Name: Analyse de la fonction mitochondriale chez un mutantB9-Null de Drosophila melanogaster PINK1 à l’aide de la respirométrie à haute résolution (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T12:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Découvrez la respirométrie à haute résolution pour analyser la bioénergétique mitochondriale chez Drosophila melanogaster mutants PINK1 B9-null. Cette méthode permet d'étudier la fonction mitochondriale liée à la maladie de Parkinson.

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Les auteurs remercient l’agence brésilienne Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) et T.D. (#88887.512883/2020-00) sont récipiendaires d’une bourse de recherche.

Nous avons utilisé les souches w1118 (blanches) et w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (appelées Pink1B9) (FlyBase ID : FBgn0029891) du centre de stockage de Bloomington Drosophila (numéro d’identification : 34749). Dans cette étude, les mutants mâles de D. melanogaster PINK1B9-null sont comparés aux mâles de D. melanogaster de la souche w1118, qui est utilisée comme groupe témoin (patrimoine génétique). D’autres paramètres doivent être analysés de manière concomitante avec les expériences de respirométrie pour s’assurer que les mouches ont le génotype correct (Pink1B9/Y), tels que les déformations du thorax et les problèmes de locomotion, qui sont bien décrits pour les mouches mutantes roses1B9 24,25,26.
1. Animaux et logement
<ol><li>Conservez les mouches dans des bouteilles en verre contenant 10 mL d’alimentation standard (levure 1,73 %, farine de soja 0,9 %, farine de maïs 7,3 %, gélose 0,5 %, sirop de maïs 7,6 % et acide propionique 0,48 %) à température et humidité constantes (25 °C et 60 %, respectivement), avec un cycle lumière/obscurité de 12 h : 12 h.</li>
	<li>Pour chaque expérience, utilisez deux mouches âgées de 1 à 3 jours après l’éclosion. NOTE : Les mouches femelles vierges mutantes PINK1B9-null ont été croisées avec des mâles w1118 pour obtenir les mâles F1 avec le génotype Pink1B9/Y.</li>
</ol>2. Préparation de l’échantillon
<ol><li>Préparez le tampon MiR05 comme décrit dans le Tableau 1.</li>
	<li>Anesthésier les mouches sur de la glace et les transférer dans des tubes de microcentrifugation (deux mouches par tube).</li>
	<li>Dans chaque tube, ajouter 200 μL de tampon MiR05 réfrigéré et homogénéiser les mouches. Homogénéiser manuellement, en appliquant une légère pression (environ 4 à 6 coups de pilon) pour éviter la désintégration des mitochondries.</li>
</ol>3. Étalonnage de respirométrie à haute résolution des capteurs polarographiques d’oxygène
REMARQUE : Les chambres OROBOROS ont un volume total d’environ 2 mL. Un étalonnage est nécessaire pour s’assurer que le flux d’oxygène est proche de 0 pmol pour commencer le test.
<ol><li>En commençant l’étalonnage, ajoutez 2 mL de MiR05 dans la chambre. Couvrez la chambre avec le bouchon en ne laissant aucune bulle d’air ; Ensuite, tirez délicatement sur le bouchon pour former une seule bulle d’air.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel OROBOROS Dat.Lab. Entrez une température de 25 °C dans le champ Température du bloc et cliquez sur Se connecter à l’Oxygraph-2k (Figure 1A).</li>
	<li>Cliquez et sélectionnez le dossier dans lequel l’étalonnage doit être enregistré et cliquez sur Enregistrer.</li>
	<li>Lorsqu’une nouvelle fenêtre s’ouvre, nommez l’expérience et les échantillons (en cas d’étalonnage, entrez simplement le nom de l’étalonnage) et cliquez sur Enregistrer.</li>
	<li>Allez dans le menu Mise en page et choisissez la première option : 01 Exp. d’étalonnage Gr.3 - Temp comme indiqué à la Figure 1B.</li>
	<li>Attendez que le programme redirige vers la disposition d’étalonnage, attendez que la ligne rouge affiche une ligne droite standard avec des points autour de 0 pmol. Ensuite, sélectionnez deux points : l’un pour la chambre A et l’autre pour la chambre B (Figure 1C) lorsque la ligne rouge est exactement à zéro. REMARQUE : Les points sélectionnés doivent avoir un flux d’oxygène (ligne rouge) autour de 0.<ol><li>Pour marquer les points des deux chambres, sélectionnez la concentration O2 à droite de l’écran, sélectionnez le point marqué et copiez les valeurs de température et de pression barométrique par rapport au point. Collez ces valeurs dans les cases ci-dessous et cliquez sur Calibrer et copier dans le presse-papiers dans le coin inférieur droit de l’écran, comme illustré à la figure 2.</li>
		<li>Effectuez ce processus pour les deux chambres (A et B), puis allez dans le menu Fichier et sélectionnez Enregistrer et déconnecter. REMARQUE : Après le processus d’étalonnage, le programme redirigera l’utilisateur vers l’écran d’accueil afin que le logiciel soit prêt à démarrer le test HRR. Pour ce test, nous utiliserons le protocole SUIT.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Protocole SUIT
<ol><li>Une fois l’étalonnage terminé, retirez les bouchons et ouvrez les chambres.</li>
	<li>Lavez les bouchons (en tenant l’embout qui ne touche pas l’échantillon) et les chambres avec 100 % d’éthanol, 70 % d’éthanol et de l’eau distillée, dans cet ordre. REMARQUE : Répétez le processus pour chaque changement d’échantillon.</li>
	<li>Homogénéiser les mouches dans 200 μL de tampon, placer tout le contenu de l’échantillon dans la chambre à l’aide d’une micropipette et déplacer le bouchon dans la chambre en prenant soin de ne pas créer de bulles d’air. REMARQUE : Si des bulles d’air se forment, retirez délicatement le bouchon et ajoutez 100 μL de tampon MIR05.</li>
	<li>Cliquez sur le menu Mise en page et sélectionnez l’option 05 Débit par volume corrigé comme illustré à la figure 1B.</li>
	<li>Attendez d’être redirigé vers une nouvelle fenêtre. Cliquez sur Enregistrer pour sélectionner le dossier dans lequel l’expérience doit être enregistrée.</li>
	<li>Attendez qu’une nouvelle fenêtre s’ouvre. Nommez l’expérience dans l’espace Code expérimental. Ensuite, nommez chaque échantillon dans sa chambre A et B respective dans le champ Échantillon , et définissez l’unité de champ sur unité. REMARQUE : D’autres unités peuvent également être choisies, par exemple, Millions de cellules ou mg.</li>
	<li>Étant donné que ce protocole utilise deux mouches (2 unités) et que le volume de la chambre est de 2 mL, dans le champ Concentration , définissez 1 par mL (Figure 1D). REMARQUE : Ici, la quantité d’échantillon a été normalisée en fonction du nombre de mouches ; cependant, cette normalisation peut être effectuée par la teneur en protéines de l’échantillon, la quantification de l’ADN mitochondrial ou l’activité de la citrate synthase.</li>
	<li>Lorsque le signal de flux d’oxygène (ligne rouge) est stable sur la valeur positive, commencez le protocole HRR avec le titrage des substrats, des inhibiteurs et des découpleurs (Figure 3). Tous les réactifs et équipements suivants sont présentés dans le tableau 1.<ol><li>Ajouter de la digitonine (5 μg/mL) pour perméabiliser la membrane mitochondriale.</li>
		<li>Ajoutez des substrats de pyruvate (5 mM), de malate (2 mM) et de proline (10 mM) et attendez que le flux d’oxygène augmente et se stabilise. Pour marquer l’événement de chaque ajout de réactif, appuyez sur la touche F4 du clavier et entrez le nom de chaque réactif.</li>
		<li>Ajouter de l’ADP (5mM) pour coupler la chaîne respiratoire mitochondriale et attendre l’augmentation et la stabilisation du flux d’oxygène.</li>
		<li>Ajouter le succinate (10 mM) et attendre l’augmentation et la stabilisation du flux d’oxygène.</li>
		<li>Ajoutez de l’oligomycine (2,5 μM) pour inhiber l’ATP synthase et rechercher une diminution du flux d’oxygène.</li>
		<li>Attendez que la ligne rouge se stabilise et découplez le transfert d’électrons mitochondriaux à l’aide de cyanure de carbonyle-4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) avec des titres de 0,25 μM jusqu’à ce que la consommation maximale d’oxygène soit atteinte, démontrée par l’élévation de la ligne rouge. Après avoir stabilisé le flux d’oxygène, commencez à ajouter les inhibiteurs de chaque complexe, un à la fois.</li>
		<li>Ajouter de la roténone (0,5 μM), un inhibiteur du complexe I. Attendez la diminution et la stabilisation du flux d’oxygène pour ajouter l’inhibiteur suivant.</li>
		<li>Ajouter du malonate (5 mM), un inhibiteur du complexe II. Attendez la diminution et la stabilisation du flux d’oxygène pour ajouter l’inhibiteur suivant.</li>
		<li>Enfin, ajoutez de l’antimycine (2,5 μM), un inhibiteur du complexe III. Attendez la diminution suivie de l’augmentation et de la stabilisation du flux d’oxygène. REMARQUE : Le flux d’oxygène devrait se stabiliser à une valeur positive mais inférieure à la valeur de la dernière inhibition des complexes protéiques mitochondriaux.</li>
	</ol></li>
	<li>À la fin de l’analyse, retirez tout le contenu des chambres à l’aide d’une micropipette. Conserver à -20 °C pour une analyse ultérieure, si nécessaire.</li>
</ol>5. Analyse des données
<ol><li>Utiliser un progiciel statistique approprié pour l’analyse des données.</li>
	<li>Effectuez des tests t pour évaluer les différences entre les deux groupes. Pour les situations impliquant plusieurs traitements, utilisez l’analyse de variance (ANOVA) comme test statistique 27.</li>
	<li>Extrayez les valeurs de flux d’O2 à partir du graphique généré par le logiciel. OXPHOS CI fait référence à la valeur du flux d’O2 après l’ajout d’ADP. OXPHOS CII est obtenu en soustrayant OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII est la valeur du flux d’O2 extrait après l’ajout de succinate. ETS CI&CII est la valeur du flux O2 après l’ajout de FCCP. ETS CI = FCCP - Roténone et ETS CII = Roténone - Malonate.</li>
	<li>Calculer la synthèse de l’ATP comme la différence entre l’OXPHOS (P) et la FUITE (L) (P - L)28.</li>
	<li>Déterminer le rapport de contrôle respiratoire (RCR) en calculant le rapport OXPHOS/LEAK, où RCR = P/L.11</li>
</ol>

Analyse de la physiologie mitochondriale et de la bioénergétique chez les mouches des fruits

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<li>Poddighe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucuna+pruriens+%28Velvet+bean%29+rescues+motor%2C+olfactory%2C+mitochondrial+and+synaptic+impairment+in+PINK1B9+Drosophila+melanogaster+genetic+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson's disease.</a> PloS One. 9 (10), e110802(2014).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Winer, L. S. P., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+glycolytic+and+oxidative+substrate+flux+of+cancer+cells+in+a+microplate%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate.</a> PloS One. 9 (10), e109916(2014).</li>
<li>Plitzko, B., Loesgen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxygen+consumption+rate+%28OCR%29+and+extracellular+acidification+rate+%28ECAR%29+in+culture+cells+for+assessment+of+the+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism.</a> Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+the+analysis%2C+standardization+and+interpretation+of+oxygen+consumption+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements.</a> Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).</li>
<li>Bingol, B., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitophagy%3A+PINK1%2C+Parkin%2C+USP30+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond.</a> Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.

La HRR est une technique puissante pour étudier la respiration mitochondriale et le métabolisme énergétique chez D. melanogaster et d’autres organismes. Il fournit une évaluation détaillée et quantitative de la fonction mitochondriale, permettant aux chercheurs de mieux comprendre la bioénergétique des cellules. Le protocole présenté ici décrit l’évaluation de la fonction de la chaîne respiratoire mitochondriale et de l’activité de complexes mitochondriaux spécifiques à l’aide du protocole SUIT chez D. melan...

Les mitochondries sont des organites cellulaires qui contrôlent des fonctions importantes, notamment la régulation apoptotique, l’homéostasie calcique et la participation aux voies de biosynthèse. En possédant du matériel génétique autonome, ils sont capables de contribuer aux processus de maintenance et de réparation cellulaires. Leur structure abrite la chaîne de transport d’électrons et la phosphorylation oxydative, toutes deux cruciales pour l’énergie cellulaire 1,2,3. En particulier, le contrôle de l’énergie est obtenu grâce à la production d’adénosine triphosphate (ATP) par phosphorylation oxydative (OXPHOS)2. La perturbation du métabolisme énergétique avec altération des fonctions mitochondriales se produit à la fois dans la survie et la mortcellulaire4,5, fréquemment associée à un large éventail de pathologies humaines, telles que le cancer, et les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (MP)3,6.
La maladie de Parkinson est un trouble chronique, progressif et neurologique. La cause principale de cette maladie est la mort des cellules cérébrales, en particulier dans la substance noire, qui sont responsables de la production du neurotransmetteur dopamine, qui contrôle le mouvement 6,7,8. La première observation qui a lié le parkinsonisme au dysfonctionnement mitochondrial a été faite en 1988, dans des modèles expérimentaux utilisant des toxines qui inhibent la chaîne respiratoire Complexe I9.
À l’heure actuelle, il existe plusieurs méthodes pour évaluer le dysfonctionnement mitochondrial 10,11,12,1 3 ; cependant, par rapport aux approches conventionnelles, la respirométrie à haute résolution (HRR) présente une sensibilité et des avantages supérieurs13,14. Par exemple, les protocoles HRR permettent d’évaluer l’ensemble de la fonction de la chaîne respiratoire mitochondriale ou l’activité de complexes mitochondriaux spécifiques14,15. Les dysfonctionnements mitochondriaux peuvent être évalués dans des cellules intactes, des mitochondries isolées, ou même ex vivo 10,11,13,14.
Les dysfonctionnements mitochondriaux sont étroitement associés à de nombreux processus pathologiques et physiologiques. Il est donc important d’étudier la physiologie mitochondriale et la bioénergétique à l’aide de systèmes modèles génétiquement et expérimentalement traitables. À cet égard, la recherche sur Drosophila melanogaster, la mouche des fruits, présente plusieurs avantages. Ce modèle partage des caractéristiques et des processus cellulaires fondamentaux avec les humains, y compris l’utilisation de l’ADN comme matériel génétique, des organites communs et des voies moléculaires conservées impliquées dans le développement, l’immunité et la signalisation cellulaire. De plus, les mouches des fruits ont un cycle de vie rapide, un entretien facile, un faible coût, un débit élevé et moins de préoccupations éthiques, constituant ainsi un outil inestimable pour disséquer les processus cellulaires complexes 16,17,18,19,20.
De plus, un homologue du gène de la kinase 1 putative induite par PTEN (pink1) est exprimé chez D. melanogaster. Il joue un rôle crucial dans l’élimination des mitochondries endommagées par le processus de mitophagie8. Chez l’homme, les mutations de ce gène prédisposent les individus à une forme familiale autosomique récessive de la maladie de Parkinson associée à un dysfonctionnement mitochondrial 8,21,22,23. Par conséquent, la mouche des fruits est un modèle animal puissant pour les études sur la physiopathologie de la maladie de Parkinson et le criblage de candidats-médicaments axés sur le dysfonctionnement mitochondrial et la bioénergétique. Par conséquent, le présent travail explique comment analyser la fonction mitochondriale dans un modèle de MP de D. melanogaster en utilisant la technique HRR dans l’OROBOROS avec le protocole SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td>Adénosine 5&prime ;-diphosphate sal sodique (numéro CAS 72696-48-1) ; 95%; Poids moléculaire = 501,31 g/mol.</td></tr><tr><td>&Aacute ; gar</td><td>Kasv</td><td>K25-1800</td><td>Pour utilisation bactériologique</td></tr><tr><td>Antimycine-A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Antimycine A de Streptomyces sp. (numéro CAS 1397-94-0) ; poids moléculaire&nbsp ; 540 g/mol ;</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Albumine sérique bovine (numéro CAS 9048-46-8) ; pH 7,0 &ge ; 98 %</td></tr><tr><td>Logiciel Datlab</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Autriche</td><td>20700</td><td>Logiciel pour l’acquisition et l’analyse de données</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 5628</td><td>Numéro CAS 11024-24-1</td></tr><tr><td>Eau</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>distilléeDrosophila melanogaster souche w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3</td><td></td><td></td><td>Obtenu du centre de stock de Drosophila de Bloomington</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster souche&nbsp ; w1118</td><td></td><td></td><td>Obtenu&nbsp ; de l’Université fédérale de Santa Maria</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-acide tétraacétique (numéro CAS 13638-13-3) ; 97%; masse moléculaire = 468,28 g/mol</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>Cyanure de carbonyle 4- (trifluorométhoxy)phénylhydrazone&nbsp ; (numéro CAS 370-86-5) ; &ge ; 98 % (TLC), poudre&nbsp ;</td></tr><tr><td>GraphPad Prism version 8.0.1.</td><td></td><td></td><td>Logiciel d’acquisition et d’analyse de données</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td> 4<td>-(2-Hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthanesulfonique (numéro CAS 7365-45-9) ; 99,5 % (titrage), testé sur culture cellulaire ; masse moléculaire = 238,30 g/mol</td></tr><tr><td>Respiromètre haute résolution Oxygraph O2K</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Autriche</td><td>10022-02</td><td>Startup O2K respirometer</td></tr><tr><td>kit KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td>Phosphate monopotassique (numéro CAS 7778-77-0) ; Reagente Plus, poids moléculaire = 136,09 g/mol</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>211473</td><td>Hydroxyde de potassium (numéro CAS 1310-58-3) ; réactif ACS, &ge ; 85 %, granulés Malate</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td>Acide malonique (numéro CAS 141-82-2) ; 99 %, poids moléculaire = 104,06 g/mol). Le pH d’une solution est ajusté à environ 7,0.</td></tr><tr><td>Acide malique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td>(S)-(&minus ;)-Acide 2-hydroxysuccinique (numéro CAS 97-67-6) ; &ge ; 95% ; poids moléculaire = 134,09 g/mol</td></tr><tr><td>d’acide</td> 2-(N-morpholino)éthanesulfonique MES <td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>(numéro CAS 4432-31-9) ; &ge ; 99 % (titrage) ; masse moléculaire = 195,24 g/mol</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>(numéro CAS 7786-30-3) ; anhydre, &ge ; 98 %, poids moléculaire = 95,21 g/mol</td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuger</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O2K-Titration Kit</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Autriche</td><td>20820-03</td><td>Seringues Hamilton de différents volumes</td></tr><tr><td>Oligomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O 4876</td><td>Oligomycine de&nbsp ; Streptomyces diastatochromogenes (numéro CAS 1404-19-9) ; &ge ; 90 % d’oligomycines totales à base (HPLC)</td></tr><tr><td>Pistil à homogénéisation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td>L-Proline (numéro CAS 147-85-3) ; poudre ; 99 % ; poids moléculaire = 115,13 g/mol</td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Pyruvate de sodium (numéro CAS 113-24-6), &ge ; 99%; masse moléculaire = 110,04 g/mol</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Rotetone (numéro CAS 83-79-4) ; &ge ; 95 %, poids moléculaire 394,42 g/ mol</td></tr><tr><td>Succinate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S 2378</td><td>Succinate de sodium dibasique hexahydraté (numéro CAS 6106-21-4) ; &ge ; 99 %</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck</td><td>107,651,000</td><td>Saccharose à usage microbiologique (numéro CAS 57-50-1)</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td>Numéro CAS 107-35-7</td></tr></tbody></table>

analyse de la fonction mitochondriale chez un mutantb9-null de drosophila melanogaster pink1 à l’aide de la respirométrie à haute résolution

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Les maladies neurodégénératives, y compris la maladie de Parkinson (MP), et les perturbations cellulaires telles que le cancer sont quelques-uns des troubles qui perturbent le métabolisme énergétique avec une altération des fonctions mitochondriales. Les mitochondries sont des organites qui contrôlent à la fois le métabolisme énergétique et les processus cellulaires impliqués dans la survie et la mort cellulaires. Pour cette raison, les approches d’évaluation de la fonction mitochondriale peuvent offrir des informations importantes sur les conditions cellulaires dans les processus pathologiques et physiologiques. À cet égard, les protocoles de respirométrie à haute résolution (HRR) permettent d’évaluer l’ensemble de la fonction de la chaîne respiratoire mitochondriale ou l’activité de complexes mitochondriaux spécifiques. De plus, l’étude de la physiologie mitochondriale et de la bioénergétique nécessite des modèles génétiquement et expérimentalement traitables tels que Drosophila melanogaster.
Ce modèle présente plusieurs avantages, tels que sa similitude avec la physiologie humaine, son cycle de vie rapide, sa facilité d’entretien, sa rentabilité, ses capacités de débit élevées et un nombre réduit de préoccupations éthiques. Ces attributs en font collectivement un outil inestimable pour disséquer des processus cellulaires complexes. Le présent travail explique comment analyser la fonction mitochondriale à l’aide du mutantB9-null de Drosophila melanogaster PINK1. Le gène pink1 est responsable du codage de la kinase présumée 1 induite par PTEN, par un processus reconnu sous le nom de mitophagie, qui est crucial pour l’élimination des mitochondries dysfonctionnelles du réseau mitochondrial. Des mutations de ce gène ont été associées à une forme familiale autosomique récessive précoce de la maladie de Parkinson. Ce modèle peut être utilisé pour étudier le dysfonctionnement mitochondrial impliqué dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson.

Ici, nous constatons que le flux d’O2 dans les états OXPHOS CI (P = 0,0341) et OXPHOS CI&amp;II (P = 0,0392) est réduit chez les mouches nulles PINK1B9 par rapport aux mouches témoins (Figure 4). Ce résultat a également été observé dans les résultats précédents de notre groupe29,30.
L’IC et l’IC sont des composants clés du système de transport d’électrons (ET...

Nous présentons ici un protocole de respirométrie à haute résolution pour analyser la bioénergétique chez les mouches des fruits mutantes PINK1B9-null. La méthode utilise le protocole SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

Analyse de la fonction mitochondriale chez un mutantB9-Null de Drosophila melanogaster PINK1 à l’aide de la respirométrie à haute résolution

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...

Notre recherche utilise Drosophila melanogaster comme modèle expérimental pour comprendre la fonction mitochondriale dans la maladie et la toxicité chimique. Voici quelques questions auxquelles nous voulons répondre : comment la mutation PINK-1 affecte-t-elle la fonction mitochondriale et comment est-elle liée à la maladie de Parkinson ? Comment pouvons-nous inverser, ou éviter, le dysfonctionnement mitochondrial associé à cette mutation ?La respirométrie à haute résolution nécessite une formation spécialisée pour un fonctionnement précis et une analyse des données. De plus, le système que nous avons utilisé ne permet pas de travailler avec plusieurs échantillons simultanément et n’est pas conçu pour l’analyse à haut débit. Étant donné qu’il n’est possible d’exécuter que deux échantillons en même temps, le plan expérimental doit être bien délimité.Nos résultats indiquent une altération progressive de la fonction mitochondriale à laquelle nous sommes confrontés chez les mutants PINK1-Null, qui se caractérise par une diminution de la liaison OXPHOS CI et de la liaison ETS CI&CII, et un changement métabolique métabolique dans la production d’ATP des voies oxydatives à glycolytiques. Ces résultats sont étroitement liés à la physiopathologie de la maladie de Parkinson. L’un des points clés de la respirométrie à haute résolution est sa capacité à fournir des mesures directes et précises de la consommation d’oxygène, permettant une analyse détaillée de la fonction mitochondriale et du métabolisme cellulaire.De plus, il est polyvalent. Il peut être utilisé pour un large éventail de types d’échantillons, y compris les mitochondries isolées. Étant donné que le dysfonctionnement mitochondrial est une caractéristique commune des maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Parkinson, nous nous concentrerons à l’avenir sur la façon dont la fonction mitochondriale et l’élévation de l’énergie pourraient être des cibles importantes pour les thérapies dirigées contre les maladies neurodégénératives.

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mitochondries jouent un rôle central dans la régulation du métabolisme et de l’homéostasie. Des changements subtils dans le métabolisme mitochondrial qui affectent la physiologie de l’organisme pourraient être difficiles à détecter dans les études métabolomiques de l’organisme entier. Nous décrivons ici une méthode d’isolement qui améliore la détection de changements métaboliques subtils chez Drosophila melanogaster.

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L’analyse de la relation structure-fonction mitochondriale est nécessaire pour une compréhension approfondie des mécanismes de régulation de la fonctionnalité mitochondriale. Des méthodes spécifiques pour étudier la structure et la fonction mitochondriales dans les ovaires de drosophile vivants et fixes sont décrites et démontrées dans cet article.

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Découvrez la respirométrie à haute résolution pour analyser la bioénergétique mitochondriale chez Drosophila melanogaster mutants PINK1 B9-null. Cette méthode permet d'étudier la fonction mitochondriale liée à la maladie de Parkinson.

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Analyse de la fonction mitochondriale chez un mutant^B9-Null de Drosophila melanogaster PINK1 à l’aide de la respirométrie à haute résolution

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