Name: Micro-injection d’un rétrovirus RCAS(A) recombinant dans une lentille embryonnaire de poulet (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-01T14:05:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: Découvrez la micro-injection de rétrovirus RCAS(A) dans la lentille embryonnaire de poulet pour étudier l'expression protéique in situ. Cette méthode rapide et personnalisable permet d'explorer le développement du cristallin et les cibles thérapeutiques.

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Ce travail a été soutenu par les subventions des National Institutes of Health (NIH) : RO1 EY012085 (à J.X.J) et F32DK134051 (à F.M.A), et par la subvention de la Fondation Welch : AQ-1507 (à J.X.J.). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. Les figurines ont été partiellement créées avec Biorender.com.

Cette étude a été menée conformément à la Loi sur le bien-être des animaux et au Règlement d’application sur le bien-être des animaux, conformément aux principes du Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université du Texas à San Antonio. Pour obtenir une vue d’ensemble du protocole, reportez-vous à la figure 1 ; voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig01.jpg"> Figure 1 : Plan expérimental. 1. La première étape du protocole est la détermination d’une ou de plusieurs protéines cibles spécifiques, l’identification de la ou des séquences de gènes associées et la génération de fragments d’ADN. 2. Clonage de la ou des séquences de gènes dans un vecteur rétroviral par clonage initial dans un vecteur adaptateur, 3. suivi d’un vecteur viral. 4. Préparation de particules virales à haut titre à l’aide de cellules d’emballage pour la récolte et la concentration. 5. La dernière étape, et l’objectif de ce protocole, est la micro-injection de particules virales RCAS(A) dans la lumière du cristallin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
1. Préparation de rétrovirus recombinants à haut titre
<ol><li>Réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour fabriquer des fragments d’ADN de protéines cibles NOTE : Cette section vise à amplifier la séquence d’ADN correspondant à la protéine du cristallin cible. Pour plus de détails, voir 7,8.<ol><li>Concevoir des amorces pour la PCR, correspondant à la protéine d’intérêt, pour fabriquer des fragments d’ADN avec leurs terminaisons carboxyle dans le cadre avec ou sans séquence d’épitope FLAG (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), un codon stop et un site enzymatique de restriction (c’est-à-dire EcoRI) présent à l’intérieur de la région polylinker de CLa12NCO)) selon les spécifications notées dans les protocoles publiés précédemment, avec des séquences pour les enzymes de restriction adéquates1, 7,8,10,11.</li>
		<li>Effectuer la réaction PCR10. Combinez 100 pmol de sens et d’antisens des amorces conçues avec 0,5 μg d’ADNc de connexine (telles que les combinaisons Cx50, Cx43 ou Cx50*43L chimériques), au tampon de réaction PCR de votre choix. Effectuez 30 cycles à 94 °C pendant 1 min, 58 °C pendant 1 min et 72 °C pendant 1 min, suivis d’une extension finale de 10 min à 72 °C.</li>
		<li>Isolez et purifiez les produits PCR à l’aide d’un kit de purification de gel.</li>
		<li>Digérer les produits PCR purifiés à l’aide d’enzymes de restriction de votre choix selon les instructions du fabricant.</li>
	</ol></li>
	<li>Clonage d’inserts d’ADN dans un plasmide adaptateur REMARQUE : L’insertion de fragments d’ADN dans un vecteur adaptateur élimine le besoin de cellules/virus auxiliaires pour augmenter la stabilité du vecteur RCAS(A)14. Pour plus de détails, voir 7,8.<ol><li>Sous-cloner des fragments d’ADN dans un plasmide adaptateur, Cla12NCO, à l’aide d’une réaction de ligature à extrémité collante. Mélangez les fragments de PCR avec des enzymes de restriction et du Cla12NCO dans un rapport de 2 à 5 :1. Effectuer la ligature et la transformation de l’ADN à l’aide de cellules compétentes.</li>
		<li>Isolez l’ADN à l’aide d’un kit d’isolement de l’ADN.</li>
		<li>Séquençez l’ADN pour en assurer l’exactitude.</li>
	</ol></li>
	<li>Clonage dans le vecteur viral RCAS(A) NOTE : Des fragments d’ADN sont insérés dans un véhicule (rétrovirus RCAS(A)) pour la transduction stable d’un gène dans les cellules de l’embryon de poussin en développement14,15. Pour plus de détails, voir 7,8,15.<ol><li>Digérer le fragment d’ADN Cla12NCO du vecteur contenant l’intérêt avec ClaI (1 unité pour 1 μg d’ADN) et isoler les fragments sur gel.</li>
		<li>Sous-cloner les fragments d’ADN dans un plasmide RCAS(A) linéarisé par ClaI. Utilisez l’enzyme de restriction SalI pour distinguer le site ClaI sur le plasmide RCAS(A).</li>
		<li>Confirmer l’orientation correcte des fragments insérés sur les constructions par digestion avec les enzymes de restriction ClaI et Sali.</li>
		<li>Isolez l’ADN à l’aide d’un kit d’isolement de l’ADN.</li>
		<li>Déterminer la concentration d’ADN.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfection de cellules de fibroblastes embryonnaires de poussin (CEF) et récolte de RCAS(A) NOTA : Les cellules d’emballage de virus, les CEF, sont utilisées pour obtenir/récolter des milieux de culture cellulaire contenant des particules virales15,16. Pour plus de détails, voir 7,8,15.<ol><li>Transfectez les cellules CEF avec des constructions d’ADN rétroviral recombinantes à l’aide de l’agent de transfection selon les instructions du fabricant.</li>
		<li>Effectuer un transfert Western des cellules transfectées pour examiner leur expression de la protéine d’intérêt.</li>
		<li>Lorsque les cellules transfectées atteignent la confluence, commencez à collecter le milieu surnageant, à le traiter/filtrer de manière appropriée (pour éliminer les débris cellulaires à l’aide d’un filtre de 0,22 μm) et à le stocker à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être concentré.</li>
	</ol></li>
	<li>Concentration et titrage des stocks viraux REMARQUE : La pastille et les grands volumes de milieux dérivés des cellules contenant les particules virales doivent être filtrés. De plus, un test de titre viral doit être effectué pour établir la force du virus contre les cellules hôtes. Pour plus de détails, voir 6,7,8,15.<ol><li>Décongeler le milieu de culture contenant les virions.</li>
		<li>Essorer le milieu de culture à 72 000 × g pendant 2 h à 4 °C.</li>
		<li>Décanter le surnageant et remettre en suspension la pastille virale avec le milieu résiduel (~50 μL) et conserver à -80 °C jusqu’à utilisation, dans des bouillons viraux de ~10 μL.</li>
		<li>Pour le titrage, à l’aide de cellules QT-6 ou CEF, transfectez les cellules avec une dilution en série des stocks viraux.</li>
		<li>Après la confluence, fixez les cellules à l’aide de 4% de formaldéhyde.</li>
		<li>Immunocoloration pour les protéines gag virales ou procédé pour la phosphatase alcaline par voie histochimique afin d’obtenir le titre, défini comme (unités formant colonie) UFC par millilitre (UFC/mL).</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig02.jpg"> Figure 2 : Instruments et configuration pour la micro-injection de lentilles de poussin. (A) Extracteur manuel de micropipettes à microélectrodes verticales P-30. (1) Encart montrant une micropipette en verre en cours d’extraction. (B) (2) Incubateur d’œufs. Incuber l’œuf de poule pendant ~65-68 h dans un incubateur à 37 °C jusqu’à ce qu’il atteigne le stade 18 (avec une lumière centrale scellée et vide) pour l’injection du rétrovirus. (C) Installation de micro-injection. (3) équipement d’éclairage, (4) pico-injecteur, (5) microscope à dissection, (6) micromanipulateur Drummond, (7) ordinateur/caméra pour la visualisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
2. Micro-injection de lentilles de poussin
<ol><li>Préparation des fournitures<ol><li>Préparation de micropipettes en verre pour micro-injection17 REMARQUE : Les capillaires en verre sont utilisés pour fabriquer des micropipettes en verre avec une pointe et un diamètre extérieur (OD) de ~11 μm pour la micro-injection. La configuration est illustrée à la figure 2A.<ol><li>Fixez le capillaire en verre borosilicaté aux clips rembourrés en caoutchouc dans l’extracteur de micropipette vertical manuel.</li>
			<li>Réglez la température de chauffage (HEAT 1) à 950 °C et effectuez un pré-tirage pour obtenir un capillaire en verre plus fin et plus doux.</li>
			<li>Réglez la température de chauffage (HEAT 2) à 790 °C et effectuez un tirage secondaire pour produire les micropipettes finales.</li>
			<li>À l’aide d’une meuleuse à micropipettes, affûtez l’ouverture de la pointe à un diamètre extérieur de ~11 μm.</li>
			<li>Pour de futures expériences, conservez les micropipettes en verre dans un tampon de serrage en éponge à l’intérieur d’un bocal en verre.</li>
		</ol></li>
		<li>Incubation des œufs fécondés jusqu’au stade de développement 18 REMARQUE : Pendant le développement du cristallin, à ~65-68 h de développement embryonnaire, le cristallin se sépare de l’ectoderme et forme une vésicule scellée avec une lumière centrale ; L’injection dans cette lumière vide de la lentille amorce l’expression restreinte aux cellules prolifératives du cristallin 7,8,18.<ol><li>Incuber les œufs de poule fécondés pendant ~65 à 68 h dans un incubateur à bascule humidifié à 37 °C (figure 2B).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Ouverture de l’œuf de poule REMARQUE : Cette étape décrit l’identification et l’exposition de l’embryon à la micro-injection. Pour plus de détails, voir 7,8.<ol><li>Essuyez soigneusement la zone de travail avec de l’éthanol à 70 %.</li>
		<li>Retirez les œufs de l’incubateur, vaporisez-les abondamment avec de l’éthanol à 70 % et laissez-les sécher à l’air libre.</li>
		<li>Placez l’œuf, avec l’extrémité la plus grande de l’œuf vers le haut, sur un porte-œufs.</li>
		<li>À l’aide d’une paire de pinces à dents acérées, faites un trou de ~2 cm de diamètre à l’extrémité la plus large de l’œuf en tapotant soigneusement sur la coquille de l’œuf et en enlevant des fragments de la coquille de l’œuf (figure 3A).</li>
		<li>À l’aide d’un microscope à dissection, localisez l’embryon.</li>
		<li>Une fois que l’embryon et le cristallin du poussin sont localisés, utilisez le microscope à dissection, la pince à dissection fine et les ciseaux pour couper la membrane amnionique qui recouvre immédiatement le haut de l’embryon (Figure 3B). REMARQUE : Ne coupez pas trop large (juste assez pour exposer l’embryon ~ 0,5 cm x 0,5 cm), sinon les embryons pourraient s’enfoncer dans la masse vitelline ; Évitez également de toucher les vaisseaux sanguins, si possible.</li>
		<li>Couvrir l’ouverture de l’œuf avec une boîte de Pétri de 60 mm en préparation des étapes suivantes.</li>
	</ol></li>
	<li>Micro-injection de stock viral concentré REMARQUE : Les particules virales contenant des fragments d’ADN de la protéine cible pour la transduction sont insérées dans les cellules à l’intérieur de la lumière du cristallin. La configuration est illustrée à la figure 2C. Pour plus de détails, voir 6,7,8.<ol><li>Décongeler les stocks de stocks viraux sur la glace.</li>
		<li>Pour visualiser le stock viral pendant l’injection, diluer 1 μL de 10x Fast green dans un flacon de stock viral contenant 10 μL.</li>
		<li>Pour s’assurer qu’il n’y a pas de gros morceaux de matière non dissoute qui pourraient obstruer la micropipette en verre, centrifugez les solutions pendant 10 s à 10 000 × g à 4 °C pour granuler de « gros morceaux » et transférer les surnageants dans de nouveaux tubes, tout en gardant les solutions sur de la glace.</li>
		<li>Sur une boîte de culture de 35 mm x 10 mm, placez un parafilm de laboratoire étiré et ajoutez 1 μL de solution saline stérile (PBS) sur le film (non stérilisé, avec le côté couvert considéré comme « propre »).</li>
		<li>Connectez une micropipette en verre préparée à un pico-injecteur automatique.</li>
		<li>Appuyez sur le mode de remplissage pour remplir la solution saline stérile (PBS) dans une micropipette en verre, puis utilisez le mode d’injection pour tester les 1 μL de liquide alloués.</li>
		<li>Placez un deuxième parafilm de laboratoire étiré sur la surface d’une nouvelle boîte de culture cellulaire de 35 mm x 10 mm et ajoutez 1 μL de bouillons viraux colorés en vert rapide sur le dessus du film.</li>
		<li>Abaissez l’extrémité de la micropipette dans le stock viral et appuyez sur le modèle de remplissage pour remplir la micropipette en verre avec ~1 μL de stock viral. REMARQUE : Pour éviter le dessèchement, placez l’embout de la micropipette remplie dans une solution saline stérile (PBS) chaque fois qu’il y a une pause dans la procédure.</li>
		<li>Abaissez la micropipette en verre remplie, reliée à un injecteur automatique, dans la région cible de la lumière du cristallin embryonnaire à l’aide d’un microscope à dissection.</li>
		<li>Ajustez la source de lumière pour assurer une visualisation claire du contour de la vésicule du cristallin. REMARQUE : La lumière de la lentille droite (vers le haut) est généralement utilisée pour l’injection et la gauche (vers le bas) est maintenue intacte comme contrôle controlatéral.</li>
		<li>Une fois que vous vous êtes assuré que la micropipette est placée au bon endroit à l’intérieur de la lumière de la lentille, injectez 5 à 40 nL de stock viral (Figure 3C). REMARQUE : La pratique est très nécessaire pour une mise en place optimale de l’injection.</li>
		<li>Attendez ~45 s, puis retirez délicatement la micropipette en verre.</li>
		<li>Vérifiez la réussite de la micro-injection dans la lumière de la lentille à l’aide du microscope à dissection en examinant le colorant Fast Green qui doit rester dans la lumière vide de la lentille sans aucune fuite.</li>
		<li>Après la procédure d’injection, scellez l’ouverture de la coquille d’œuf avec du ruban adhésif.</li>
		<li>Remettez l’embryon dans l’incubateur humidifié à 37 °C, sans aucun mouvement de rotation, jusqu’à ce que l’âge embryonnaire souhaité soit atteint pour la dissection du cristallin.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig03.jpg"> Figure 3 : Préparation et schéma du poussin par micro-injection. (A) Ouverture d’un œuf de poule. (B) Coupe de la membrane amniotique. (C) Schéma de micro-injection de lentilles de poulet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Étude de l’expression des protéines au cours du développement du cristallin de poulet

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<li>West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+the+lens+epithelial+explant+system+to+study+lens+differentiation+and+cataractogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).</li>
<li>Upreti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+epithelial+explants+treated+with+vitreous+humor+undergo+alterations+in+chromatin+landscape+with+concurrent+activation+of+genes+associated+with+fiber+cell+differentiation+and+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response.</a> Cells. 12 (3), 501(2023).</li>
<li>Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+SRC+kinases+signals+induction+of+posterior+capsule+opacification%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).</li>
<li>Briskin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+retroviral+transgenes+are+highly+expressed+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).</li>
<li>Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RCAS+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Biologica%22%5BJournal%5D)">The RCAS vector system.</a> Folia Biologica. 50 (3-4), 107-119 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Ce modèle expérimental offre la possibilité d’exprimer la ou les protéines d’intérêt dans le cristallin intact, ce qui conduit à l’étude de la pertinence fonctionnelle de ces protéines dans la structure et la fonction du cristallin. Le modèle de micro-injection embryonnaire de poussin est basé en partie sur les travaux de Fekete et. al.6 et a été développé par Jiang et. al.8 et a été utilisé comme moyen d’insérer à la fois des plasmides viraux et des agents tels que des ago...

L’objectif de ce protocole est de décrire la méthodologie de micro-injection embryonnaire de lentilles de poulet d’un RCAS(A) (sarcome aviaire compétent pour la réplication/leucose rétrovirale A). L’administration rétrovirale efficace dans un cristallin embryonnaire de poulet s’est avérée être un outil prometteur pour l’étude in vivo du mécanisme moléculaire et de la structure-fonction des protéines du cristallin dans la physiologie, les conditions pathologiques et le développement normaux du cristallin. De plus, ce modèle expérimental pourrait être utilisé pour l’identification de cibles thérapeutiques et le criblage de médicaments pour des affections telles que la cataracte congénitale humaine. Au total, ce protocole vise à définir les étapes nécessaires au développement d’une plateforme personnalisable pour l’étude des protéines du cristallin.
Les poussins embryonnaires (Gallus domesticus), en raison de leur similitude dans la structure et la fonction du cristallin avec le cristallin humain, sont un modèle animal bien établi pour l’étude du développement et de la physiologie du cristallin 1,2,3,4. L’utilisation d’un rétrovirus aviaire compétent pour la réplication RCAS(A) a été considérée comme un système très efficace, rapide et personnalisable pour exprimer des protéines exogènes dans les embryons de poussins. Notamment, il a une capacité unique à confiner le transfert de gène cible aux cellules prolifératives de la fibre du cristallin sans avoir besoin de promoteurs spécifiques aux tissus, en utilisant le délai de développement embryonnaire unique dans lequel la présence d’une lumière vide du cristallin permet une micro-injection in situ de RCAS(A) dans le site restreint pour l’expression de protéines exogènes dans les cellules prolifératives de la fibre du cristallin5, 6,7,8.
La procédure de micro-injection d’embryons de poussins, décrite en détail ici, est basée à l’origine en partie sur les travaux de Fekete et. al.6 et développé par Jiang et. al.8 et a été utilisé comme moyen d’introduire des plasmides viraux et non viraux dans le cristallin des poussins embryonnaires 1,9,10,11,12,13. Dans l’ensemble, les travaux antérieurs démontrent le potentiel de l’utilisation de cette méthodologie pour étudier le développement du cristallin, la différenciation, la communication cellulaire et la progression de la maladie, ainsi que pour la découverte et le test de cibles thérapeutiques pour les affections pathologiques du cristallin telles que la cataracte.

<table><tbody><tr><td>0,22 et micro ; m Filtre</td><td>Corning</td><td>431118</td><td>Pour l’élimination des débris cellulaires des milieux Plat de</td></tr><tr><td>culture 35 mm x 10 mm FisherScientific</td><td></td><td>50-202-030</td><td>Pour utilisation lors de la micro-injection</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Fisherbrand</td><td>13-100-676</td><td>Solution de rotation vers le bas</td></tr><tr><td>Constructions</td><td>GENEWIZ-Pour</td><td></td> <td>la génération de constructions</td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>AmScope</td><td>SM-4TZ-144A</td><td>Visualisation de la lentille pour micro-injection</td></tr><tr><td>d’amorces PCR</td><td>ADN</td> <td>intégrées-Génération</td> <td>d’amorces : Cx50 supprimé de la boucle intracellulaire (IL) (résidus 1&ndash ; 97 et 149&ndash ; 400) ainsi que le vecteur Cla12NCO ont été obtenus avec la paire d’amorces suivante : sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT ; antisens, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs de Cx43 (résidus 98&ndash ; 150) et Cx46 (résidus 98&ndash ; 166) étaient&nbsp ; obtenu avec les paires d’amorces suivantes : sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG ; antisens, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG ; sens, CACATTGTACGCATGGAAGAG ; antisense, AGCACCTCCC À ACGGATTC, respectivement modèle de construction Cla12NCO-Cx43 a été obtenu avec la paire d’amorces suivante : sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC ; antisens, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs de Cx50 (résidus 98&ndash ; 148) ou Cx46 (résidus 98&ndash ; 166) ont été clonés en utilisant les constructions Cla12NCO-Cx50 et Cla12NCO-Cx46 comme modèles avec la paire d’amorces suivante : sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA ; antisens, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC ; sens, CACATTGTACGCATGGAAGAG ; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectivement</td></tr><tr><td>Drummond Nanoject II Injecteur automatique de nanolitres</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td>Pipette de micro-injection</td></tr> Double col de <tr><td>cygne Lumières Microscope Illuminateur AmScope</td><td></td><td>LED-50WY</td><td>Éclairage pour la visualisation</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Porte-oeufs</td><td></td><td>--</td><td>Anneaux en polystyrène faits maison avec 2 pouces de diamètre et un demi-pouce</td></tr><tr><td>de hauteur Incubateur d’œufs</td><td>GQF Manufacturing Company Inc.</td><td>1502</td><td>Pour l’incubation d’œufs fécondés</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Fisher scientific</td><td>F99-10</td><td>Pour la visualisation de l’injection de stock viral</td></tr><tr><td>Œufs de poule leghorn blanc fécondés</td><td>Texas A& M University</td><td>N/A</td><td>Modèle animal de choix pour la micro-injection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Hyclone Laboratories</td><td></td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Anti-souris conjugués à la fluorescéine IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-095-003</td><td>Pour anti-FLAG&nbsp ; 1:500</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FisherScientific</td><td>22-327379</td><td>Pour déplacer des objets et isolation</td></tr><tr><td>Capillaires en verre</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td>Micropipette en verre pour micro-injection (D.E. 1,0 mm, D.E. 0,75 mm, longueur 10 cm)</td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>L3000001</td><td>Pour la transfection</td></tr><tr><td>Extracteur manuel de micropipettes verticales</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td>Pour obtenir une micropipette en verre de la bonne taille</td></tr><tr><td>Tubes</td> <td>à microcentrifugerFisherScientific</td><td>02-682-004</td><td>Solution dissolvante</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td>Pour l’imagerie coloration</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>FisherScientific</td><td>03-448-254</td><td>Solution de mise en place</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Pico-Injector</td><td>Harvard Appareil</td><td>PLI-100</td><td>Pour l’administration précise de petits volumes de liquide à travers des micropipettes en appliquant une pression régulée pendant une période de temps définie numériquement</td></tr> lapin <tr><td>anti-poussin AQP0</td><td>Auto-généré-Jiang</td><td></td> <td>JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Clonage moléculaire et caractérisation fonctionnelle de la fibre du cristallin de poulet, connexine 45.6. Mol Biol Cellule. mars 1994 ; 5(3):363-73. DOI : 10.1091/MBC.5.3.363.</td></tr><tr><td>anticorps anti-FLAG de lapin</td><td>Rockland Immunichemicals</td><td>600-401-383</td><td>Pour la coloration FLAG</td></tr><tr><td>IgG de lapin conjuguée à la rhodamine&nbsp ;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-295-003</td><td>Pour anti-AQP0&nbsp ; 1:500</td></tr><tr><td>Tampon de serrage en éponge</td><td>Sutter Instruments</td><td>BX10</td><td>Pour le stockage de micropipette en verre</td></tr></tbody></table>

micro-injection d’un rétrovirus rcas(a) recombinant dans une lentille embryonnaire de poulet

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Le poulet embryonnaire (Gallus domesticus) est un modèle animal bien établi pour l’étude du développement et de la physiologie du cristallin, étant donné son haut degré de similitude avec le cristallin humain. Le RCAS(A) est un rétrovirus de poulet compétent pour la réplication qui infecte les cellules en division, ce qui constitue un outil puissant pour étudier l’expression et la fonction in situ des protéines de type sauvage et mutantes au cours du développement du cristallin par micro-injection dans la lumière vide de la vésicule du cristallin aux premiers stades du développement, limitant son action aux cellules proliférantes environnantes. Par rapport à d’autres approches, telles que les modèles transgéniques et les cultures ex vivo , l’utilisation d’un rétrovirus aviaire compétent pour la réplication RCAS(A) fournit un système très efficace, rapide et personnalisable pour exprimer des protéines exogènes dans les embryons de poussins. Plus précisément, le transfert ciblé de gènes peut être confiné aux cellules prolifératives de la fibre du cristallin sans avoir besoin de promoteurs spécifiques aux tissus. Dans cet article, nous allons brièvement passer en revue les étapes nécessaires à la préparation du RCAS(A) du rétrovirus recombinant, fournir un aperçu détaillé et complet de la procédure de micro-injection et fournir des exemples de résultats de la technique.

Après la détermination d’une ou de plusieurs protéines cibles spécifiques et l’identification de la ou des séquences de gènes associées, l’approche expérimentale globale implique le clonage de la ou des séquences de gènes en un vecteur RCAS(A) rétroviral par clonage initial dans un vecteur adaptateur, suivi d’un vecteur viral. Deuxièmement, les particules virales à haut titre sont préparées à l’aide de cellules d’emballage pour récolter et concentrer les virions. Ces deux premières grandes étapes ont été largement décrit...

Cet article de protocole décrit la méthodologie de micro-injection embryonnaire d’un rétrovirus RCAS(A) dans le cristallin de poulet en tant qu’outil pour étudier in situ la fonction et l’expression des protéines au cours du développement du cristallin.

Micro-injection d’un rétrovirus RCAS(A) recombinant dans une lentille embryonnaire de poulet

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...

La méthodologie présentée de micro-injection embryonnaire d’un rétrovirus RCAS dans un cristallin de poulet est conçue comme un outil pour étudier in situ la fonction et l’expression des protéines au cours du développement du cristallin. Comparé à d’autres approches, telles que les modèles transgéniques et les cultures ex vivo, le rétrovirus aviaire compétent pour la réplication RCAS fournit un système très efficace, rapide et personnalisable pour exprimer des protéines exogènes dans les embryons de poussins. Le transfert ciblé de gènes peut être confiné aux cellules prolifératives de la fibre du cristallin sans avoir besoin de promoteurs.Il existe un potentiel important pour l’utilisation de cette méthodologie pour étudier le développement du cristallin, la différenciation, la communication cellulaire et la progression de la maladie, ainsi que pour la découverte et le test de cibles thérapeutiques pour les conditions pathologiques du cristallin telles que la cataracte.

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Utiliser pointe fine micropipettes nous injectons ADN plasmidique dans les sous-domaines de somites de poulet ou de tubes neuraux. La concentration du plasmide est ajustée pour produire seule des cellules transfectées. Nous avons ensuite permettre aux cellules de se développer en des populations clonales.

La transfection seule cellule dans des embryons de poulet

L'objectif global de cette vidéo est de montrer comment effectuer l'injection ciblée de la rétine...

En électroporation Ovo dans la rétine de poussin embryonnaire

Cette technique chirurgicale illustre l'injection de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l'espace sous-rétinien de l'oeil de la souris.

Injection sous-rétinien de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l&#39;œil de la souris

Cultures embryonnaires de cellules rétiniennes chiches constituent des outils précieux pour l'étude de la biologie photorécepteur. Nous avons mis au point une technique de transfert de gène efficace sur la base de plasmide électroporation ex ovo de la rétine antérieure à la culture. Cette technique augmente considérablement les efficacités de transfection sur des protocoles actuellement disponibles, ce qui rend possible une manipulation génétique pour ce système.

Efficient Gene Transfer dans Chick rétines pour cellulaires primaires études sur la culture: Un Ex-ovo Approche d'électroporation

L’injection sous-rétinienne est une technique chirurgicale permettant une administration efficace de gènes à l’épithélium pigmentaire rétinien de l’œil de souris.  Nous décrivons ici une méthode simple et reproductible pour l’injection sous-rétinienne de vecteurs viraux dans l’épithélium pigmentaire rétinien chez des souris expérimentales.

Limbal injection Approche-sous-rétinienne de vecteurs viraux pour la thérapie génique chez la souris épithélium pigmentaire rétinien

Ce protocole décrit un procédé pour disséquer, expérimentalement et manipuler des explants de rétine entière de la culture d'embryons de poulet. Les cultures d'explants sont utiles lorsque le taux de réussite élevé, l'efficacité et la reproductibilité sont nécessaires pour tester les effets de plasmides pour l'électroporation et / ou des substances réactives, à savoir, les inhibiteurs enzymatiques.

Explants rétiniens entières de poulet embryons pour Traitements électroporation et réactif chimique

Nous présentons un protocole visant à démontrer un système de transfert de gène somatique utilisant RIP-Tag ; RIP-tva modèle de souris pour étudier la fonction des gènes à la métastase. Les rétrovirus aviaires sont livrés intracardiacally afin d’assurer le transfert de gènes en lésions précancéreuses et non invasives des cellules β pancréatiques chez la souris adulte.

Identification et caractérisation des facteurs métastatiques par transfert de gènes dans le RIP de roman-Tag ; RIP-tva modèle murin

Dans cette méthode, les tissus cardiaques embryonnaires sont chirurgicalement microdissected, dissocié, fluorescent étiquetés et implanté dans les tissus embryonnaires de l’hôte. Ceci fournit une plate-forme pour l’étude de l’organisation du développement niveau individuel ou de tissus dans des conditions hémodynamiques ectopiques, et/ou altération paracrine/juxtacrine environnements.

Microinjection-based System for In Vivo l’Implantation des Cardiomyocytes embryonnaires chez l’embryon aviaire

Nous décrivons une méthode pour obtenir des cultures primaires des photorécepteurs de cône de la rétine des embryons de poulet et son utilisation pour le criblage de contenu élevé.

Cultures enrichies en cônes de la rétine d’embryons de poulet pour étudier les interactions cellulaires entre tiges et cônes

Nous avons développé une nouvelle approche de perte de fonction qui implique l’introduction et l’intégration génomique de séquences artificielles de micro-ARN dans des embryons de poussins en utilisant l’électroporation in ovo et le système de transposon Tol2. Cette technique fournit une méthodologie robuste et stable pour l’étude de la fonction des gènes au cours du développement.

Approche de perte de fonction dans la rétine embryonnaire du poussin en utilisant l’expression transgénique médiée par le transposon Tol2 de microARN artificiels

L’objectif global de cet article est de décrire comment effectuer une injection intracellulaire ovo de matériaux exogènes dans des embryons de poulet. Cette approche est très utile pour étudier la biologie du développement des embryons de poulet.

À Ovo Injection intravasculaire dans des embryons de poulet

Découvrez la micro-injection de rétrovirus RCAS(A) dans la lentille embryonnaire de poulet pour étudier l'expression protéique in situ. Cette méthode rapide et personnalisable permet d'explorer le développement du cristallin et les cibles thérapeutiques.

Micro-injection d’un rétrovirus RCAS(A) recombinant dans une lentille embryonnaire de poulet

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