Préparation d’échantillons pour la cryotomographie in situ de cellules de mammifères
15 décembre 2023
Cette méthode fournit un protocole accessible et flexible pour la préparation de grilles de microscopie électronique (EM) pour la cryotomographie cellulaire in situ et la microscopie optique et électronique corrélative (CLEM).
L’objectif de cette recherche est de développer une méthodologie de préparation d’échantillons qui soit à la fois accessible et reproductible de manière fiable. En y parvenant, la puissance de la cryotomographie électronique cellulaire directe peut être utilisée pour répondre à une grande variété de questions biologiques. Les défis de la préparation du réseau sont considérables.
Les cellules ne se fixent pas facilement aux grilles et la manipulation peut endommager la couche de carbone, entraînant la perte de zones de grille imageables. De plus, la prévalence des protubérances cellulaires minces est réduite sans attention aux conditions de préparation appropriées des échantillons. Les protocoles actuels nécessitent généralement des équipements spécialisés pour résoudre les principaux goulots d’étranglement de l’ensemencement, tels que le micro-motif et les supports imprimés en 3D pour la fixation et la manipulation des cellules, respectivement.
Ce protocole offre des solutions plus accessibles, tout en conservant la flexibilité nécessaire à l’utilisation de ces outils spécialisés pour les applications en aval.
Aperçu
Cette méthode fournit un protocole accessible et souple pour la préparation de grilles de microscopie électronique (EM) destinées à la cryotomographie cellulaire in situ et à la microscopie correlative en lumière et en électrons (CLEM). Le protocole répond aux difficultés liées à la préparation des grilles, en assurant l'attachement des cellules et en minimisant les dommages causés à la couche de carbone.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Microscopie électronique
Contexte
- La tomographie électronique cryogénique directe des cellules est un outil puissant pour la recherche biologique.
- La préparation de la grille est essentielle pour une imagerie et une analyse réussies.
- Les méthodes actuelles nécessitent souvent des équipements spécialisés, ce qui limite leur accessibilité.
- Ce protocole vise à simplifier le processus tout en conservant une grande flexibilité.
Objectif de l'étude
- Développer une méthodologie reproductible et accessible pour la préparation des grilles de microscopie électronique.
- Améliorer l'utilisabilité de la tomographie électronique cryogénique dans les études biologiques.
- Résoudre les problèmes courants liés à l'attachement des cellules et à l'intégrité des grilles.
Méthodes utilisées
- Traitement des grilles par décharge lumineuse pour améliorer l'adhésion cellulaire.
- Application de fibronectine bovine pour favoriser l'attachement cellulaire.
- Ensemencement cellulaire et procédures de transfection pour des clones moléculaires du VIH.
- Plongée rapide des grilles pour l'imagerie par tomographie électronique cryogénique.
Résultats principaux
- Fixation réussie des cellules sur les grilles de microscopie électronique avec des dommages minimaux.
- Observation de cellules productrices de VIH à l'aide de la microscopie corrélative cryogénique.
- Préservation efficace de l'intégrité des grilles durant le processus de préparation.
- Démonstration de la reproductibilité du protocole au cours de plusieurs essais.
Conclusions
- Le protocole développé améliore l'accessibilité à la préparation des grilles de microscopie électronique.
- Il permet une étude efficace des processus cellulaires par tomographie électronique cryogénique.
- Des applications futures pourront exploiter cette méthode pour diverses recherches biologiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Une préparation robuste des échantillons pour la cryotomographie in situ de cellules de mammifères est essentielle afin de permettre des études structurales à haute résolution dans des contextes cellulaires natifs. Ce protocole vise à résoudre les principaux goulots d'étranglement liés à la manipulation des grilles, à l'attachement cellulaire et à la reproductibilité, ce qui influe directement sur la fiabilité des analyses d'imagerie et des analyses intégratives en aval. Une meilleure accessibilité et une standardisation accrue de la préparation des échantillons renforcent la confiance prédictive ainsi que la prise de décisions dans les phases précoces de la découverte et de la recherche translationnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une visualisation directe de l'ultrastructure cellulaire pour l'atténuation des risques mécanistiques.
- Permet de valider fonctionnellement la cible en préservant l'environnement cellulaire natif.
- Facilite l'interrogation fondée sur des hypothèses des assemblages moléculaires in situ.
Développement de criblages et de tests
- Prépare des échantillons biologiques validés pour des protocoles d'imagerie corrélative.
- Standardise la préparation des grilles afin de garantir la reproductibilité et des résultats d'imagerie quantitatifs.
- Améliore la préparation aux analyses à haut débit et aux plateformes de microscopie intégrative.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats d'imagerie avec des modèles cellulaires pertinents pour la maladie afin d'assurer une continuité translationnelle.
- Permet l'évaluation structurale des interactions virales et cellulaires dans des systèmes précliniques.
- Facilite une progression ajustée aux risques en fournissant des données morphologiques de haute fidélité.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole de préparation des échantillons s'intègre à l'interface entre la biologie de la découverte et l'imagerie avancée, en soutenant les flux de travail allant des premières études mécanistiques à la validation de modèles précliniques.
- Biologie de la découverte : Fournit une préparation d'échantillons reproductible pour le test d'hypothèses et la clarification des voies biologiques.
- Criblage : Fournit des grilles standardisées de haute qualité pour l'imagerie quantitative et le développement de tests.
- Analytique : Permet l'acquisition de données structurales robustes pour des analyses comparatives entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte scientifique et la recherche préclinique en conservant le contexte cellulaire dans les images obtenues.
- Réutilisation en milieu professionnel : Établit un protocole souple et accessible, adaptable à divers types cellulaires et modalités d'imagerie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté dans la validation structurale des cibles.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité, la standardisation et l'évolutivité des protocoles de préparation des échantillons.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions d'avancement ou d'abandon et l'efficacité du capital en réduisant les échecs d'imagerie.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement, ajustées au risque, des cibles validées structuralement.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire, manipulation des grilles et techniques de microscopie.
- Exige un accès à des dispositifs de décharge luminescente, des hottes de sécurité biologique et du matériel de congélation par immersion.
- Implique une standardisation interéquipes pour garantir une préparation reproductible des grilles et une qualité d'imagerie constante.
- Adaptable à divers types de cellules mammaliennes adhérentes, avec des modifications du protocole selon les besoins.
- La fragilité des grilles et leur manipulation constituent des limites pratiques nécessitant une manipulation soigneuse.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:10
Preparing Electron Microscopy (EM) Grids for Cellular Cryotomography
3:34
Cell Seeding and Transfection on Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography
5:34
Plunge Freezing of Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography
