Name: Technique de poly-transfection inverse optimisée à base de cellules souches embryonnaires de souris pour l’exploration rapide des ratios d’acides nucléiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Découvrez la poly-transfection inverse optimisée pour cellules souches embryonnaires de souris en milieu 2i/LIF. Cette méthode améliore la viabilité cellulaire et l'efficacité de transfection tout en permettant l'optimisation rapide des ratios d'acides nucléiques.

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Les auteurs tiennent à remercier les nombreuses contributions au domaine qui n’ont pas été citées dans ce travail en raison du manque d’espace, ainsi que les organismes de financement qui ont offert cette opportunité. Les auteurs remercient le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) et les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) qui ont appuyé ces travaux. K.M. est récipiendaire d’une bourse de BESC-M du CRSNG et d’une bourse de doctorat Killam de l’Université de la Colombie-Britannique. N.S. est le récipiendaire d’une bourse Michael Smith Health Research BC Scholar.

1. Préparation des réactifs pour la culture mPSC
<ol><li>Préparez le supplément de N2.<ol><li>Dans des conditions non stériles, préparer les solutions mères suivantes (étape 1.1.1.1) dans une hotte de sécurité chimique. Ajouter la poudre solide de chaque produit chimique dans un tube conique prépesé de 50 ml. Pesez chaque tube après avoir ajouté la poudre et ajoutez une quantité appropriée de solvant pour atteindre les concentrations ci-dessous. Pour un lot de médias, préparez la quantité minimale indiquée. REMARQUE : Les réactifs suivants sont dangereux et doivent être manipulés conformément aux directives locales de sécurité chimique. Assurez-vous d’avoir un EPI approprié lors de la manipulation et ne travaillez qu’avec les formes de poudre solide de ces produits chimiques dans une hotte chimique pour éviter l’inhalation.<ol><li>Minimum de 0,05 mL de sélénite de sodium dans l’eau à 0,518 mg/mL, 0,5 mL de putrescine dans l’eau à 160 mg/mL, 0,165 mL de progestérone dans de l’éthanol à 100 % à 0,6 mg/mL (voir le tableau des matières).</li>
			<li>Conservez les solutions à -20 °C jusqu’à 2 ans.</li>
		</ol></li>
		<li>Dans une enceinte de biosécurité (ESB), ajouter ce qui suit à 58,035 mL de DMEM-F12.<ol><li>0,05 mL d’une solution de sélénite de sodium à 0,518 mg/mL, 0,5 mL d’une solution de putrescine à 160 mg/mL, 0,165 mL d’une solution de progestérone à 0,6 mg/mL.</li>
			<li>Filtrez stériliser le mélange ci-dessus avec un filtre de 0,22 μm.</li>
		</ol></li>
		<li>Toujours dans le BSC, préparer une solution d’apotransferrine à 100 mg/mL.<ol><li>Ajouter 5 mL de DMEM-F12 à 500 mg d’apotransferrine (voir le tableau des matières). Remettez lentement en suspension et lavez le récipient en évitant les bulles.</li>
			<li>Après avoir remis en suspension et retiré autant que possible avec 5 ml, ajoutez-le à la solution de sélénite/putrescine/progestérone. Prenez plus de la solution précédente et lavez le flacon d’apotransferrine en en sortant le plus possible.</li>
		</ol></li>
		<li>Ajouter 5 mL de BSA à 7,5 % fraction V (voir le tableau des matériaux) à la solution.</li>
		<li>Mélanger et aliquote 6,875 mL par tube. Conserver les aliquotes à -80 °C jusqu’à 1 an.</li>
		<li>Lorsque vous utilisez les aliquotes N2 ci-dessus pour fabriquer un milieu N2B27, décongelez l’aliquote désirée et ajoutez 3,125 mL d’une solution d’insuline à 4 mg/mL (voir le tableau des matières) à la N2 6,875 pour 10 mL de 100x N2.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez le milieu de base N2B27.<ol><li>Décongeler les suppléments de N2 et de B27 dans un réfrigérateur à 4 °C pendant quelques heures ou toute la nuit.</li>
		<li>Dans un BSC, mélanger 484,5 mL de DMEM-F12 et 484,5 mL de milieu neurobasal (voir le tableau des matières) dans un flacon stérile de 1 L.</li>
		<li>Ajouter 10 mL de supplément de B27 et 10 mL de supplément de N2 dans le milieu.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de bêta-mercaptoéthanol 55 mM (voir le tableau des matières). Ajouter 10 mL de glutamax 100x. Mélangez vigoureusement en remuant la bouteille.</li>
		<li>Aliquote le volume souhaité par aliquote (généralement 100 mL) et conserver à -80 °C jusqu’à 1 an. Conserver après décongélation à 4 °C jusqu’à 3 semaines.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez les médias NBiL.<ol><li>Décongeler une aliquote de 100 mL de milieu de base N2B27 à -80 °C au réfrigérateur à 4 °C.</li>
		<li>Dans une ESB, ajouter le LIF (voir le Tableau des matières) à une concentration finale de 10 μg/L.</li>
		<li>Ajouter CHIR99021 (3 μM final) et PD0325901 (1 μM final) (voir le tableau des matériaux). Bien mélanger avec une pipette sérologique de 50 ml. Conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez une solution de gélatine à 0,2 %.<ol><li>Transvaser 500 mL de H2O à double distillation dans une bouteille en verre de 1 L.</li>
		<li>Mesurez 1 g de gélatine (voir tableau des matériaux) et ajoutez-la à l’eau. Mélanger en secouant le flacon jusqu’à dissolution quasi totale.</li>
		<li>Autoclaver le mélange gélatine et eau à 15 psi, 121 °C pendant 35 min. Une fois refroidi, filtrez-le stériliser avec un filtre de 0,22 μm dans un BSC. Conserver à 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez le produit de lavage.<ol><li>Dans une ESB, mélanger 160 μL de BSA à 7,5 % par 10 mL de DMEM-F12.</li>
		<li>Mettez à l’échelle ce qui précède et préparez en grande quantité pour faciliter l’utilisation future (par exemple, 8 mL de BSA à 7,5 % pour 500 mL de DMEM-F12). Conserver à 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Préparation de réactifs pour la poly-transfection mPSC
REMARQUE : Les valeurs suivantes sont fournies pour un seul puits d’une plaque de 24 puits. Les valeurs peuvent être mises à l’échelle en conséquence. Les séquences de tous les ADN/plasmides sont détaillées dans le fichier supplémentaire 1.
<ol><li>Calculez le volume de solution d’ADN nécessaire par traitement.<ol><li>Préparez 500 ng d’ADN par puits/condition.<ol><li>Si vous transfectez un seul plasmide avec une solution d’ADN de 100 ng/μL, préparez un tube avec 5 μL d’ADN.</li>
			<li>Si vous transfectez deux plasmides à 100 ng/μL chacun, préparez deux tubes de 2,5 μL chacun, un pour chaque plasmide.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Pour chaque traitement de transfection de 500 ng (voir le tableau des matériaux), aliquote 25 μL d’OptiMEM dans un tube de 1,5 mL.<ol><li>Pour l’exemple ci-dessus, préparez deux tubes, chacun contenant 250 ng d’ADN (2,5 μL) et 12,5 μL d’OptiMEM.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajoutez le volume d’ADN requis pour ce traitement à l’OptiMEM dans le tube.</li>
	<li>Pour chaque tube contenant 500 ng d’ADN et OptiMEM, créez un tube correspondant avec 25 μL supplémentaires d’OptiMEM et 1 μL de réactif de transfection à base de lipides cationiques.<ol><li>Encore une fois, ces valeurs doivent être mises à l’échelle en conséquence. Pour l’exemple ci-dessus, préparez deux tubes, chacun contenant 12,5 μL d’OptiMEM et 0,5 μL de réactif de transfection. REMARQUE : Lors de la mise à l’échelle des valeurs, utilisez la masse d’ADN ajoutée, et non le volume requis pour cette quantité d’ADN. Les réactions avec le réactif de transfection et l’ADN peuvent être mises à l’échelle (par exemple, si 5 puits doivent être transfectés avec le même ADN). Gardez les mêmes ratios de réactifs, mais adaptez-les en conséquence (par exemple, 1000 ng d’ADN : 50 μL OptiMEM : 2 μL réactif de transfection : 50 μL OptiMEM).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Préparation des CSPm pour la transfection
REMARQUE : Pour la transfection inverse, préparez le récipient de culture et faites passer les mPSC directement avant d’ajouter les réactifs de transfection. Pour la transfection vers l’avant, le passage et la plaque des cellules 12 à 18 h avant la transfection pour permettre aux cellules d’adhérer à la plaque.
<ol><li>Préparez un récipient de culture cellulaire recouvert de gélatine à 0,2 %.<ol><li>Planifier le nombre de puits nécessaires à la transfection (un puits d’une plaque de 24 puits par traitement/groupe).</li>
		<li>Ajouter 200 μL de la solution de gélatine à 0,2 % dans chacun des puits désirés dans la plaque à 24 puits.</li>
		<li>Secouez doucement la plaque pour répartir uniformément la solution, en vous assurant qu’elle couvre tout le fond du puits.</li>
		<li>Laisser les puits s’enrober pendant au moins 15 min à température ambiante.</li>
		<li>À l’aide d’un aspirateur sous vide, retirez soigneusement les restes de gélatine des puits (inclinez la plaque pour assurer l’élimination de tout liquide sans gratter la couche de gélatine).</li>
		<li>Ajouter 0,5 mL de milieu NBiL (étape 1.3) dans chaque puits et laisser la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pour préchauffer.</li>
	</ol></li>
	<li>Passage mPSC.<ol><li>Aliquote 30 mL de produit de lavage (étape 1.5) dans un tube conique de 50 mL.</li>
		<li>Aspirer l’ancien milieu de la boîte de culture tissulaire des CSEm. REMARQUE : Plusieurs techniques d’aspiration sont permises. Quelle que soit la technique choisie, veillez à ce que les cellules ne restent pas sèches pendant de longues périodes (environ 30 s maximum).</li>
		<li>Ajouter la quantité requise de milieu de décollement cellulaire disponible dans le commerce (1,5 mL pour une boîte de 10 cm, échelle en conséquence, voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Attendez 3 à 5 minutes avant de pipeter de haut en bas 15 à 20 fois avec une pipette P1000 pour obtenir une suspension unicellulaire. Visualisez les cellules au microscope pour assurer une suspension unicellulaire.</li>
		<li>Transférez les cellules du milieu de détachage dans le tube de 50 mL contenant le produit de lavage.</li>
		<li>Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirez le produit de lavage, en veillant à ce qu’il ne reste aucun liquide résiduel dans le tube.</li>
		<li>Remettre la pastille en suspension dans un petit volume de produit de lavage (~300 μL). Comptez la suspension cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre pour obtenir la densité cellulaire.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Transfection inverse des mPSC
<ol><li>Préparez les réactifs de poly-transfection selon l’étape 2.</li>
	<li>Préparez le récipient de culture cellulaire et les mPSC de passage conformément à l’étape 3.</li>
	<li>Aliquote 200 μL de milieu NBiL dans des tubes de 1,5 mL, un pour chaque traitement.</li>
	<li>Ajouter 26 μL du mélange de réactifs OptiMEM :transfection au mélange ADN :OptiMEM. Mélangez les réactifs rapidement et vigoureusement en pipetant environ 10 fois. Laisser incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min.</li>
	<li>En fonction de la densité cellulaire, transférez le volume requis de cellules de la suspension cellulaire de 300 μL aux tubes NBiL de 200 μL pour obtenir 25 000 cellules par tube.</li>
	<li>Après 5 min d’incubation de la lipofectamine 2000 (L2K, réactif de transfection) et du mélange d’ADN, ajoutez-le dans le tube de 1,5 mL de cellules et mélangez bien par pipetage. Laissez les cellules incuber avec le réactif pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. Pipeter le liquide en laissant environ 50 μL.</li>
	<li>Remettre la pastille en suspension avec 100 μL de milieu NBiL. Transférez les cellules sur la plaque et placez la plaque dans l’incubateur. Changez de média 24 h plus tard avec un média NBiL frais.</li>
</ol>5. Transfection directe des mPSC
<ol><li>12 à 18 h avant la transfection, préparer le récipient de culture cellulaire et les CSPm de passage conformément à l’étape 3.</li>
	<li>En fonction de la densité cellulaire, transférez le volume requis de cellules du mélange de cellules de 300 μL pour ensemencer 25 000 cellules par puits. Placez la plaque dans l’incubateur.</li>
	<li>1 h avant la transfection, aspirer le média de tous les puits et le remplacer par 0,5 mL de média NBiL. Placez la plaque dans l’incubateur.</li>
	<li>Au moment de la transfection, préparer les réactifs de poly-transfection mPSC selon l’étape 2.</li>
	<li>Ajouter 26 μL du mélange de réactifs OptiMEM :transfection au mélange ADN :OptiMEM. Mélangez les réactifs rapidement et vigoureusement en pipetant environ 10 fois. Laisser incuber le mélange combiné à température ambiante pendant 5 min.</li>
	<li>Ajouter le mélange combiné dans les puits goutte à goutte. Placez la plaque dans l’incubateur. Changez de support 24 h plus tard.</li>
</ol>6. Cytométrie en flux
<ol><li>Aspirer le fluide de la plaque transfectée à 24 puits 48 h après la transfection.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de trypsine dans chaque puits, agiter et incuber pendant 30 s à 37 °C. Tapotez les côtés de la plaque et ajoutez 200 μL de tampon FACS glacé (2 % FBS dans PBS).</li>
	<li>Ouvrez et étiquetez une plaque à fond en V de 96 puits, en commençant par A1. Mélangez le contenu de chaque puits sur la plaque transfectée pour déloger les cellules et préparer des solutions unicellulaires avec une pipette P200. Transférer 200 μL de chaque puits au puits approprié sur la plaque de 96 puits.</li>
	<li>Ajouter 15 mL de tampon FACS dans un réservoir de réactif de 50 mL. Centrifuger la plaque à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. Jetez le surnageant en inversant la plaque à 96 puits dans l’évier d’un mouvement rapide et fluide.</li>
	<li>Utilisez une pipette multicanaux pour remettre les pastilles en suspension sur la plaque à 96 puits dans 150 μL de tampon FACS du réservoir de réactif. Répétez deux fois les étapes 6.4-6.5. Placez la plaque de 96 puits dans une boîte remplie de glace à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Passez les échantillons dans un cytomètre en flux pour obtenir les distributions de population des rapporteurs fluorescents.<ol><li>S’assurer que le cytomètre est approprié en termes de combinaisons laser et filtre pour l’expérience à réaliser (p. ex., ne pas utiliser de rapporteur infrarouge s’il n’est pas possible d’exciter ou de détecter dans le spectre rouge lointain).</li>
		<li>Inclure des échantillons supplémentaires pour les billes de normalisation afin de permettre la conversion MEFL des données pendant l’analyse. S’assurer qu’un nombre suffisant de cellules sont prélevées par échantillon pour une analyse statistique appropriée9.</li>
	</ol></li>
	<li>Convertissez les unités fluorescentes à partir des fichiers de cytomètres bruts et analysez les données à l’aide de plusieurs méthodes, telles que des pipelines basés sur Python ou MATLAB ou des logiciels disponibles dans le commerce 9,13.</li>
</ol>

Analyse comparative des méthodes de transfection directe et inverse sur les mPSC

<ol><li>Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-aware+synthetic+biology+by+controller+design%3A+Engineering+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell.</a> Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).</li>
<li>Fus-Kujawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+methods+and+tools+for+transfection+of+eukaryotic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).</li>
<li>FAU, K. T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+protocols+for+mouse+embryonic+stem+cell+culturing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing.</a> PLoS One. 8 (12), 81156(2013).</li>
<li>Morgani, S., Nichols, J., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+pluripotency%3A+in+vitro+adaptations+of+a+continuum+of+in+vivo+states%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The many faces of pluripotency: in vitro adaptations of a continuum of in vivo states.</a> BMC Developmental Biology. 17 (1), (2017).</li>
<li>Mulas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+propagation+and+manipulation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells.</a> Development. 146 (6), Cambridge, England. 173146(2019).</li>
<li>Tamm, C., Kadekar, S., Pijuan-Galitó, S., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+efficient+transfection+of+mouse+embryonic+stem+cells+using+non-viral+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast and efficient transfection of mouse embryonic stem cells using non-viral reagents.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 584-591 (2016).</li>
<li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+types%2C+methods+and+strategies%3A+A+technical+review%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> PeerJ. 9, 11165(2021).</li>
<li>Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bpoly-transfection%26%2334%3B+method+for+rapid%2C+one-pot+characterization+and+optimization+of+genetic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A &#34;poly-transfection&#34; method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems.</a> Nucleic Acids Research. 47 (18), 106(2019).</li>
<li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endoribonuclease-based+feedforward+controller+for+decoupling+resource-limited+genetic+modules+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 5690(2020).</li>
<li>Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+development+of+cell+state+identification+circuits+with+poly-transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (192), e64793(2023).</li>
<li>Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+extract+based+optimization+of+biomolecular+circuits+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).</li>
<li>Teague, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoflow%3A+A+python+toolbox+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cytoflow: A python toolbox for flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+constitutive+promoters+and+the+doxycycline-inducible+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter.</a> PLoS One. 5 (5), 0010611(2010).</li>
</ol>

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.

L’une des principales raisons de l’adoption généralisée des protocoles de transfection est leur reproductibilité et leur accessibilité ; cependant, ces protocoles nécessitent une optimisation dans des contextes expérimentaux. Les tests standard requis lors de la première tentative de transfectation d’une nouvelle lignée cellulaire ne sont pas mentionnés ci-dessus. Tout d’abord, le choix du réactif de transfection est essentiel, car les réactifs disponibles dans le commerce ne sont pas universels et l’efficacité de la via...

L’administration d’ADN et d’ARN dans les cellules de mammifères constitue un pilier central de la recherche biomédicale1. Une méthode courante pour introduire des acides nucléiques exogènes (NA) dans les cellules de mammifères est la transfection transitoire 2,3. Cette technique repose sur le mélange de NA avec des réactifs de transfection disponibles dans le commerce capables de les délivrer dans les cellules réceptrices. En règle générale, l’AN est délivré par transfection directe, où les cellules adhérant à une surface bidimensionnelle reçoivent le complexe de transfection. Bien que la transfection directe pour les lignées cellulaires établies les plus courantes soit robuste et que les protocoles soient bien publiés, les types de cellules plus spécialisés avec des morphologies non monocouches ne transfectent pas facilement, ce qui limite la quantité d’AN qui peut être délivrée et le nombre de cellules qui la reçoivent.
Les cellules souches pluripotentes (CSP) constituent un modèle attrayant pour comprendre le développement et un outil pour la médecine régénérative, étant donné leur capacité à se diviser indéfiniment et à produire n’importe quel type de cellules corporelles. Pour les CSP de souris (CSPm), les conditions de culture in vitro de routine avec 2 inhibiteurs et LIF (2i/LIF) maintiennent une morphologie de colonie en forme de dôme, limitant directement le nombre de cellules exposées à une transfection vers l’avant 4,5,6. Pour résoudre ce problème, une transfection inverse peut être effectuée : les cellules sont ajoutées à une boîte contenant un milieu et un réactif de transfection, plutôt que d’ajouter du réactif de transfection aux cellules adhérentes7. Bien que cela augmente le nombre de cellules exposées au réactif, cela nécessite également que les cellules soient traversées et transfectées simultanément.
Au-delà des simples transfections d’une seule NA, les chercheurs visent souvent à introduire plusieurs constructions d’AN dans une population de cellules in vitro. Ceci est généralement réalisé par une co-transfection, où les AN sont mélangés à un rapport donné (1:1, 9:1, etc.) et sont ensuite combinés avec le réactif de transfectionchoisi 8. Cela donne un mélange d’AN et de réactif qui préserve le rapport d’origine des AN les uns par rapport aux autres - bien que les cellules du traitement puissent recevoir des quantités différentes de ce mélange, elles reçoivent toutes le même rapport9. Bien que cela soit avantageux lorsque le rapport souhaité de pièces est connu, déterminer ce rapport à l’avance peut demander beaucoup de travail, chaque rapport constituant une condition différente. Une alternative consiste à effectuer une « poly-transfection », où les AN individuels sont mélangés avec le réactif de transfection indépendamment les uns des autres9. En combinant des complexes de transfection contenant des AN individuels (plutôt que de combiner des AN avant de créer les complexes), les chercheurs peuvent explorer un large éventail de stœchiométries d’AN en une seule expérience de transfection9. Ceci est particulièrement utile dans les cas où les produits de plusieurs NA sont censés interagir les uns avec les autres, comme avec des systèmes de transcription inductibles ou des systèmes avec rétroaction intégrée en 1,10,11. Cependant, pour le faire efficacement, une efficacité de transfection élevée est nécessaire. En effet, à mesure que le nombre d’AN transfectés uniques augmente, la probabilité qu’une cellule donnée reçoive tous les AN souhaités diminue de façon exponentielle 9,12.
Le rapport suivant décrit un protocole de transfection inverse pour les CSPm utilisant un réactif de transfection à base de lipides cationiques, dans lequel les cellules sont exposées au mélange réactif-NA pendant un maximum de 5 minutes pour maximiser la viabilité et minimiser le temps en dehors des conditions de culture typiques. La comparaison de ce protocole à la transfection directe standard de ces cellules démontre une efficacité de transfection plus élevée et une augmentation du nombre total de cellules transfectées survivantes. En combinant cette transfection inverse avec une poly-transfection à trois plasmides impliquant de simples rapporteurs fluorescents, un potentiel élargi de criblage des rapports NA avec une efficacité de transfection élevée est démontré.

<table><tbody><tr><td>Accutase&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Apotransferrine&nbsp ;</td><td>Supplément MilliporeSigma</td><td>T1147-500MG</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>Bêta-mercaptoéthanol</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>21985023</tr><tr><td>BSA fraction V (7,5 %)</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma</td><td>SML1046-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>MilliporeSigma</td><td>D6421-24X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Billes de standardisation par cytométrie en flux</td><td>Spherotech</td><td>URCP-38-2K</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX supplément&nbsp ;</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>35050061</tr><tr><td>Insuline&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>12585-0014</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>OptiMEM&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma</td><td>PZ0162-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Progestérone</td><td>MilliporeSigma</td><td>P8783</td><td>Risque chimique - consultez les directives de sécurité locales, assurez-vous qu’un EPI approprié est porté et travaillez avec la forme de poudre solide uniquement dans une hotte</td></tr> chimique <tr><td>Putrescine</td><td>MilliporeSigma</td><td>P6780</td><td>Risque chimique - consultez les directives de sécurité locales, assurez-vous qu’un EPI approprié est porté et travaillez avec la forme de poudre solide uniquement dans une hotte chimique</td></tr><tr><td>mLIFm recombinant&nbsp ;</td><td>BioTechne</td><td>8878-LF-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Sélénite de sodium&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma</td><td>S5261-25G</td><td>Risque chimique - consultez les directives de sécurité locales, assurez-vous qu’un EPI approprié est porté et travaillez avec la forme de poudre solide uniquement dans une hotte chimique</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>25200056</tr></tbody></table>

technique de poly-transfection inverse optimisée à base de cellules souches embryonnaires de souris pour l’exploration rapide des ratios d’acides nucléiques

An Optimized Mouse Embryonic Stem Cell Based Reverse Poly-Transfection Technique for Rapid Exploration of Nucleic Acid Ratios

En raison de sa relative simplicité et de sa facilité d’utilisation, la transfection transitoire de lignées cellulaires de mammifères avec des acides nucléiques est devenue un pilier de la recherche biomédicale. Bien que la plupart des lignées cellulaires largement utilisées aient des protocoles robustes pour la transfection en culture bidimensionnelle adhérente, ces protocoles ne se traduisent souvent pas bien pour les lignées moins étudiées ou celles dont la morphologie est atypique et difficile à transfecter. En utilisant des cellules souches pluripotentes de souris cultivées dans un milieu 2i/LIF, un modèle de culture largement utilisé pour la médecine régénérative, cette méthode décrit un protocole de transfection inverse optimisé et rapide capable d’atteindre une plus grande efficacité de transfection. En s’appuyant sur ce protocole, une poly-transfection à trois plasmides est effectuée, tirant parti de l’efficacité supérieure à la normale dans l’administration des plasmides pour étudier une gamme élargie de stœchiométrie plasmidique. Ce protocole de poly-transfection inverse permet une méthode expérimentale en un seul pot, permettant aux utilisateurs d’optimiser les rapports plasmidiques dans un seul puits, plutôt que sur plusieurs co-transfections. En facilitant l’exploration rapide de l’effet de la stœchiométrie de l’ADN sur la fonction globale des circuits génétiques délivrés, ce protocole minimise le temps et le coût de la transfection de cellules souches embryonnaires.

Les transfections directes et inverses reposent sur l’interaction entre la membrane cellulaire et les complexes réactif de transfection entrants-ADN, permettant l’administration de NA aux cellules réceptrices. Là où ces techniques diffèrent, c’est l’état de la cellule lors de l’administration - alors que l’ADN est généralement délivré à des monocouches cellulaires adhérentes dans la transfection directe traditionnelle, la transfection inverse repose plutôt sur la rencontre du complexe réactif-ADN avec les cellules dans u...

Le présent protocole décrit une méthode de poly-transfection inverse de cellules souches embryonnaires de souris pendant la culture avec des milieux 2i et LIF. Cette méthode offre une viabilité et une efficacité supérieures à celles des protocoles de transfection directe traditionnels, tout en permettant une optimisation des rapports plasmidiques en un seul pot.

Technique de poly-transfection inverse optimisée à base de cellules souches embryonnaires de souris pour l’exploration rapide des ratios d’acides nucléiques

Due to its relative simplicity and ease of use, transient transfection of mammalian cell lines with nucleic acids has become a mainstay in biomedical ...

Notre travail se concentre généralement sur l’utilisation de dispositifs génétiques synthétiques pour manipuler le destin et le comportement des cellules souches. En contrôlant les états cellulaires, nous visons à faire progresser le développement de thérapies cellulaires de nouvelle génération. Récemment, une compréhension plus approfondie de la relation entre le dosage d’un gène déterminant le destin et la lignée cellulaire a été établie.Cela a été facilité par le développement de contrôleurs génétiques capables de titrer un gène donné avec précision. Les techniques classiques de biologie moléculaire telles que la transfection ou la transduction lentivirale pour la surexpression de gènes simples seront toujours un pilier. Cependant, notre domaine a récemment adopté des dispositifs synthétiques qui intègrent une rétroaction linéaire et non linéaire afin d’obtenir des résultats plus complexes à partir de l’ADN délivré.Le dosage des gènes joue un rôle clé dans la détermination du résultat de l’expression des gènes. Lors de l’administration de plusieurs gènes exogènes, un facteur expérimental clé est la quantité de chaque gène qui donnera le résultat optimal ou souhaité. Notre protocole permet aux chercheurs de scanner rapidement les dosages en un seul traitement, à la recherche du rapport souhaité de dispositifs ADN.

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Developmental Biology

Biologie du développement

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