Split Retina en tant que préparation améliorée à montage plat pour l’étude des neurones de la couche nucléaire interne dans la rétine des vertébrés
16 janvier 2024
Ce travail présente une préparation alternative de rétine à montage plat dans laquelle l’ablation des corps cellulaires photorécepteurs permet une diffusion plus rapide des anticorps et un meilleur accès des pipettes patch aux neurones rétiniens internes pour l’immunohistochimie, l’hybridation in situ et les expériences d’électrophysiologie.
Notre groupe s’intéresse aux circuits neuronaux et aux mécanismes synaptiques sous-jacents au traitement visuel dans la rétine. Le laboratoire Morgans étudie les mécanismes moléculaires de l’adaptation à la lumière dans les cellules bipolaires, et le laboratoire Sivyer s’intéresse à la façon dont les neurones rétiniens internes contribuent à la fonction des cellules ganglionnaires. L’accès aux neurones de la couche internucléaire dans l’ensemble de la rétine est un défi pour les études anatomiques et physiologiques.
Les neurones de la couche internucléaire sont accessibles dans des sections verticales, mais ils sont très peu nombreux dans le champ de vision. De plus, le tranchage coupe les processus latéraux et les connexions, ce qui peut avoir un impact sur les études physiologiques. L’élimination des photorécepteurs dans la technique de la rétine fendue améliore considérablement la diffusion des anticorps dans la rétine interne, ce qui rend l’immunomarquage des cibles rétiniennes internes plus de 20 fois plus rapide par rapport à la rétine traditionnelle à montage complet.
La rétine fendue améliore également considérablement l’accès aux neurones de la couche internucléaire lors de l’électrophysiologie par patch clamp. La technique de la rétine fendue ouvrira la voie à de nouvelles approches et accélérera le rythme de nos expériences. Par exemple, nous prévoyons d’utiliser cette technique pour étudier les entrées des cellules bipolaires dans les cellules ganglionnaires de la mélanopsine en exprimant la channelrhodopsine dans les cellules bipolaires.
Aperçu
Cette étude présente une nouvelle préparation de la rétine en montage plat qui améliore la diffusion des anticorps et facilite un meilleur accès aux neurones rétiniens internes. Cette technique améliore considérablement l'efficacité des expériences d'immunohistochimie, d'hybridation in situ et d'électrophysiologie.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie rétinienne
- Électrophysiologie
Contexte
- Le laboratoire Morgans étudie les mécanismes d'adaptation à la lumière dans les cellules bipolaires.
- Le laboratoire Sivyer se concentre sur les neurones de la rétine interne et leur rôle dans la fonction des cellules ganglionnaires.
- Les techniques traditionnelles de montage entier posent des difficultés pour l'étude des neurones de la couche nucléaire interne.
- La suppression des photorécepteurs permet un meilleur accès et réduit le temps de marquage immunohistochimique.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode permettant un accès plus rapide aux neurones de la rétine interne.
- Améliorer l'efficacité des expériences d'immunomarquage et d'électrophysiologie.
- Approfondir l'étude des entrées des cellules bipolaires sur les cellules ganglionnaires mélanopsines.
Méthodes utilisées
- Une technique de dissection rétinienne ex vivo a été utilisée pour préparer la rétine en montage plat.
- Le modèle biologique consistait à disséquer la rétine d'yeux de souris, permettant ainsi d'accéder aux neurones de la couche nucléaire interne.
- Des techniques d'immunofluorescence et d'électrophysiologie ont été utilisées pour l'analyse.
- Les étapes critiques comprenaient une dissection minutieuse, des lavages dans le PBS et un transfert vers un milieu Ames carbogéné.
- La diffusion des anticorps a été évaluée après une incubation d'une heure.
Résultats principaux
- La nouvelle technique a permis une diffusion des anticorps plus de 20 fois plus rapide que les méthodes conventionnelles.
- L'intégrité synaptique des photorécepteurs a été préservée durant le processus de préparation.
- Une variabilité régionale de la viabilité cellulaire a été observée après le fractionnement, la majorité des cellules rétiniennes restant viables.
- Les résultats d'immunofluorescence ont confirmé le maintien des terminaisons synaptiques des photorécepteurs.
Conclusions
- Cette méthode permet un accès plus aisé aux neurones de la rétine interne pour diverses approches expérimentales.
- Elle améliore la rapidité et l'efficacité des études d'immunomarquage et des études physiologiques.
- Les résultats pourraient avoir des implications pour des investigations ultérieures sur les mécanismes neuronaux dans la rétine.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
L'accès efficace aux neurones de la couche nucléaire interne est essentiel pour réduire les risques liés aux cibles ophtalmologiques en phase précoce et valider des hypothèses mécanistiques dans la découverte de médicaments pour la rétine. La préparation de monture plate de rétine séparée accélère l'immunomarquage quantitatif et l'exploration électrophysiologique, renforçant la fiabilité prédictive de l'analyse des voies neuronales. Cette capacité améliore le tri des portefeuilles de projets et oriente la continuité translationnelle des programmes de recherche sur la vision.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'interrogation directe des circuits des cellules bipolaires et horizontales pour une détection mécanistique des risques.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles en préservant les connexions neuronales latérales.
- Facilite le test rapide d'hypothèses sur les mécanismes synaptiques impliqués dans le traitement visuel.
Développement de criblages et de tests
- Offre un système biologique validé pour les immunomarquages et les essais de patch-clamp à haut débit.
- Améliore la reproductibilité des essais en préservant l'intégrité synaptique et la viabilité cellulaire.
- Fournit des résultats quantitatifs pour l'analyse des effets de composés sur les neurones de la rétine interne.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des modèles pertinents pour la maladie afin d'étudier les circuits rétiniens impliqués dans les troubles de la vision.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en soutenant plusieurs modalités analytiques.
- Réduit le risque de résultats artéfactuels en préservant la connectivité physiologique dans le modèle tissulaire.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette préparation fait le lien entre la découverte précoce et la recherche préclinique en permettant des analyses fonctionnelles et moléculaires rigoureuses des neurones de la rétine interne.
- Biologie de la découverte : Accélère le test d'hypothèses sur les voies neuronales et les mécanismes synaptiques.
- Criblage : Permet des lectures immunohistochimiques et électrophysiologiques rapides et reproductibles.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de la diffusion des anticorps et de la viabilité cellulaire pour des études comparatives.
- Recherche translationnelle : Préserve des circuits pertinents pour la maladie afin d'étudier des biomarqueurs et des mécanismes.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme réutilisable pour diverses applications de recherche et de criblage sur la rétine.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles rétiniennes.
- Valeur opérationnelle : Standardise la préparation pour des flux de travail reproductibles et évolutifs entre les équipes.
- Valeur stratégique : Permet des décisions plus rapides d'aller/arrêt et une progression efficiente en capital des actifs de recherche sur la vision.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des cibles et modalités rétiniennes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en dissection rétinienne et en manipulation des tissus pour des résultats optimaux.
- Requiert un accès à des instruments d'électrophysiologie et d'immunofluorescence.
- Exige une standardisation entre équipes pour assurer la reproductibilité dans les études multicentriques.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les espèces ou les modèles de maladie.
- La variabilité régionale de la viabilité cellulaire doit être surveillée pendant la mise en œuvre.
