Détection du virus SARS-CoV-2 par amplification isotherme médiée par boucle de transcription inverse
8 septembre 2023
Nous fournissons ici un protocole complet pour normaliser et mettre en œuvre la méthode de détection du virus SARS-CoV-2 dans des échantillons humains par amplification isotherme médiée par boucle de transcription inverse (RT-LAMP). Cette méthode, réalisée en 60 min, pourrait être adaptée à n’importe quel laboratoire ou point de service à faible coût et à l’aide d’équipements peu coûteux.
Notre recherche vise à normaliser le LAMP en tant que test de prédiagnostic, adapté aux environnements de soins primaires ou de terrain dépourvus d’infrastructures de laboratoire avancées. Nous cherchons à promouvoir l’utilisation de tampons et de colorants alternatifs productibles localement, réduisant ainsi la dépendance aux kits commerciaux importés. À l’heure actuelle, CRISPR-Cas est un système efficace utilisé dans le développement de méthodes de diagnostic rapides, spécifiques et sensibles pour les agents pathogènes.
Aujourd’hui, ce système dispose d’une large gamme de suppléments pour détecter les cibles d’ARN ou d’ADN dans différents échantillons d’intérêt. Les défis expérimentaux actuels consistent à empêcher l’amplification non cible résultant d’une contamination par des amplicons et des cellules primaires, en particulier avec des amorces longues sujettes à la formation de dimères. De plus, nous visons à déterminer les conditions de réaction optimales pour obtenir un changement de couleur visuellement distinctif dans le colorant.
Une fois normalisée et entièrement validée, cette méthode peut être facilement mise en œuvre et s’adapter à n’importe quel laboratoire ou point de service en 60 minutes, à faible coût et à l’aide d’un équipement peu coûteux, pour détecter presque tous les agents pathogènes. Ainsi, il peut potentiellement être utilisé dans les centres de soins primaires pour effectuer une surveillance épidémiologique en temps opportun. Notre groupe multidisciplinaire se concentre sur la découverte de molécules à partir de plantes indigènes de Colombie, en essayant d’identifier le potentiel d’inhibition de la réplication de virus tels que la dengue, le Zika ou le SRAS-COVID-2.
De plus, nous menons des études pour développer des méthodes de diagnostic moléculaire de ces virus.
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Aperçu
Cette étude présente un protocole standardisé pour la détection du virus SARS-CoV-2 par amplification isotermique en boucle par transcription inverse (RT-LAMP). Il est conçu pour les environnements à ressources limitées, permettant une détection rapide en moins de 60 minutes à l’aide d’un équipement peu coûteux.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Diagnostic des infections virales
- Mise en œuvre de méthodes LAMP
- Solutions de santé à faible coût
Contexte
- Importance de la détection rapide du SARS-CoV-2
- Besoin d'outils diagnostiques rentables
- Difficultés rencontrées avec les méthodes diagnostiques moléculaires actuelles
Méthodes utilisées
- Amplification isotherme médiée par transcription inverse (RT-LAMP)
- Utilisation de tampons et de colorants locaux
- Détection colorimétrique à l'aide de bleu d'hydroxynaphtol
Résultats principaux
- Développement d'une méthode diagnostique rapide, spécifique et sensible
- Conditions de réaction optimisées conduisant à des changements de couleur observables
- Validation de l'adaptation de la méthode à une utilisation en soins primaires
Conclusions
- Le protocole permet une détection efficace et peu coûteuse des agents pathogènes
- Il présente un potentiel élevé pour une application généralisée dans la surveillance épidémiologique
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Des diagnostics moléculaires rapides et peu coûteux, tels que la RT-LAMP, sont essentiels pour la détection précoce et la maîtrise des menaces virales émergentes, tant dans des contextes centralisés que décentralisés. Ce protocole permet une détection évolutible et utilisable sur le terrain du SARS-CoV-2 et d'autres agents pathogènes, contribuant ainsi à l'atténuation des risques à l'échelle du portefeuille et à une surveillance épidémiologique rapide. Sa souplesse d'adaptation et ses exigences minimales en matière d'infrastructure en font un atout stratégique pour les programmes de R&D en biopharmacie et les dispositifs de réponse en santé publique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une interrogation rapide de la présence virale dans des échantillons biologiques pour la validation de cibles.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en confirmant la spécificité de l'amplification des acides nucléiques.
- Permet la validation fonctionnelle de combinaisons d'amorces et de colorants pour le développement diagnostique.
Tests et développement de dosages
- Offre un protocole standardisé et reproductible pour les tests de détection des acides nucléiques.
- Fournit des résultats quantitatifs et qualitatifs par des lectures colorimétriques et électrophorétiques.
- Permet un déploiement d'essais évolutif dans des contextes à ressources limitées ou à haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les stratégies translationnelles de biomarqueurs pour la surveillance des maladies infectieuses.
- Assure la continuité entre la découverte et la validation préclinique des réactifs diagnostiques.
- Réduit le risque d'échec de test en phase avancée grâce à une standardisation et une validation précoces.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole RT-LAMP s'intègre dans la continuité de la découverte diagnostique, depuis le développement précoce du test jusqu'à son déploiement translationnel sur le terrain et dans les contextes cliniques.
- Biologie de la découverte : Confirme la présence de l'acide nucléique cible et la spécificité des amorces pour le test d'hypothèses.
- Dépistage : Standardise les résultats colorimétriques et électrophorétiques pour une comparaison fiable des tests.
- Analytique : Fournit des données quantifiables de changement de couleur et d'électrophorèse sur gel pour l'évaluation des conditions.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre le développement de tests en laboratoire et la mise en œuvre de diagnostics utilisables sur le terrain.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme modulaire et adaptable pour la détection de divers pathogènes autres que le SARS-CoV-2.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté dans les protocoles de détection virale.
- Valeur opérationnelle : Permet des diagnostics rapides, peu coûteux et reproductibles avec une infrastructure minimale.
- Valeur stratégique : Accélère les décisions d'aller/arrêt pour les candidats diagnostics et soutient une surveillance évolutive.
- Impact sur le portefeuille : Améliore la priorisation ajustée au risque des actifs de diagnostic et de surveillance.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en conception d'amorces, manipulation des acides nucléiques et interprétation des tests colorimétriques.
- Requiert un équipement de biologie moléculaire de base tel que des thermocycleurs ou des bains d'eau, ainsi que des dispositifs d'imagerie.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de préparation des réactifs et de contrôle des contaminations.
- Peut être adapté à divers types d'échantillons et de pathogènes moyennant une reconception appropriée des amorces.
- Les limites potentielles incluent le risque d'amplification hors cible et la nécessité d'optimiser les colorants, comme le confirment les données sources.
