2017).</li>
<li>John, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thermodynamics+of+DNA+structural+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">The thermodynamics of DNA structural motifs.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 415-440 (2004).</li>
<li>Coren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+methods+for+the+enrichment+of+minority+alleles+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations.</a> Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).</li>
<li>Eliza, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+in+B-cell+lymphoma%3A+technical+advances%2C+clinical+applications%2C+and+perspectives+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA in B-cell lymphoma: technical advances, clinical applications, and perspectives for translational research.</a> Leukemia. 36 (9), 2151-2164 (2022).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot-spot-specific+probe+%28HSSP%29+for+rapid+and+accurate+detection+of+KRAS+mutations+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Hot-spot-specific probe (HSSP) for rapid and accurate detection of KRAS mutations in colorectal cancer.</a> Biosensors. 12 (8), 597(2022).</li>
<li>Matsubara, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+the+G17V+RHOA+mutation+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma+and+related+lymphomas+using+quantitative+allele-specific+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of the G17V RHOA mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma and related lymphomas using quantitative allele-specific PCR.</a> PLoS One. 9 (10), e109714(2014).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).</li>
<li>Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%223730%2F3730xl+DNA+Analyzer%22">3730/3730xl DNA Analyzer</a>. , (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Extracteur automatique</td><td>d’ADN 9001301</td><td>Qiagen</td><td></td></tr> DNA <tr><td>Détecteur d’acide nucléique</td><td>Q32854</td><td>Thermo fisher</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’amplification PCR</td><td>P4600</td><td>merck</td><td></td></tr><tr><td></td><td>C1000 Touch</td><td>Biorad</td><td></td></tr><tr><td>protéinase K solution</td><td>D3001-2-A</td><td>zymo research</td><td></td></tr><tr><td>protéinase K tampon de stockage</td><td>D3001-2-C</td><td>zymo research</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’enzymes d’amplification de séquençage</td><td>P7670-FIN</td><td>Qiagen</td><td></td></tr></tbody></table>

pcr bloquante de type sauvage combinée au séquençage de sanger pour la détection de mutations somatiques à basse fréquence

Wild-type Blocking PCR Combined with Sanger Sequencing for Detection of Low-frequency Somatic Mutation

Comparez la séquence de l’échantillon de test avec la séquence de référence pour obtenir le statut de mutation de l’échantillon de test. La technologie WBT-PCR basée sur BDA peut détecter la mutation connue RHOA G17V et d’autres mutations à basse fréquence dans l’intervalle d’amplification des amorces en amont et en aval. Voir la figure 1. Deux gènes supplémentaires, à savoir IDH2 et JAK1, ont également été analysés à l’aide de cette méthode, respectivement la figure 2 et la figure 3. Les résultats montrent que cette méthode est assez sensible à la détection des mutations à basse fréquence.
<img alt="chromatogramme de séquençage de l’ADN ; PCR traditionnelle vs WBT-PCR montrant une comparaison de la détection des mutations RHOA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Résultat du séquençage pour RHOA. De haut en bas, la figure montre la mutation de base du site RHOA G17 amplifiée par WBT-PCR et les résultats de séquençage après amplification PCR traditionnelle correspondant à RHOA G17 de type sauvage. L’image du milieu montre les résultats de séquençage de la mutation c.50G&gt;T après amplification avec des amorces WBT-PCR lorsque la sensibilité de détection est de 0,5%. L’image du bas montre les résultats de séquençage de la mutation c.49-50delinsTT après amplification avec des amorces WBT-PCR lorsque la sensibilité de détection est de 0,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Comparaison entre chromatogramme WBT-PCR et PCR traditionnelle, détection de mutation c.515G&gt;A, gène IDH2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : Résultat du séquençage pour IDH2. De haut en bas, la figure ci-dessus montre la mutation de base du site IDH2 R172 amplifiée par WBT-PCR et les résultats de séquençage après amplification PCR traditionnelle correspondant à IDH2 R172 de type sauvage. L’image du haut montre les résultats de séquençage de la mutation c.515G&gt;A après amplification avec des amorces WBT-PCR lorsque la sensibilité de détection est de 0,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig02largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Comparaison du séquençage de l’ADN, WBT-PCR vs PCR traditionnelle pour le tableau d’analyse des mutations JAK1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 : Résultat du séquençage de JAK1. De haut en bas, la figure ci-dessus montre la mutation de base du site JAK1 S703 amplifiée par WBT-PCR et les résultats de séquençage après amplification PCR traditionnelle correspondant à JAK1 S703 de type sauvage. L’image du haut montre les résultats de séquençage de la mutation c.2108G&gt;T après amplification avec des amorces WBT-PCR lorsque la sensibilité de détection est de 0,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Amorce</td>
			<td colspan="2">Séquence d’amorçage</td>
		</tr><tr><td>RHOA-VF</td>
			<td colspan="2">ATAACCTTTTGGTGCCAGGT</td>
		</tr><tr><td>RHOA-VR</td>
			<td colspan="2">GCTGAAGACTATGAGCAAGCA</td>
		</tr><tr><td>RHOA-WTB</td>
			<td colspan="2">AGCAAGCATGTCTTTCCACAGGCAAAA</td>
		</tr><tr><td>Apprêt de séquençage</td>
			<td colspan="2">ATAACCTTTTGGTGCCAGGT</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : La liste finale des amorces de RHOA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Apprêt IDH2 R172</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Amorce</td>
			<td>Séquence d’amorçage</td>
		</tr><tr><td>IDH2-VF</td>
			<td>CTGGTTGAAAGATGGCGGCT</td>
		</tr><tr><td>IDH2-VR</td>
			<td>TACCTGGTCGCCATGGGC</td>
		</tr><tr><td>IDH2-WTB</td>
			<td>GCCATGGGCGTGCCTGCCAAAAT</td>
		</tr><tr><td>Apprêt de séquençage</td>
			<td>CTGGTTGAAAGATGGCGGCT</td>
		</tr><tr><td>Amorce du gène JAK1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Amorce</td>
			<td>Séquence d’amorçage</td>
		</tr><tr><td>JAK1-VF</td>
			<td>ACTCTGAGGCCGAGTAGT</td>
		</tr><tr><td>JAK1-VR</td>
			<td>CCATTATGGACATCAGGACATTC</td>
		</tr><tr><td>JAK1-WTB</td>
			<td>GGACATTCTCACCAAGTAGCTCAGAAAA</td>
		</tr><tr><td>Apprêt de séquençage</td>
			<td>ACTCTGAGGCCGAGTAGT</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Liste finale des amorces conçues pour IDH2 et JAK1.

PCR bloquante de type sauvage combinée au séquençage de Sanger pour la détection de mutations somatiques à basse fréquence

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting ...

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Détection de rares variantes génomiques à partir de séquençage regroupés à l&#39;aide SPLINTER

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PCR bloquante de type sauvage pour détecter les mutations somatiques à basse fréquence

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